利用基于基因表达的直接多重测量的新型数字技术并且提供高水平的精确度和灵敏性(〈I个拷贝/细胞)。该技术使用分子"条形码"和单分子成像来检测和计数单个反应中的数百个独特的转录物。
mRNA表达表征-总的RNA分离按照制造商的说明书使用TRIzol法(Invitrogen)来进行ο包含针对超过45,000个表征的基因和表达的序列标签的探针组的基因芯片小鼠基因组4302.0阵列(Affymetrix)是有用的。按照Affymetrix方案进行样品标记和处理、基因芯片杂交和扫描。完成研究以减少从组织进行的mRNA分离，以实施和测定统计能力所需的样品的最少数目。简而言之，使用SuperScript Choice System(Invitrogen)，从总RNA合成双链cDNA，其中将T7RNA聚合酶启动子位点添加至其3’末端(Genset ,La Jolla，CA)。通过使用B1Array T7RNA聚合酶标记试剂盒(Enzo Diagnostics)，在体外从cDNA产生生物素化cRNA，并扩增所述cRNA。在用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，HiIden,Germany)纯化cRNA后，将20yg的cRNA在94°C片段化35分钟。将约12.5yg的片段化cRNA用于250-μ1杂交混合物中，所述杂交混合物含有鲱鱼精子DNA(0.lmg/ml ;Promega)+细菌和噬菌体cRNA对照(1.5ρΜB1B,5pM B1C，25pM B1D和10pM Cre)，以用作杂交效率的内部对照。将混合物的等分(200μ1)与阵列在芯片杂交炉640(Affymetrix)中在45°C杂交18小时。洗涤每一个阵列，用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(Invitrogen)染色，在GeneChip Fluidics Stat1n450(Affymetrix)上用生物素化的抗链霉抗生物素蛋白抗体(Vector Laboratories)进行放大。用GeneArray G7扫描仪(Affymetrix)扫描阵列以获得图像和信号强度。结果表明6个独立的样品足以提供统计能力。
[0103]miRNA表达表征-利用从野生型和LS/HNPCC小鼠分离的miRNA在微阵列芯片上进行RNA标记和杂交。进行这些研究以减少来自组织的miRNA阵列分析，从而实践和提供表达变化以及取样能力的统计基线。简而言之，使用5’生物素末端标记的随机八聚体寡核苷酸引物通过反转录对5yg的来自各个样品的总RNA进行生物素标记。在miRNA微阵列芯片(Oh1State University,2.0版)上进行生物素标记的cDNA的杂交，所述芯片以一式四份包含800个miRNA探针，包括245个人和200个小鼠miRNA基因。使用Axon Scanner4000B通过链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物β检测杂交信号，并通过GENEPIX6.0软件(Axon Instruments)进行定量。结果显示，6个个体年龄匹配的小鼠组织样品对于统计能力是足够的。
[0104]微阵列结果的验证-在实验性测量过程中，微阵列分析的结果也可通过可选择的方法确认。最常使用的方法是实时PCR。出于两个原因进行微阵列结果的验证:第一，验证观察到的变化和确保它们在更大数目的样品中是可重现的；和第二，确保阵列结果不是因阵列技术或方法的固有问题产生的。此外，在某些实施方案中，微阵列的荧光检测的相对有限的动态范围限制了灵敏性和特异性。使用Applied B1SyStemS7900HT序列检测系统或nCounter数字分析系统(NanoString Technologies)，利用预先设计的引物和试剂来进行表达特征数据的验证。进行定量的计算机辅助的分析。
[0105]存在针对所有生物标志物mRNA的蛋白质产物的抗体试剂。此外，这类抗体试剂的12种试剂已被验证用于IHC分析。验证用于western或IHC的抗体试剂的可选择的方法是，构建针对蛋白质生物标志物的肽来源的多克隆抗体。这可使用俄亥俄州立大学综合癌症中心核心系统来实现。这类抗体试剂将检查其表达模式响应有效的NSAID而被改变的mRNA的蛋白质产物。检查野生型和LS/HNPCC小鼠的肠组织以进行比较。使用适当的抗血清，通过we s t ern和IHC分析检查已鉴定的与mRNA/蛋白质生物标志物相关的另外的途径组件的表达和翻译后修饰。评估mRNA表达的改变与由这些mRNA编码的蛋白质表达之间的关系。
[0106]LSIHNPCC小鼠模型的开发
[0107]产生其中Msh2的外显子12侧翼连接LoxP重组位点(Msh2fWfl°x)的小鼠模型。通过在绒毛蛋白启动子(VpC+/+)的控制之下的Cre重组酶的组织特异性表达将Msh2缺失靶向肠上皮，这导致受累组织中不存在Msh2蛋白。肿瘤发生被限制于肠并且具有HNPCC-样肿瘤的所有病理学标志包括MSI。当考虑该小鼠模型的有用性时，重要地注意到，虽然当今LS/HNPCC主要在结肠中发生，但其最初被描述为胃肠癌。此外，与它们的人对应物一样，LS/HNPCC小鼠发展(和最终死于)表现快速进展的1-2个肿瘤。后一种表型是该LS/HNPCC小鼠模型的不利方面之一，因为NSAID对肿瘤多样性的作用实际上是不可能测定的。然而，因为肿瘤数目少，因此，即使对肿瘤起始和/或进展的适度作用也可具有对这些LS/HNPCC小鼠的存活的示范效果。
[0108]可选择的小鼠模型包括氧化偶氮甲烷诱导的LS/HNPCC结肠癌模型。该模型使用杂合MshS1M+VpCvVh鼠，所述小鼠的表型与人携带者相似。
[0109]NSAID对小鼠肿瘤发生的化学预防分析的终点是存活。肿瘤动力学、治疗方案和肿瘤发展过程中的病理学变化的评估构成相关定量数据库。
[0110]统计分析
[0111]与俄亥俄州立大学的生物统计中心(CBOSU)合作进行生物信息学和统计分析。比较每一个剂量上的化学预防药物与未处理对照组之间的存活。对于每一种药物，每一个剂量使用每组n = 20只小鼠，以计算的80%的能力来检测处理起始后I年的30%的存活差异。这些计算假定药物组的每一种药物的近似存活率为50%，但对照组为20%。时序检验用于存活分析，Kaplan-Meier曲线用于显示结果。如果对于某一药物处理观察到显著增加的存活，则将那些组的存活作为辅助进行比较。其它测量值，例如肿瘤数目、肿瘤位置和肿瘤的病理学被当作次要终点。使用双样本t检验比较肿瘤数目，描述性统计被用于其它两个测量值。
[0112]微阵列用于研究对于相同药物处理显示有效的化学预防的组织与显示顽固性化学预防的组织之间的共同mRNA和miRNA表达差异。OSU定制的miRNA微阵列芯片用于miRNA表达研究。Affymetrix基因芯片用于基因表达研究。基于高百分比的阵列高于噪声截止值的要求的过滤法用于滤掉低表达mRNA和miRNA。分位数标准化法用于跨阵列标准化。进行线性模型来检测差异表达的基因。可使用用于mRNA表达的RMA法概述整个探针组的基因表达水平。为了改善差异表达的可变性和统计检验的评价，可使用方差阈值收缩法(Varianceshrinkage method)。通过控制假阳性的平均数目来调整显著性水平。为了鉴定基因类别或途径，使用EASE(Nat1nal Institute of Allergy and Infect1us Diseases,Bethesda,MD)、BRB 阵列工具和 Ingenuity 软件(Ingenuity System ,Redwood City ,CA)。过滤后，可在芯片上测试约10，000种mRNA或700种miRNA。在该方法中，允许所有可测试的mRNA或miRNA中存在10或5个假阳性。对于每一种药物，每一个剂量使用n = 6只小鼠/组，以超过80%的能力检测mRNA和miRNA的2倍差异(a = 0.001，假定CV = 20%)。一旦鉴定了相较于未处理的组，每一种药物在每一个剂量上的基因表达变化的列表，则鉴定共同的基因。利用线性混合模型作为探索工具研究感兴趣的鉴定的mRNA和miRNA的表达与对这些基因的表达的剂量效应之间的关系。
[0113]其它方法和定义
[0114]应理解，上文的一般描述和下文的详细描述仅是示例性的，并且无意限制本教导的范围。在本申请中，除非明确地另有所指，否则单数的使用包括复数。
[0115]当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，单词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”的使用可意指“一个/一种”，并且其还与“一个/一种或多个/多种”、“至少一个/一种”和“一个/一种或超过一个/一种”的含义一致。
[0116]同样地，“含有”、“包含”和“包括”或这些根词的修饰形式例如但不限于“含有(comprises)”、“包含(contained)”和“包括(including)”的使用无意是限定性的。术语〃和/或"意指，之前和之后的术语可被合并在一起或分开来考虑。为了举例说明的目的，但不是作为限制，"X和/或Y"可意指"X"或"Y 〃或"X和Y"。
[0117]应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，为简便起见，术语〃基因〃用于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括，参与其表达的miRNA的基因组序列，例如启动子或其它调控序列。
[0118]术语〃m i R 〃、〃m i r 〃和〃m i RNA 〃通常是指m i cr ο RNA，一类能够调节RNA翻译的小RNA分子(参见，Zeng和Cullen,RNA,9(1): 112-123，2003;Kidner和Martienssen Trends Genet,19(1):13-6,2003；Dennis C,Nature,420(6917):732,2002；Couzin J，Science298(5602):2296-7，2002，其各自通过引用并入本文)。
[0119]应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，为简便起见，术语〃基因〃用于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括，参与其表达的miRNA的基因组序列，例如启动子或其它调控序列。
[0120]术语"miRNA〃通常是指单链分子，但在具体的实施方案中，本发明中应用的分子也可包括，与相同单链分子的另一个区域或与另一个核酸部分互补(在整个链的长度上10-50 %互补)、大体上互补(在整个链的长度上大于50 %，但少于100 %的互补)或完全互补的区域或另外的链。因此，核酸可包括，包含一个或多个互补或自身互补链的分子或包含分子的特定序列的“互补序列”。例如，前体miRNA可具有自身互补区域，其多至100%的互补，本发明的砧1?熟可与它们的靶60、65、70、75、80、85、90、95或100%互补或至少60、65、70、75、80、85、90、95 或 100% 互补。
[0121]如本文中所用，术语〃其组合〃是指，该术语之前所列项的全部排列和组合。例如，〃A、B、C或其组合〃意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一个，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的话，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
[0122]除非另有所指，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,由Oxford University Press，1994出版(ISBNO-19-854287-9);Kendrew等人(eds.) ,The Encyclopedia of Molecular B1logy，由BlackwellScience Ltd.，1994出版(ISBN0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(ed.) ,MolecularB1logy and B1technology:a Comprehensive Desk Reference , EfeVCH Publishers ,Inc.，1995出版(ISBN1-56081-569-8)。
[0123]为了有助于论述本公开内容的各种实施方案，提供了下列具体术语的解释:
[0124]附加疗法:与基础治疗组合使用以改善基础治疗的效果的治疗。
[0125]临床结果:其是指，在疾病或障碍的治疗后或在治疗不存在的情况下患者的健康状态。临床结果包括但不限于，直至死亡的时间长度的增加、直至死亡的时间长度的减少、存活机会的增加、死亡风险的增加、存活、无疾病存活、慢性疾病、转移、晚期或侵袭性疾病、疾病复发、死亡以及对疗法的良好或不良响应。
[0126]对照:“对照”是指用于与实验样品例如获自患者的肿瘤样品比较的样品或标准。
[0127]存活的减少:如本文中所用，“存活的减少”是指，患者死亡前时间长度的减少或患者死亡的风险的增加。
[0128]检测表达的水平:例如，“检测miR或miRNA表达的水平”是指定量存在于样品中的miR或miRNA的量。检测特定miR或任何mi croRNA的表达可使用本领域已知或本文中描述的任何方法，例如通过qRT-PCR来实现。检测miR的表达包括，检测miRNA的成熟形式或与miRNA表达相关的前体形式的表达。通常地，miRNA检测法包括序列特异性检测，例如通过RT-PCR。miR-特异性引物和探针可使用本领域已知的前体和成熟miR核酸序列来进行设计。
[0129]MicroRNA(miRNA):调控基因表达的单链RNA分子。MicroRNA在长度上通常为21-23个核苷酸。MicroRNA从称为pr 1-miRNA的初级转录物被加工成称为前体(pre)-miRNA的短莖-环结构，最后被加工成功能性成熟的microRNA。成熟的microRNA分子与一个或多个信使RNA分子部分互补，并且它们的主要功能是下调基因表达。MicroRNA通过RNAi途径调控基因表达。
[0130]miR表达:如本文中所用，“低miR表达”和“高miR表达”是相对术语，其涉及在样品中发现的miRNA的水平。在一些实施方案中，低和高miR表达通过比较一组对照样品与测试样品的miRNA水平来测定。随后可基于样品中miR的表达是高于(高)还是低于(低)平均或中位miR表达水平来将低和高表达分配给每一个样品。对于单个样品，高或低miR表达可通过将样品与已知具有高或低表达的对照或参照样品相比较，或通过与标准值比较来测定。低和高miR表达可包括miRNA的前体或成熟形式或两者的表达。
[0131]受试者:如本文中所用，术语“受试者”包括人和非人动物。进行治疗的优选患者是人。“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
[0132]药学上可接受的媒介物:用于本公开内容的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.ff.Martin1Mack Publishing C0.,Easton，PA，第15版(1975)描述了适用于一种或多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。
[0133]预防、治疗或改善疾病:“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病状开始发展后改善疾病或病状的体征或症状的治疗干预。“改善”是指疾病的体征或症状的数目或严重度的减少。
[0134]筛选:如本文中所用，“筛选”是指用于评价和鉴定影响疾病的候选试剂的方法。microRNA的表达可使用本领域已知的和本文中描述的许多技术中的任一种，例如通过微阵列分析或通过qRT-PCR来定量。
[0135]小分子:通常具有小于约1000道尔顿，或在一些实施方案中，小于约500道尔顿的分子量的分子，其中分子能够在一定可测量的程度上调节靶分子的活性。
[0136]治疗:包括诊断和治疗的总称。
[0137]治疗剂:当恰当地给受试者施用时能够诱导期望的治疗或预防作用的化合物、小分子或其它组合物例如反义化合物、抗体、蛋白酶抑制剂、激素、趋化剂或细胞因子。
[0138]如本文中所用，“候选试剂”是被选择用于筛选以确定其是否可用作治疗剂的化合物。“温育”包括用于试剂与细胞或组织相互作用的充足量的时间。“接触”包括将试剂以固体或液体形式与细胞或组织一起温育。用试剂“处理/治疗”细胞或组织包括将试剂与细胞或组织接触或一起温育。
[0139]治疗有效量:足以在待用试剂治疗的受试者或细胞中获得期望的作用的指定的药物试剂或治疗剂的量。试剂的有效量将取决于几个因素，包括但不限于待治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的施用方式。
[0140]在本发明方法的一些实施方案中，对照的使用是期望的。在这点上，对照可以是获自相同患者的非癌性细胞/组织样品，或获自健康受试者例如健康组织供者的细胞/组织样品。在另一个实例中，对照是从历史值计算的标准。可按照本领域已知的任何方法获得肿瘤样品和非癌性细胞/组织样品。例如，可从已经历切除术的癌症患者获得肿瘤和非癌性样品，或可通过使用皮下注射针头的提取，通过显微解剖，或通过激光捕获来获得它们。对照(非癌性)样品可以例如从尸体器官供者或从健康供者获得。
[0141]有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得。要理解，还可通过生物或化学合成直接产生有活性的19-25个核苷酸的RNA分子，而不必从miR前体加工获得。当在本文中通过名称提及microRNA时，除非另外指出，否则名称相应于前体和成熟形式。
[0142 ]可在获自受试者的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过常规活组织检查技术从怀疑患有卵巢癌的受试者取出组织样品。在另一个实施方案中，可从受试者取出血液样品，可通过标准技术分离白细胞以用于DNA提取。优选在开始放射疗法、化学疗法或其它治疗性治疗之前，从受试者获得血液或组织样品。对应的对照组织或血液样品或对照参照样品可获自受试者的未患病组织，获自正常人个体或正常个体的群体，或获自对应于受试者样品中的大部分细胞的培养细胞。随后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起处理，以便可将受试者样品的细胞中从给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的对应miR基因产物水平相比较。或者，可获得参照样品并且将其与测试样品分开地(例如，在不同时间)进行处理，可将测试样品的细胞中从给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与参照样品的对应miR基因产物水平相比较。
[0143]在一个实施方案中，测试样品的至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的对应miR基因产物的水平(S卩，miR基因产物的表达〃上调〃或“增加”)。如本文中所用，当受试者的细胞或组织样品中的miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中的相同基因产物的量时，miR基因产物的表达是增加的。在另一个实施方案中，测试样品的至少一种miR基因产物的水平低于对照样品的对应miR基因产物的水平(S卩，miR基因产物的表达"下调"或“减少”)。如本文中所用，当受试者的细胞或组织样品中从该基因产生的miR基因产物的量少于从对照细胞或组织样品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达减少。可相对于一个或多个RNA表达标准来测定对照和正常样品中的相对miR基因表达。标准可包括例如OmiR基因表达水平，标准细胞系的miR基因表达水平、受试者的未患病组织的miR基因表达水平，或先前获得的正常人对照群体的miR基因表达的平均水平。
[0144]获自受试者的样品的miR基因产物的水平相对于对照样品的对应miR基因产物的水平的改变