NPCC小鼠的肿瘤尺寸、数目和病理学。(图3A)来自处理的小鼠的代表性肉眼可见的肠损伤。(图3B-E)来自显示异常隐窝病灶、胃肠上皮内瘤样病变和腺癌的Msh2fl°x/fl°x、VpC+/+小鼠的肿瘤的代表性实例。在几个情况下，我们已注意到肿瘤浸润白细胞;LS/HNPCC肿瘤中的共同病理观察结果。
[0055]图4A-4B.来自ASA处理后的Msh2fl°xm°xVpC+A小鼠的肠肿瘤的比较MSI概述。检查耳(E)、肠肿瘤(T)和肿瘤的相邻正常肠组织(N)的微卫星变化。平均等位基因分布以彩色显示。(图4A)未处理的LS/HNPCC小鼠。(图4B)阿斯匹林处理的LS/HNPCC小鼠。如所预期的4组织在所有条件下是微卫生稳定的(MSS)，因为Msh2敲除被限定于肠组织。未处理的小鼠显示肠组织中的MSI，其在肿瘤中增加(图4B)，然而阿斯匹林处理的小鼠显示肿瘤和相邻正常组织中减少的MSI。
[0056]图5.显示关于萘普生突变体相对于舒林酸砜化物-NO舒林酸砜化物的作用和差异的115Sa miR微阵列的热图。黄色显示增加的表达;蓝色显示减少的表达。
[0057]图6.显示关于萘普生突变体相对于舒林酸砜化物-NO舒林酸砜化物BIG的作用和差异的115Sa miR微阵列的热图。
[0058]图7.显示61miRAffy特征的热图(萘普生对砜化物的平均热图)。
[0059]图8.显示29miRGE84nanostring调查MSH突变体治疗药物的作用的热图。
[0060]图9.显示15miR nanostring24大文库调查研究萘普生0nlV3的热图。
[0061 ] 详细描述
[0062]Lynch综合征或遗传性非息肉性结肠直肠癌(LS/HNPCC)是人群中最常见的癌症易感性综合征，并且大约每300个个体中就可发现I例。LS/HNPCC由错配修复(MMR)基因的改变引起。肿瘤从增加的通常被MMR抑制的突变演化而来。大部分的自发性结肠直肠肿瘤(15%)、子宫内膜肿瘤(30%)和上泌尿道肿瘤(40%)还显示通常稳定的短DNA序列重复的长度变化(微卫星不稳定性或MSI)，其为丽R缺陷的诊断指示物。超过90 %的LS/HNPCC由人MMR基因的明确突变引起。
[0063]结肠直肠腺瘤-癌预防项目(CAPP)已在随机试验中检查了阿斯匹林(乙酰水杨酸:ASA)减少LS/HNPCC携带者的结肠直肠瘤的潜能(图1)。这些研究的终点是在每年的结肠镜检查筛选过程中检测LS/HNPCC癌。值得注意地，LS/HNPCC患者的益处始于5年的ASA暴露后，并且导致肿瘤形成率减少至少2倍(相较于安慰剂处理的组群)。
[0064]参与炎症性前列腺素的产生的环加氧酶-1(COXl)或⑶X2活性的抑制在过去通常被认为是通过NSAID进行癌症化学预防的机制。然而，后来证明，MMR-缺陷型人结肠肿瘤细胞对ASA的长期暴露通过增强严重不稳定的细胞的细胞凋亡的遗传选择来抑制MSI。最终，ASA处理导致具有持久性MMR缺陷，但已奇特地获得主要卫星稳定(MSS)表型的细胞群。MSS细胞的选择不依赖于COXl或C0X2基因。
[0065]ASA或舒林酸对MMR-缺陷型细胞的处理通过促凋亡遗传选择机制抑制MSI。这些结果显示，ASA和舒林酸是用于LS/HNPCC携带者的有用的癌症化学预防剂。此外，含一氧化氮(NO)供体基团的ASA抑制MSI细胞的剂量为ASA的1/300-1/3000(图2)。通过使用LS/HNPCC肠癌的小鼠模型，结果显示，ASA和低剂量的NO-ASA抑制肿瘤发生和增加存活。
[0066]本文中描述了8种不同的NSAID在多个剂量上在LS/HNPCC细胞和小鼠模型系统中的作用。显示了宽范围的化学预防功效，包括从没有作用至显著作用的结果。令人惊讶地，用萘普生(也称为消痛灵(naprosyn))对LS/HNPCC小鼠模型的处理显著地增加了存活，从而这些动物的寿命几乎为未处理动物的2倍。萘普生-处理的LS/HNPCC小鼠过着几乎正常的生活。这代表了化学预防对小鼠癌症模型的存活的极大的作用。
[0067]LS/HNPCC的小鼠模型显示与人LS/HNPCC类似的肠肿瘤病理学。同样地，给LS/HNPCC小鼠模型长期施用ASA和NO-ASA增加了存活(与人患者相似)。从小鼠模型至人疾病概括的、对癌症的共同遗传原因的显著的NSAID化学预防作用提供了独特工具，其能够剖析负责NSAID癌症化学预防功效的分子机制。
[0068]因为存在这样的宽范围的NSAID作用，因此，开发与有效的NSAID-诱导的存活相关的mRNA和miRNA表达特征是非常重要的。该表达特征可从多个独立的重叠和混杂的NSAID细胞作用中提取出来。
[0069]实验方法
[0070]利用一些NSAID的处理增加LS/HNPCC小鼠存活。
[0071]利用与粉末饮食混合并随意施用的NSAID(包括ASA)处理等同性别的Msh2fi°x/flcixVpCv+小鼠的组群。类似地检查VpC+A(Msh2+A)小鼠以控制肠中连续Cre表达的潜在混杂效应。进行每一个NSAID处理的Kaplan-Meier存活分析(图2)。未处理的Msh2f icix/flcix VpC+/+小鼠的中位存活时间为333天(红色方块；图2)。相反地，利用400mg/kg ASA的处理使LS/HNPCC小鼠的中位存活增加至393天，相当于18%的寿命延长(黑点，p〈0.001;图2B和图2C)。这些结果显示，与在研究阿斯匹林对杂合人LS/HNPCC携带者的作用的、以安慰剂为对照的随机化研究中观察到的肿瘤抑制趋势相似的肿瘤抑制趋势。利用7种另外的NSAID和NO-NSAID 衍生物 (其中有许多已在其它小鼠模型以及人中报导了化学预防活性) 处理 LS/HNPCC小鼠的组群。NSAID处理包括至少两个低于小鼠的最小耐受剂量(MTD)的剂量，并且包括:N0-ASA、萘普生、NO-萘普生、舒林酸、NO-舒林酸、舒林酸砜化物和NO-舒林酸砜化物。代表性存活数据被分成，对存活几乎无作用或无作用(图2A)、适度作用(20-50%的寿命增加；图2B)，和显著作用(>70%的寿命增加；图2C)。利用72mg/kg N0-ASA处理的LS/HNPCC小鼠的平均存活期为403天;与ASA相当的存活期(但剂量为1/10)。舒林酸和NO-舒林酸也与ASA相似，增加存活期(图2B)。然而，这两种化合物显著减少野生型小鼠的存活期(三角形，图2B)。有趣地，结果显示，在宽范围的ASA和NO-ASA剂量上不超过约20 %的存活期的增加。相反地，利用萘普生处理的LS/HNPCC小鼠的平均存活期对于166mg/kg和331mg/kg分别为545天和569天。两个剂量的萘普生处理之间不存在显著差异，这表明更低的剂量可能提供保护作用。
[0072]NSAID处理后的肿瘤病理学。
[0073]肿瘤被限制于LS/HNPCC小鼠的肠，主要在十二指肠或空肠中，极少在回肠中；与绒毛蛋白在这些组织中的表达模式和水平一致(图3A)。值得注意地，舒林酸处理增加盲肠癌的数目，如已在其它小鼠模型中所报导的。虽然利用ASA、N0-ASA和萘普生处理的小鼠比未处理的小鼠明显更晚地出现病变肿瘤，然而当被处死时，与未处理的小鼠相比较，它们具有统计学上相等的肿瘤数目(分别地，1.68 ± 0.72、1.78 ± 1.25和I.58 ± 0.67对I.90 ± I.02)。肠损伤和肿瘤包括异常隐窝病灶、腺瘤和腺癌，与人病理学相似(图3B-3E)。综合起来，这些结果表明，有效的NSAID通过延迟肿瘤发生用作化学预防剂，但最终产生的肿瘤似乎显示与未处理的对照相似的肉眼可见的病理学。
[0074]组织的检查
[0075]制备和分析需要进行病理学或形态测定分析的小鼠组织。对于肠病理学，无痛处死小鼠，分离肠道。打开整个长度的肠，检查可见损伤。记录肿瘤的位置、尺寸和数目。肉眼分析包括，所有其它器官的转移或原发病灶的检查和表征。随后将器官在10%中性缓冲福尔马林中固定，通过乙醇梯度脱水，且包埋在石蜡中。使用组织学中的常规技术或其改进技术处理组织。对于小鼠的常规筛选，对代表所有主要器官系统的38个组织切片进行组织学分析。以4-5μ切取切片，用苏木精和伊红染色。为了进行蛋白质/酶(其可被常规固定剂破坏或降解)的分析，检查冷冻切片。将冷冻切片包埋在OCT中，于液氮中快速冷冻。将样品于-70°C贮存直至在Jung低温恒温器上进行切片。当显示组织特异性分析时，仅收集和分析来自指定器官的组织。特别重要的是肠道的分析。通常检查小鼠肠的连续纵切面以整合整个肠，并保持定向。该技术有效地维持近端至远端定向，而无需在4个载玻片上对组织过度切片。
[0076]所有项目中对于组织样品的分析至关重要的是，胃肠肿瘤的准确鉴定和表征。标准诊断标准(基于小鼠和大鼠中先前建立的损伤特征)用于鉴定癌前损伤和肿瘤性病变。由于小鼠的自发性肿瘤在品系间存在差异，因此，用于这些研究的对照同窝出生仔的使用是至关重要的。
[0077]小鼠的肉眼检查可显示多个器官系统的不同损伤。特别感兴趣的是，至肠系膜(包括肠系膜淋巴结)、肝和肺的转移性损伤。测量并例举任何可见的损伤。对小鼠的这些相同的器官进行组织学检查以确认微观转移的不存在。还可进行代表性动物的全身分析以确认至不太常见的位置，例如至心脏、胰腺、脾、周围淋巴结或肾的转移的不存在。全身分析用于评价这些独特的动物模型的其它疾病的发展。
[0078]形态测定分析
[0079]形态测定分析可用于辨别肿瘤尺寸或肿瘤频率的差异。以1-100Xdry的透镜放大倍数在Olympus BX60显微镜上检查载玻片。使用Olympus DP72照相机捕捉图像，使用形态测定或体视学技术来鉴定视野中对于色度变化是阳性的个体细胞或损伤。可使用完全自动化计数技术或“人”辅助计数。对于任一收集技术，通过严格遵守网格选择的标准方案，使用计数技术获得群体的无偏取样。该模式描述为系统性随机取样技术。
[0080]现参考下列附图进行下列讨论:
[0081]图5显示热图，该热图显示关于萘普生突变体相对于舒林酸砜化物-NO舒林酸砜化物的作用和差异的115Sa miR微阵列。
[0082]图6显示热图，该热图显示关于萘普生突变体相对于舒林酸砜化物-NO舒林酸砜化物BIG的作用和差异的115Sa miR微阵列。
[0083]图7显示热图，该热图显示61miRAffy特征(萘普生对砜化物的平均热图)。
[0084]图8显示热图，该热图显示29miRGE84nanostring调查MSH突变体治疗药物的作用。
[0085]图9显示热图，该热图显示15miR nanostring24大文库调查研究萘普生0nlV3。
[0086]确定LS/HNPCC肿瘤的NSAID抑制的机制。
[0087]分析整个动物大组群中的肿瘤发展的特征性差异率以确定与增加寿命的NSAID和不增加寿命的NSAID相关的mRNA和miRNA的表达变化。通过实时PCR和nCounter数字分析验证与NSAID肿瘤抑制相关的途径生物标志物。顺从于利用免疫组织化学探针的验证的选择的途径生物标志物进一步用于病理学分析。阻留相对效应通过检查在用阿司匹林、萘普生以及其它NSAID处理后肠mRNA和miRNA的剂量和时间依赖性变化(以描述相对效应以及改进和扩展NSAID生物标志物的小组)来实现。将这些研究与存活相关联，以进一步改进途径生物标志物的小组。在该分析之后，构建用于选择的途径生物标志物的tetcm-tetoff表达系统，以测定它们对MMR-缺陷型细胞的MSI的作用。这些研究鉴定了促成NSAID肿瘤抑制的分子途径、它们的相互作用和机制。
[0088]NSAID处理减小肿瘤组织的微卫星不稳定性(MSI)。
[0089 ] 通过小的混合PCR (1-10个基因组等同物)对来自ASA和NO-ASA处理组的组织进行MSI分析以测定新型等位基因在组成型DNA(耳，E)以及正常(N)与肿瘤(T)肠组织之间的分布。当分析每一个组织的多个样品时，所得的特征谱包括内在等位基因多样性的代表性分布。来自这些小鼠的耳组织始终是MSS，主等位基因总是侧翼连接相对不变的等位基因模式(其从PCR扩增假像产生hASA和NO-ASA处理的小鼠的正常和肠组织显示主等位基因尺寸和分布的变化。然而，很清楚的是，利用ASA和NO-ASA的处理在肠隔室中至少部分地将MSI转化成MSS(比较图4A与图4B)。
[0090] 通过测定肠肿瘤与它们匹配的相邻正常组织之间的微卫生改变的绝对变化来进行它们之间的MSI状态的比较性评估。比较性MSI提供了相邻的发育上相关的正常组织与肿瘤组织之间的不稳定性的相对差异的定量测量。使用诊断性微卫星不稳定性的Bethesda标准:MSS，微卫星标志物状态无变化;高度微卫星不稳定性(MS1-H; 5个标志物中之2个不同)。未处理的动物具有33%的比较MS1-H比例，然而ASA处理的LS/HNPCC小鼠显示22%的MS1-H，NO-ASA处理的小鼠显示20 %的MSH-H。该分析显示，与细胞研究相似，利用ASA和NO-ASA的处理部分地稳定肠上皮的MSI。
[0091 ] NSAID处理后的mRNA和miRNA的分析
[0092]利用8种NSAID的每一种连续处理每组12只小鼠的组(6只VpC+/+野生型和6只Msh2flox/flox VpC+/+LS/HNPCC小鼠)，在两个月的暴露后收集肠。从每一只单独处理的小鼠收集盲肠的2.5cm的近端的肠的0.5cm切片。制备高质量mRNA和miRNA以用于表达阵列分析。为了减少日间变化的可能性，同时进行所有样品的杂交以及随后的表达分析。分析来自mRNA和miRNA芯片的转录组表达数据。数据的分析表明重复样品之间的极高的一致性。这些观察突显了mRNA和miRNA制备法以及芯片分析的高质量。
[0093]软件开发促成了数据分析。使用Java(使用Ec I ipse)和使用Struts框架(利用R-Server应用编程界面执行统计和数学函数)进行大多数编程。Jakarta Project's Struts框架通过使用统一的框架，而允许使用Servlets、JSP、用户Struts标签文库和其它组件，所述统一的框架帮助网络应用的快速设计和运用。框架的值在帮助维持、更新以及再使用和Tomcat运用的有序的和组件化的代码性质中实现。先进的程序开发工具(Eclipse、IDE、CVS、Ant、编译器、故障排除程序(debugger)、图形开发环境)和并行计算软件(MP1、PVM)也被广泛使用。
[0094]有趣地，Msh2状态和利用NSAID的处理对mRNA和miRNA表达特征谱具有强影响。通过在混合效应ANOVA模型中使用Ben jamin1-Hochberg假发现校正的p-值，297个Af f ymetrixM0E430加两个探针组(对应于197个独立基因)和俄亥俄州miRNA寡核苷酸平台上的28个miRNA探针，显示LS/HNPCC小鼠肠组织中的表达变化。随后将由于有效的NSAID处理而显示统计上显著的作用的差异调控的mRNA和miRNA经历聚类分析。
[0095]出现两个主要模式。第一，由对于肿瘤化学预防是有效的NSAID诱导的大部分mRNA和miRNA的表达变化在响应对于减少肿瘤发生是无效的NSAID时几乎未显示或未显示变化。该观察结果是鉴定具有临床效用的候选化学预防生物标志物中的重要步骤。第二，这些mRNA和miRNA中有许多在LS/HNPCC小鼠肠组织(Msh2fl°x/fl°x VpC+/+)中相较于野生型肠组织(VpC+/+)差异表达。这些结果显示，许多与Msh2等位基因的缺失相关的适应性表达变化。这样的表达变化是预料之外的，因为仅知道MSH2蛋白在MMR和DNA损伤感知中起作用。由Msh2缺失诱导的mRNA中的几种mRNA是潜在补偿性DNA修复途径(其包括几个损伤响应基因，包括ATM)的成员，且显示得到增强。
[0096]鉴定在LS/HNPCC小鼠中提供NSAID化学预防的特征的一组mRNA和miRNA。值得注意地，该小组中的许多化学预防性NSAID-诱导的mRNA和m i RNA表达变化逆转成在野生型细胞中发现的表达模式(将WT和MUT表达模式与〃有效的〃NSAID表达模式相比较)miRNA表达特征似乎最能表明NSAID诱导的表达逆转。不希望受理论束缚，这些结果与下述假说一致:有效的NSAID化学预防引起细胞表达至正常模式的再适应。相反地，肿瘤抑制剂包括Msh2的突变引发广泛的和可能的补偿性细胞表达变化，所述表达变化不被认为是它们的特定细胞功能的部分。此外，这些补偿性表达变化中的一些可帮助驱动肿瘤发生，和可被有效的NSAID逆转。从该理论出发，可做出关于NSAID在癌症化学预防中的作用的几个重要预测。首先和最重要的是，这些可逆的表达变化是NSAID剂量依赖性的并且剂量依赖性与化学预防作用相关。第二，这些表达变化中的几个改变肿瘤途径(所述肿瘤途径可在癌症发展过程中进化)和可能地发生肿瘤的分子病理学。
[0097]由于许多mRNA表达变化显示了从LS/HNPCC(MUT)模式回复至野生型(WT)小鼠组织显示的模式，因此，关注于具有最大表达变化的候选物。这些候选物代表了被有效的NSAID暴露升高或降低的mRNAC3BmprIa，骨形态发生蛋白I型受体，属于一类受体丝氨酸/苏氨酸激酶，其结合配体的TGFI3超家族的成员，调节细胞生长。TGF册II受体在超过80%的LS/HNPCC肿瘤中发生了突变。KitUKIT配体，是结合c-Kit受体的细胞因子。其在造血、精子发生和黑素形成中起着重要作用。c-Kit的激活突变与胃肠间质肿瘤相关。
[0098]分析鉴定差异调节的miR和mRNA间的功能与调节的关联性，以开始测定负责NSAID-介导的肿瘤化学预防的生物途径和网络。工具的组合用于解析网络相互作用，包括ToppGene、ToppCluster和ToppMir工具。这些分析的结果表明，差异调节的mRNA和miRNA间的巨大程度的关联性。此外，在与结肠直肠癌风险相关的基因的失调的mRNA与靶向那些差异调节的mRNA的差异调节的miRNA之间存在强相关性(参见网络图顶部的亮框)。例如，miR-9和miR-135a靶向SMCla。这两个miRNA被萘普生下调，然而SMCla mRNA表达被萘普生增强。还注意到的是，cMyc与通常在结肠直肠肿瘤发生过程中发生改变的MYC/MAX表达途径的多点关联性(参见网络图的底部的亮框)。这些观察结果显示，用于调节几个基因的表达的重叠网络机制。
[00"] —般方法
[0100]微阵列是能够在单个实验中对数十个平行处理的样品同时监控数千个mRNA或miRNA的表达的强大的高通量工具。使用的资源包括，Nucleic Acids Shared Resource(NASR)和MicroArray Shared Resource(MASR)，其是俄亥俄州立大学(OSU)综合癌症中心(CCC)的一部分，以进行处理的和未处理的样品的mRNA和miRNA表达的基因组范围的分析。NASR和MASR用于癌症研究的多种微阵列应用，包括Affymetrix基因芯片的基因组范围的mRNA表达分析，以及定制阵列和Applied B1systems微流体卡上的基因组范围的/革El向的mRNA和mi RNA表达分析。
[0101]OSU开发的miRNA微阵列平台已使得MASR能够表征超过15000个癌症样品。使用实时PCR和最终nCounter数字分析系统(NanoString Techno1gies)进行mRNA和miRNA表达模式的验证。nCounter分析系统