在超过一种组分(可将标记试剂和标记包装在一起)时，试剂盒通常还包括可将另外的组分分开地置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，可将组分的不同组合包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于包含核酸的装置，和经密封用于商业销售的任何其它试剂容器。此类容器可包括，将期望的小瓶保留在其中的注射或吹模塑料容器。
[0221 ]当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，且无菌水溶液是一种优选溶液。可包含在试剂盒中的其它溶液是用于从混合样品分离和/或富集miRNA的那些溶液。
[0222]然而，可以以干粉形式提供试剂盒的组分。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可通过添加适当的溶剂重建粉剂。预期还可在另一个容器装置中提供溶剂。试剂盒还可包括，有助于分离标记的miRNA的组分。试剂盒还可包括，保持或维持miRNA或保护其免受降解的组分。所述组分可以是不含RNA酶的或被保护免受RNA酶降解。
[0223]此外，试剂盒通常还可在适当的装置中包括，用于每一种单独的试剂或溶液的不同容器。试剂盒还可包括使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其它试剂的说明书。说明书可包括可应用的变型。预期此类试剂是本发明试剂盒的实施方案。此外，试剂盒不限于上文中列出的特定项目，并且可包括用于操作或表征miRNA的任何试剂。
[0224]还预期，在miRNA阵列的背景中论述的任何实施方案可更普遍地用于本发明的筛选或特征分析方法或试剂盒中。换言之，描述可包括在特定阵列中的试剂的任何实施方案可更普遍地在miRNA特征分析的背景中实施，而不必涉及阵列本身。
[0225]还预期，任何试剂盒、阵列或其它检测技术或工具，或任何方法可用于表征这些miRNA的任一种。此外，还预期，在miRNA阵列的背景中论述的任何实施方案可在本发明的方法中实施(利用或不利用阵列形式)；换言之，可按照本领域技术人员已知的任何技术，在本发明的任何方法中筛选或评价miRNA阵列中的任何miRNA。阵列形式对于待进行的筛选和诊断方法不是必需的。
[0226]还涉及将miRNA阵列用于治疗、预后或诊断应用的试剂盒以及这样的用途。试剂盒可包括miRNA阵列，以及关于阵列上miRNA的标准或标准化miRNA特征谱的信息。此外，在某些实施方案中，还可将对照RNA或DNA包括在试剂盒中。对照RNA可以是可用作阳性对照用于标记和/或阵列分析的miRNA。此外，样品可以是血液或组织。
[0227]在一个实施方案中，用于表征癌症的试剂盒包括用于图7中所列的miRNA或mRNA的至少一个检测探针。在某些实施方案中，试剂盒为寡核苷酸阵列的形式或包含寡核苷酸阵列。
[0228]已在本文中广泛地和一般性地描述了本发明的方法和试剂盒。落在一般性公开内容内的每一个更窄范围和下位分类也形成本发明的一部分。这还包括，具有从一般性内容中除去任何主题的前提或排除性限制的本发明的一般性描述，无论除去的内容在本文中是否被明确地提及。
[0229]微阵列的制备和筛选
[0230]本文中还提供了，miRNA阵列的制备和用途，所述阵列是核酸分子(探针)的有序的巨阵列(macroarray)或微阵列，所述核酸分子与多个miRNA分子或前体miRNA分子完全或几乎完全互补或同一，并且被以空间上分离的组织方式置于载体材料上。巨阵列通常是已将探针点印在其上的数张硝酸纤维素或尼龙。微阵列更密集地放置核酸探针，从而可将多达10，000个核酸分子安放在通常I至4平方厘米的区域中。微阵列可通过将核酸分子例如基因、寡核苷酸等点印在基质上或在基质上原位制造寡核苷酸序列来制造。点印的或制造的核酸分子可以以多达每平方厘米约30个或更高，例如多达每平方厘米约100或甚至1000个非同一核酸分子的高密度基质模式应用。微阵列通常使用涂覆的玻璃作为固体载体，与过滤阵列的基于硝酸纤维素的材料不同。通过使用miRNA-互补核酸样品的有序阵列，可跟踪每一个样品的位置并使其与原始样品相联系。其中将多种独特的核酸探针稳定地与固体载体的表面结合的多种不同的阵列装置对于本领域技术人员来说是已知的。用于阵列的有用基质包括尼龙、玻璃和硅。阵列可以以许多不同的方式变化，包括平均探针长度、探针的序列或类型、探针与阵列表面之间的键的性质(例如共价或非共价的)等等。本文中描述的标记和筛选方法以及阵列在其实用性上不限于任何参数，除了探针检测miRNA以外；因此，可将方法和组合物与多种不同类型的miRNA阵列一起使用。在某些实施方案中，miR基因产物包括一种或多种本文中描述的miR。
[0231 ]微阵列
[0232]微阵列可包括获自已知的或预测的miRNA序列的寡核苷酸探针。针对每一个miRNA，阵列可包含不同的寡核苷酸探针，例如一个包含有活性的成熟序列，另一个特异于miRNA的前体。阵列还可包含对照，例如与人直系同源物相异仅在于数个碱基的一个或多个序列，其可用作杂交严格度条件的对照。还可以包括病毒miRNA或从生物信息学工具预测的推定的miRNA。此外，其还可以在微阵列上包括，用于非特异性杂交的适当的对照。
[0233]在某些实施方案中，在用于癌症化学预防治疗响应的体外诊断或进展的预后的方法中，作为卵巢癌生物标志物的一个或多个miRNA获自用于选择用作疾病诊断生物标志物的miRNA或mRNA的方法，其包括:a)获得受试者的样品，其中所述受试者包含患有所述疾病的人和未患所述疾病的人;b)测定候选生物标志物miRNA和/或mRNA以及内部对照RNA在所述样品中的表达水平;c)计算生物标志物的相对表达水平;d)利用一个或多个变量计算预测模型，其中所述变量包括一个或多个生物标志物的相对表达水平和任选地所述疾病的一个或多个风险因子，包括遗传因子;和e)利用预测模型计算疾病风险概率、敏感性和特异性，其中具有最高敏感性和最高特异性的一个或多个生物标志物被选择为所述疾病的诊断生物标志物。
[0234]本文中对任何文献的引用不意味着承认，任何此类文献是相关现有技术水平。关于日期的所有记载或关于这些文献内容的陈述基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
[0235]虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案;相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
【主权项】
1.一种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种活化miR的miRNA表达，所述活化miR选自:miR-103、miR-193、miR-128、miR-136、miR-199a-3p、miR-27b、miR-377、miR-21、miR-34a、miR-328、miR-296_3p； 如果所述样品中测量的所述活化miR被激活，则确定所述NSAID治疗是有效的。2.权利要求1的方法，其中所述至少一种活化miR包括:miR-103、miR-193和miR-128。3.—种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种抑制miR的microRNA(miR)表达，所述抑制miR选自:miR_341、miR_297c、miR-423-5p、miR762、miR-2135、miR-423-5p、miR-297c; 如果所述样品中测量的所述抑制miR被抑制，则确定所述NSAID治疗是有效的。4.一种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种活化miR的miRNA表达，所述活化miR选自:miR-19a、miR-126-5p、miR-29b、miR-301a、miR-l、miR-218、miR-142-3p、miR-190、miR-144、miR-33、miR-377、miR-1196； 如果所述样品中测量的所述活化miR被激活，则确定所述NSAID治疗是有效的。5.—种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种活化miR的miRNA表达，所述活化miR选自:miR-375-A、miR-615-P、miR-706-P、miR-485-3p-A、miR-290-P、miR-543-A、miR-425-3p-A、miR-326-A、miR-589-A、miR-129_2_A、miR_553_A、miR_96_A、miR_7_2_A、miR_519e*_5p_A、iniR_293_A、niiR_551a_A、niiR_594-P、miR-601-A、miR-487b-A、miR-676-3p-A、miR-500-P; 如果所述样品中测量的所述活化miR被激活，则确定所述NSAID治疗是有效的。6.—种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种活化miR的miRNA表达，所述活化miR选自:miR-103、miR-193、miR-128、miR-136、miR-199a-3p、miR-27b、miR-377、miR-21、miR-34a、miR-328、miR-296-3p、miR-19a、miR-126-5p、miR-29b、miR-301a、miR-l、miR-218、miR-142-3p、miR-190、miR-144、miR-33、miR-377、miR-1196、miR-375-A、miR-615-P、miR-706-P、miR-485-3p-A、miR-290-P、miR-543-A、miR-425-3p-A、miR-326-A、miR-589-A、miR-129-2-A、miR-553-A、miR-96-A、miR-7-2-A、miR-519e*-5p-A、miR-293-A、miR-551a-A、miR-594-P、miR-601-A、miR-487b-A、miR-676-3p-A、miR-500-P、miR-706、miR_543、miR_328、miR_202、miR_338和miR-483； 如果所述样品中测量的所述活化miR被激活，则确定所述NSAID治疗是有效的。7.—种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种活化mRNA的信使RNA(mRNA)表达，所述活化mRNA选自:RPL13A、Npas2、Arntl、Kit I ^MalatKEptK 1810014B0 IRik、Aes、Sepwl、Rab4a、bakl、mall、Zfand5、Nf il3、Npas2和Irf2bp21700110K17Rik; 如果所述样品中测量的所述活化mRNA被激活，则确定所述NSAID治疗是有效的。8.权利要求6的方法，其中所述至少一种活化mRNA包括Kitl。9.一种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种抑制mRNA的信使RNA(mRNA)表达，所述抑制mRNA选自:Slc38alO、Aes、Rab5c、Cfll、PPARD、Actb、Pttglip、Espn、Elovll、Angptl2、Hlf、Per2、Tef、Per3、Dbp;Ste20al和Gml29; 如果所述样品中测量的所述抑制mRNA被抑制，则确定所述NSAID治疗是有效的。10.权利要求9的方法，其还包括测量至少一种选自Ang4、Bamb1、Cd24a、Ccl6、Entpd5、Weel、Ank3、Trp53、Selll、Ube4b、Arid5b、Prkab2、Perl、Bacel 和 Stox2 的抑制mRNA。11.一种用于评估NSAID癌症化学预防治疗在人或动物受试者中的功效的方法，所述方法包括: 从接受NSAID治疗的受试者获得含核酸的样品； 测量至少一种mRNA和/或miR生物标志物； 基于所述至少一种mRNA和/或miR生物标志物的表达确定NSAID治疗是否有效。12.上述权利要求的任一项的方法，其中从下列的至少一种中提取样品:组织、血液、月中瘤、粪便、粘液、发育不良的组织、结肠直肠组织、卵巢组织、泌尿道上皮组织、子宫内膜组织、结肠直肠道肿瘤、结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤、结肠直肠息肉、胃肠道肿瘤、小肠癌、小肠息肉、子宫内膜肿瘤、子宫内膜癌、子宫内膜增生症及其任意组合。13.上述权利要求的任一项的方法，其中通过选自下列的一种或多种方法进行测量:杂交测定、微阵列芯片、n-counter(NanoString)分析、miR-Seq分析、PCR、实时PCR、微流体卡、寡核苷酸探针和northern印迹。14.上述权利要求的任一项的方法，其中所述测定还包括，将所述样品表达与对照水平比较，其中根据选自下列的组织的对照表达水平的测量来测定对照水平:癌性组织、健康组织和获自更早时期的受试者的组织，其中所述更早时期大于:I周、I个月、6个月、200天、I年、400天、18个月、600天、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年和11年中的任一个。15.—种在人或动物受试者中抑制显示微卫星不稳定性(MSI)的肿瘤的方法，所述方法包括施用有效的NSAID，进行超过5年的时期。16.权利要求15的方法，其中所述NSAID为萘普生。17.—种抑制遗传性非息肉性结肠直肠癌或Lynch综合征(LS/HNPCC)的肿瘤发病率的方法，包括: 施用治疗有效剂量的非类固醇抗炎药(NSAID)，其中所述NSAID为萘普生和/或萘普生 钠。18.—种抑制LS/HNPCC的肿瘤发病率的方法，包括: 施用治疗有效剂量的非类固醇抗炎药(NSAID);和 通过测量至少一种生物标志物监控治疗的功效，所述生物标志物选自:活化miR、抑制miR、活化mRNA和抑制mRNA。19.一种抑制LS/HNPCC的肿瘤进展的方法，包括: 施用治疗有效剂量的非类固醇抗炎药(NSAID);和 通过测量至少一种生物标志物监控治疗的功效，所述生物标志物选自:活化miR、抑制miR、活化mRNA和抑制mRNA。20.一种抑制LS/HNPCC的肿瘤进展的方法，其包括: 施用治疗有效剂量的非类固醇抗炎药(NSAID)，其中所述NSAID为萘普生和/或萘普生钠。21.一种治疗LS/HNPCC的方法，包括: 施用治疗有效剂量的非类固醇抗炎药(NSAID);和 通过测量至少一种生物标志物来监控所述治疗的功效，所述生物标志物选自:活化m i R、抑制m i R、活化mRNA和抑制mRNA。22.上述权利要求的任一项的方法，其中所述NSAID为萘普生和/或萘普生钠。23.上述权利要求的任一项的方法，其中所述NSAID选自萘普生、萘普生钠、一氧化氮供体型乙酰水杨酸、舒林酸、一氧化氮供体型舒林酸、非诺洛芬、酮洛芬、奥沙普秦、吲哚美辛、依托度酸、双氯芬酸、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈噁昔康、氯诺昔康、伊索昔康、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、鲁米考昔、艾托考昔、尼美舒利和尼氟灭酸，以及licof enac。24.上述权利要求的任一项的方法，其中施用至少两种NSAID。25.—种测定用于治疗LS/HNPCC的NSAID剂量的方法，包括: 施用一个剂量的非类固醇抗炎药(NSAID); 通过测量至少一种生物标志物监控所述治疗的功效，所述生物标志物选自:活化miR、抑制miR、活化mRNA和抑制mRNA;和 随后增加或减少剂量至治疗有效水平，其中通过将所述至少一种生物标志物与对照相比较来测定治疗有效水平。26.一种用于筛选NSAID化合物的方法，包括: 给动物受试者施用测试NSAID化合物； 测量至少一种选自活化miR、抑制miR、活化mRNA和抑制mRNA的生物标志物;和将测试化合物的生物标志物表达特征谱与具有经测试的功效的NSAID化合物的生物标志物表达特征谱相比较。27.—种用于评估与患者的癌症相关的临床状况以进行癌症的体外诊断的方法，其包括: a)从受试者获得样品； b)测定一种或多种作为癌症生物标志物的miRNA和内部对照RNA的表达水平； c)计算所述一种或多种作为癌症生物标志物的miRNA的相对表达水平； d)通过使用一个或多个变量计算预测模型，其中所述变量包括所述一种或多种作为癌症生物标志物的miRNA的相对表达水平;和， e)通过所述预测模型计算癌症进展风险概率，其中如果所述疾病风险概率大于0.5，则所述受试者被诊断为处于癌症进展的风险中。28.—种用于提供患有LS/HNPCC的受试者的存活预后的方法，包括: 将样品中至少一个生物标志物的水平与对照相比较，其中所述至少一个生物标志物选自活化miR、抑制miR、活化mRNA和抑制mRNA及其组合;和 确定相较于对照，所述样品中至少一种生物标志物的水平是否降低或至少一种生物标志物的水平是否被改变，从而表征患有LS/HNPCC的受试者的存活预后。29.一种测定受试者的LS/HNPCC的进展的方法，包括: 将样品中至少一个生物标志物的水平与对照相比较，其中所述至少一个生物标志物选自活化miR、抑制miR、活化mRNA、抑制mRNA及其组合;和 确定相较于对照，所述样品中至少一个生物标志物的水平是否下降或至少一个生物标志物的水平是否上升，从而确定所述受试者的LS/HNPCC的进展。30.—种分子标志物的诊断试剂盒，其用于按照上述方法中的任一方法提供患有LS/HNPCC的受试者的不良存活预后，所述试剂盒包括多种核酸分子，每一种核酸分子编码mi croRNA和/或信使RNA序列， 其中至少一种miRNA序列为miR-103 ；和 其中所述多种核酸分子的一种或多种在革G细胞中和一种或多种对照细胞中差异表达，并且其中一种或多种差异表达的核酸分子一起代表了，指示患有LS/HNPCC的受试者的不良存活预后的核酸表达特征。31.—种用于表征患有LS/HNPCC或怀疑患有LS/HNPCC的受试者的疾病的方法，包括: 将样品中的至少一种生物标志的水平与对照相比较，其中所述至少一种生物标志物选自活化miR、抑制miR、活化mRNA、抑制mRNA及其组合;和 确定相较于对照，样品中至少一种生物标志物的水平是否降低或至少一种miR的水平是否升高，从而表征所述受试者的所述疾病。
【专利摘要】本文中描述了预防癌症、治疗癌症、抑制肿瘤生长、预测患者结果、优化剂量和监控治疗功效的方法。具体地，某些microRNA和信使RNA是患有Lynch综合征或遗传性非息肉性结肠直肠癌的患者对NSAID化学预防和疗法的响应的有用的指示物。
【IPC分类】A61P35/00, C12Q1/68, A61K31/60
【公开号】CN105722993
【申请号】CN201280066947
【发明人】R·菲舍尔, C·M·克罗斯, L·科普洛维奇, B·阿罗诺, J·马丁-洛佩兹
【申请人】俄亥俄州国家创新基金会, 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府, 儿童医院医疗中心
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2012年12月3日
【公告号】CA2857712A1, EP2785872A2, EP2785872A4, US20150292023, WO2013082624A2, WO2013082624A3