过标准技术从培养的细胞表达系统分尚从重组病毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
[0179]本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或HlRNA pol III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
[0180]可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。
[0181]例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细胞。例如，表达血清型2型基因组上的血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV2/2AAV2/2载体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Rabinowitz ,J.E.，等人(2002)，J.Virol.76: 791-801，其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0182]适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg (1995) ,Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1988),B1techniques6:608-614；MiIIer(1990),Hum.Gene Therap.1:5-14;和Anderson(1998),Nature392:25-30，其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0183]特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达miR基因产物的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等人(2002)，Nat.B1tech.20:1006-1010，其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Samulski等人(1987)，J.Virol.61:3096-3101 ;Fisher等人(1996) ,J.Virol,70:520-532 ； Samulski 等人(1989)，J.Virol.63:3822-3826;美国专利 5，252,479;美国专利5，139，941;国际专利申请￥094/13788;和国际专利申请冊93/24641，其全部公开内容通过引用合并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表达miR基因产物。
[0184]在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子控制下的与polyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“与polyT终止序列有效连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5’方向与polyT终止信号紧密邻接。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。
[0185]在本发明的治疗方法的其他实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表达”是指治疗后miR基因产物的前体和/或有活性的成熟形式的产量低于治疗前产生的量。通过使用例如本文中论述的测定miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定mi R的表达在癌细胞中是否已被抑制。抑制可在基因表达的水平上(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工的水平上(例如，通过抑制miR前体至成熟的活性miR的加工)发生。
[0186]如本文中所使用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以在患有癌症(例如，卵巢癌)的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的抑制miR表达的化合物的有效量。
[0187]例如，抑制表达的化合物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量，如本文中描述的。抑制miR表达的化合物的有效量还可基于待治疗的受试者的大致体重或估计的体重，如本文中描述的。
[0188]本领域技术人员还可容易地确定用于给给定的受试者施用抑制miR表达的化合物的适当给药方案，如本文中描述的。
[0189]用于抑制miR基因表达的适当的化合物包括双链RNA(例如短的或小的干扰RNA或“s i RNA”)、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这些化合物的每一种可革El向给定的m i R基因产物并干扰勒miR基因产物的表达(例如，通过抑制翻译，通过诱导切割和/或降解)。
[0190]例如，给定的miR基因的表达可通过用分离的双链RNA( “dsRNA”)分子诱导miR基因的RNA干扰来抑φ?」，所述双链RNA分子与miR基因产物的至少一部分具有至少90%、例如至少95 %、至少98 %、至少99 %或100 %的序列同源性。在特定的实施方案中，dsRNA分子是“短的或小干扰RNA”或“siRNA”。
[0191]用于本方法的siRNA包括长度大约17个核苷酸至大约29个核苷酸、优选长度大约19至大约25个核苷酸的短双链RNA13SiRNA包含通过标准Watson-Crick碱基配对相互作用(在下文中“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含大体上与靶miR基因产物内包含的核酸序列同一的核酸序列。
[0192]如本文中所使用的，si RNA中与靶mRNA内包含的靶序列“大体上同一”的核酸序列是与靶序列同一的核酸序列或与靶序列相异于I或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包括两个互补的单链RNA分子或可包括其中两个互补部分碱基配对并且通过单链“发夹结构”区域共价连接的单个分子。
[0193]siRNA还可以是与天然存在的RNA相异于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的经改变的RNA。这样的改变可包括非核苷酸材料的添加，例如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修饰或用脱氧核糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。
[0194]siRNA的一条或两条链还可包含3 ’悬突。如本文中所用的，“3 ’悬突”是指从双链RNA链的3’-末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含至少一个长度为I至大约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为I至大约5个核苷酸、长度为I至大约4个核苷酸或长度为大约2至大约4个核苷酸的3’悬突。在特定的实施方案中，3’悬突存在于siRNA的两条链上，且其长度为2个核苷酸。例如，siRNA的各条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3 ’悬突。
[0195]siRNA可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于属于Gewirtz的美国公开专利申请2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请2004/0018176，这两者的全部公开内容通过引用合并入本文。
[0196]给定的miR基因的表达还可通过反义核酸抑制。如本文中所使用的，“反义核酸”是指通过RNA-RNA，RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与靶RNA结合的核酸分子，其改变靶RNA的活性。适合用于本方法的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互补的核酸序列的单链核酸(例如，RNA,DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸(PNA))。反义核酸可包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补或95-100%互补的核酸序列。本文的表中提供了特定人miR基因产物的核酸序列。不希望受任何理论束缚，据信，反义核酸激活RNA酶H或降解miR基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。
[0197]反义核酸还可包含对核酸主链或对糖和碱基部分(或它们的等价物)的修饰，从而增加靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子的功效相关的其他性质。此类修饰包括胆固醇部分、双链体插入剂例如吖啶或一种或多种抗核酸酶基团。
[0198]反义核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993),Science261:1004以及属于Woolf等人的美国专利5,849,902，其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0199]给定的miR基因的表达还可通过酶促核酸(enzymatic nucleic acid)抑制。如本文中所使用的“酶促核酸”是指包含与miR基因产物的连续核酸序列互补的底物结合区并且能够特异性切割miR基因产物的核酸。酶促核酸底物结合区可以例如与miR基因产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补或95-100%互补。酶促核酸还可包括在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本方法的示例性酶促核酸是核酶。
[0200]酶促核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck( 1995) ,Nucl.Acids Res.23:2092-96;Hammann等人(1999) ,Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.9: 25-31;以及属于Cech等人的美国专利4,987,071，其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0201 ] 至少一种miR基因产物或至少一种用于抑制miR表达的化合物的施用将在患有癌症的受试者中抑制癌细胞的增殖。如本文中所使用的，“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性或暂时地阻止或减缓细胞的生长或繁殖。如果受试者中癌细胞的数目在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后保持恒定或减少，那么可推断癌细胞增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞增殖被抑制。
[0202]受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设计用于检测癌细胞的特征表面标记的其他技术来测量。
[0203]可通过适合用于将此类化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法来对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。例如，可通过适合于用此类化合物或用包含编码此类化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用miR基因产物或抑制miR表达的化合物。在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。
[0204]用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知的，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核(pronuc I eus)的直接注射、电穿孔、脂质体转移和由亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、基因枪或微粒加速、磷酸钙沉淀以及由病毒载体介导的转染。
[0205]例如，细胞可用质脂体转移化合物例如D0TAP(N-[1-(2，3_ 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等价物例如LIP0FECTIN进行转染。使用的核酸的量对于实施本发明不是至关重要的；可接受的结果可用0.1-100微克核酸/105个细胞来获得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大约0.5微克质粒载体/105个细胞的比例。
[0206]还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括例如血管内给药(例如，静脉内团注(bolus inject1n)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周(per1-tissue)和组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透栗)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其他安置装置(例如，视网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别适合的施用途径是注射、输注和至肿瘤内的直接注射。
[0207]在本方法中，miR基因产物或抑制miR基因产物表达的化合物可以以裸露的RNA形式、与递送试剂一起或以包含表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)的形式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如MirusTransit TKO亲脂试剂、Iipofectin、Iipofectamine、cel If ectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。
[0208]包含表达miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的重组质粒和病毒载体、以及用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术在本文中进行了论述和/或在领域是公知的。
[0209]在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方法，例如如Szoka等人(1980) ,Ann.Rev.B1phys.B1eng.9:467;和美国专利4,235,871、4，501,728、4，837，028和5，019，369(其全部公开内容通过引用合并入本文)中所描述的方法。
[0210]用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
[0211]用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂质体结构。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制部分和配体。
[0212]用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大的亲水聚合物。如本文中所使用的，抑制调理作用的部分，当其通过化学或物理方式(例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团的直接结合)附着至膜时，与脂质体膜“结合”。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保护性表面层;例如，如美国专利4，920，016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0213]适合于修饰脂质体的抑制调理作用的部分优选是具有大约500至大约40，000道尔顿，更优选大约2，000至大约20，000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或其衍生物;例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯;合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮;线性的、分支的或树枝状聚酰胺;聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GMl JEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚乙二胺、聚乙烯胺或多聚核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶(carrageenan);胺化的多糖或低聚糖(线性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例如与具有所得的羧基的连接的碳酸的衍生物反应的多糖或低聚糖。优选，抑制调理作用的部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
[0214]可通过许多熟知的技术中的任一种将抑制调理作用的部分结合至脂质体膜。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。类似地，可使用Na (CN)BH3和溶剂混合物(例如以30:12比例的四氢呋喃和水)在60 °C下通过还原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖(dextran)聚合物。
[0215]用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。因此，此类脂质体有时称为“隐形(stealth)”脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或“渗漏”微脉管系统饲喂的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如实体瘤(例如，卵巢癌)将有效地积累这些脂质体;参见Gabizon,等人(1988) ,Proc.Natl.Acad.Sc1.，U.S.A.,18:6949-53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中的大量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用于将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。
[0216]可在将它们给受试者施用之前，按照本领域已知的技术将miR基因产物或miR基因表达-抑制化合物配制为药物组合物，有时称为“药物”。因此，本发明包括用于治疗癌症的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，以及药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，至少一种miR基因产物对应于与适当的对照细胞相比，在癌细胞中具有降低的表达水平的miR基因产物。
[0217]试剂盒
[0218]可将本文中描述的任何组合物包括在试剂盒中。在非限定性实例中，将用于分离miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评价miRNA群体的试剂包括在试剂盒中。试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。试剂盒从而可在适当的容器装置中包括，用于通过掺入标记的核苷酸或未标记的核苷酸(随后对其进行标记)而标记miRNA的酶。其还可包括一种或多种缓冲液，例如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液、用于制备miRNA探针的化合物，和用于分离miRNA的组分。其它试剂盒可包括，用于制备包含与miRNA互补的寡核苷酸的核酸阵列的组分，从而可包括例如固体载体。
[0219]对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可存在包含与本文中描述的任一个miR的全部或部分同一或互补的序列的核酸分子。
[0220]可将试剂盒的组分包装在含水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置(可将组分置于其中，和优选地适当地进行等分)。当试剂盒中存