br>[0036]
[0037] 反应条件为:95°C 预变性 3min;95°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 40sec， 30个循环;72 °C延伸IOmin; 16 °C结束。
[0038] 把PCR产物经NdeIJhoI双酶切后，连接至经NdeIJhoI双酶切的祀T-30a( + )载体， 并转化大肠杆菌D册a感受态细胞。转化后的D册a涂含有卡那霉素的LB平板进行筛选，37°C 培养12h，挑取单菌落接种至3mL含有卡那霉素的LB液体培养基，37°C摇床培养12h，做菌液 PCR鉴定后，抽取质粒用NdeI、XhoI双酶切鉴定，并进行测序，测序正确的重组载体命名为 pET-30a-cGH〇
[0039] W上述祀T-30a-cGH重组载体为模板，用P3、P4引物进行PCR扩增。
[0040] PCR 体系：
[0041]
[0042]
[0043] 反应条件为:95°C 预变性 3min;95°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 40sec， 30个循环;72 °C延伸IOmin; 16 °C结束。
[0044] 把PCR产物经6。〇1?1、齡《双酶切后，连接至经6(3〇1?1、齡《双酶切的9?1〔91(载体(所 用PPIC9K载体购自赛默飞世尔科技，货号:K1750-01)，并转化大肠杆菌D册a感受态细胞。转 化后的D册a涂含有氨节的LB平板进行筛选，37°C培养12h，挑取单菌落接种至3mL含有氨节 的LB液体培养基，37 °C摇床培养12h，做菌液PCR鉴定后，抽取质粒用EcoRKNotI双酶切鉴 定，并进行测序W确定正确构建载体，测序正确的重组表达载体命名为pPIC9K-cGH(图1)。
[0045] 3、构建GS115-pPIC9K-cGH转基因重组酵母菌株
[0046] 将上述构建好的pPIC9K-cGH重组表达载体用SacI线性化，将IOug线性化的质粒和 80化毕赤酵母GSl 15感受态细胞混合，经1500V，6ms电转之后涂MD平板，28°C培养箱培养3-5 天长出转化子。将所有转化子用无菌去离子水洗下涂含有不同浓度G418的YTO平板，28°C培 养箱培养3-5天，筛选高拷贝数的转化子。采取煮-冻-煮法提取转化子基因组，做PCR鉴定， 鉴定正确的高拷贝转化子命名为GS115-pPIC9K-cGH(图2)。
[0047] 实施例2:鸡生长激素重组蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定 [004引1、用甲醇诱导表达鸡生长激素重组蛋白
[0049] 将转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH单菌落接种于3mLYPD培养基中，28°C摇 床培养1她活化;将上述菌液按照1 %接种于BMGY培养基中，28 °C摇床培养16-2化至ODsoo达 到2-6，2500 X g，5min离屯、收集菌体，换用BMMY培养基诱导表达，每2地添加甲醇至1 %，连续 诱导96h，分别在24h、4她、72h、96h收集上清，SDS-PAGE分析蛋白（图3)，随着时间递增，表达 效果越佳，其中96h表达效果最佳，随之筛选出高表达菌株。
[(K)加]2、鸡生长激素重组蛋白的纯化
[0化1] 取IOOmL的GS115-PPIC9K-C細诱导96h上清，用8000邸a透析袋在儀柱化结合液中 透析1她，每化换一次液;将透析后的诱导上清用儀柱纯化，其中收集过柱液、洗涂液、洗脱 液做SDS-PAGE电泳分析(图4)。洗脱蛋白中含有杂蛋白，因此采用凝胶层析方法去除其中杂 质，并做SDS-PAGE电泳分析（图5)。详细操作为:取IOOmL的GS115-PPIC9K-C細诱导96h培养 上清，装于SOOOKDa透析袋内后，置于20倍的透析平衡液(儀柱亲和层析所用的结合液）中透 析18h，每化换一次液，将透析后的诱导上清12，000巧m离屯、30分钟(4°C )，并用0.2咖的滤膜 过滤样品，用1 OmL(10个柱体积)结合液W流速为ImL/min平衡ImL儀柱，然后将过滤后的样 品W流速为0.5mL/min上样，上样结束后分别用含有50mM咪挫、IOOmM咪挫的结合平衡液（即 洗涂液)依次洗涂10个柱体积于去除非特异性结合的蛋白，最后用500ml咪挫的结合平衡液 (即洗脱液)洗脱结合蛋白，收集洗脱峰，在此纯化过程中同时收集过柱液、洗涂液。然后采 用凝胶层析(凝胶柱填料为Se地acryl S-IOO:柱长60cm，内径16mm)通过分子筛效应进行第 二次纯化目的蛋白，首先用抑7.2的PBSW流速0.5mL/min平衡凝胶柱一个柱体积，然后上第 一次纯化的含有目的蛋白的样品（蛋白总量含3mg，体积^5mL)，继续用PBSW同样的速度洗 脱样品，收集洗脱峰，目的蛋白（鸡生长激素成熟多肤)经过两次纯化后的纯度可达到95% 社。
[0化2] 3、用BCA法测定鸡生长激素重组蛋白回收率
[0053] 用PBS将25mg/mL的BSA标准蛋白稀释成0.5mg/mL的标准品，将标准品按0，1，2，4， 8，12，16，20化加到96孔板的标准品孔中，PBS补足到20化，将纯化的鸡生长激素重组蛋白加 入到96孔板的待测样品孔中，每孔各加入加入20化LBCA工作液，37°C放置30分钟，用酶标仪 巧慢吸光度(A日62皿），用标准品吸光度绘制标准曲线(7 = 0.9296义-0.0908北=0.998，其中7 为蛋白浓度mg/mL，x为吸光度），计算出样品浓度约为O.lmg/mL，最后得出本发明的鸡生长 激素重组蛋白每升培养物回收率达到10毫克W上。
[0054] 4、鸡生长激素重组蛋白活性鉴定
[00对将LMH细胞W5X IO6Cells/孔接种于24孔板中，用含血清的培养基在37°C，5%C02 的培养箱中培养;贴壁培养24h后，更换无血清培养基继续培养化；用cCTl重组蛋白处理细 胞，对照组用PBS处理，37°C，5 %C〇2处理1化后，提取细胞总RNA;巧光定量PCR方法检测重组 C細蛋白对IGF-I mRNA的表达影响。经过鸡生长激素重组蛋白处理12h后，LMH细胞IGF-I mRNA的表达量显著增高，表明本发明得到的鸡生长激素重组蛋白能够促LMH细胞IGF-1 mRNA表达的上调，其具有生物学活性（图6)。为进一步研究鸡生长激素的结构、功能W及生 产应用提供了基础。
【主权项】
1. 一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于，该方法包 括以下步骤： (1) 从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到鸡生长 激素的基因片段； (2) 将步骤（1)所得基因片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，并在C端添加6个His 标签，得到重组表达载体pPIC9K-cGH; (3) 重组表达载体pPIC9K-cGH电转化毕赤酵母GS115,并通过组氨酸缺陷筛选和G418筛 选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH; (4) 通过甲醇诱导表达，经镍柱和凝胶柱纯化得到鸡生长激素重组蛋白。2. 根据权利要求1所述的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特 征在于步骤(2)如下:将步骤（1)所得基因片段插入含有His标签的pET-30a( + )载体，并以其 为模板，PCR扩增得到含有His标签的鸡生长激素的基因片段并插入毕赤酵母分泌表达载体 pP IC9K，得到重组表达载体pP I C9K-cGH。3. 根据权利要求1所述的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特 征在于:步骤(3)电转条件为1500V，6ms。4. 根据权利要求1所述的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特 征在于:步骤(4)诱导所用甲醇为培养基体积的1%。5. 根据权利要求1所述的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特 征在于:步骤(4)诱导表达时间为96h。6. 根据权利要求1所述的鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特 征在于步骤（4)的镍柱、凝胶柱纯化具体为：取lOOmL的GS115-pPIC9K-cGH诱导上清，用 8000KDa透析袋在镍柱2L结合液中透析18h，每6h换一次液;将透析后的诱导上清先用镍柱 纯化，再采用凝胶层析方法去除其中杂蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡生长激素重组蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，包括以下步骤：(1)从鸡垂体中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到鸡生长激素的基因片段；(2)利用毕赤酵母构建重组表达载体pPIC9K-cGH；(3)重组表达载体pPIC9K-cGH电转化毕赤酵母GS115，筛选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH；(4)通过甲醇诱导表达，并纯化得到鸡生长激素重组蛋白，通过细胞活性试验鉴定其活性。本发明首次实现鸡生长激素(cGH)重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达，并建立了纯化体系，可得到纯度较高的具有活性的鸡生长激素重组蛋白。该方法操作简便、产量高、成本低廉，为进一步研究鸡生长激素的结构、功能以及生产应用提供了基础。
【IPC分类】C12R1/84, C07K1/16, C07K14/61, C12N15/81
【公开号】CN105695500
【申请号】CN201610091768
【发明人】郁建锋, 顾志良, 何赛, 张艳萍, 金泽楷, 周欢庆, 姚丽娟
【申请人】常熟理工学院
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月19日