胆茶碱的药物组合物及其在生物医药中的应用
【专利摘要】本发明公开了胆茶碱的药物组合物及其在生物医药中的应用，本发明提供的胆茶碱的药物组合物中含有胆茶碱和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，胆茶碱、化合物(Ⅰ)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和免疫器官指数，胆茶碱和化合物(Ⅰ)联合使用可以进一步提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和免疫器官指数，效果优于胆茶碱或化合物(Ⅰ)单独作用效果，可以开发成提高免疫力的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
胆茶碱的药物组合物及其在生物医药中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及胆茶碱的新用途，具体涉及胆茶碱的药物组合物 及其在生物医药中的应用。
【背景技术】
[0002] 胆茶碱用于支气管哮喘，也用于心源性肺水肿引起的哮喘。
[0003] 迄今为止，尚未见胆茶碱及其药物组合物与增强免疫力的相关性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种胆茶碱的药物组合物，该药物组合物中含有胆茶碱和 一种结构新颖的天然产物，胆茶碱和该天然产物可以协同增强免疫力。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0008] -种胆茶碱的药物组合物，包括胆茶碱、如权利要求1所述的化合物（I)和药学上 可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0009] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0010] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0011] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将茵陈粉碎，用85~95%乙醇 热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇萃取物用 大孔树脂除杂，先用8 %乙醇洗脱10个柱体积，再用70 %乙醇洗脱12个柱体积，收集70 %洗 脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分 离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步 骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化 合物(I)。
[0012]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用90%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0013]进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0014]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0015] 上述化合物(I)在制备增强免疫力的药物中的应用。
[0016] 上述胆茶碱的药物组合物在制备增强免疫力的药物中的应用。
[0017]本发明的优点：
[0018] 本发明提供的胆茶碱的药物组合物中含有胆茶碱和一种结构新颖的天然产物，胆 茶碱和该天然产物单独作用时，具有增强免疫力作用;二者联合作用时，增强免疫力效果进 一步提高，可以开发成增强免疫力的药物。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0021] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0022] 分离方法：（a)将茵陈（2kg)粉碎，用90 %乙醇热回流提取（20L X 3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水饱和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用70%乙醇洗脱12 个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱 浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱 体积)和5:1(10个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用 正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1(8个柱体积）、5:1(10个柱体积)和2:1(5个柱体 积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0023] 结构确证:册431-]\^显示[]\?1]+为111/2 293.1338，结合核磁特征可得分子式为 C16H2Q〇5，不饱和度为7。核磁共振氢谱数据SH(ppm，CDC13，500MHz): H-1 (4 ? 03，s)，H-3(3 ? 31， s)，H-6(6.O3，d，J = 4.4Hz)，H-7(2.71，ddd，J = 4.4，13.1，4.6Hz)，H-8a(1.72，m)，H-80 (1.81，m)，H-9a(l .56，m)，H-90(1.63，m)，H-13(5.76，d，J = 3.3Hz)，H-13(6.29，d，J = 3.3抱），11-14(1.02,8)，11-15(1.47,8)，12-016(3.77,8);核磁共振碳谱数据知(卯 111，〇)(：13， 125MHz):78.7(CH，l-C)，204.3(C，2-C)，62.7(CH，3-C)，62.3(C，4-C)，152.6(C，5-C)，125.7 (CH，6-C)，43.5(CH，7-C)，20.3(CH2,8-C)，33.5(CH2,9-C)，34.3(C，10-C)，144.6(C，n-C)， 167.3(C，12-C)，124.9(CH2，13-C)，19.2(CH3，14-C)，21.6(CH 3，15-C)，52.7(CH3，12-0Me)。 13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有16个碳信号，包括三个甲基(一个甲氧基），三个亚甲基(一 个烯烃碳），四个次甲基(两个连氧碳和一个烯烃碳），以及六个季碳(两个烯烃碳，两个羰基 碳和一个连氧季碳）。以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为三环结构。 1H-NMR谱结 合HSQC谱显示三个甲基质子信号SH 1.02(3H，s)、1.47(3H，s)与3.77(3H，s)，一对端烯烃质 子信号知5.76(111，(1，1 = 3.3他）与6.29(111，(1，1 = 3.3泡），两个连氧次甲基质子信号知 4.03(111，8)、3.31(111，8)，一个烯烃质子信号知6.03(111，(1，了 = 4.4抱）。匪1?谱数据知3.77 (3H，s)与Sc 52.7可知该化合物中存在甲氧基，腿8(：谱中11-(?3与(：-12相关信号表明了甲氧 基连接在C-12位。根据NMR谱数据S H 3.31(lH，s)与Sc 62.7、62.3可知该化合物中存在个环 氧结构。通过七-咕COSY谱中H-6/H-7/H2-8/H 2-9相关信号，以及HMBC谱中显示的H-1与C-2、 C-3 和C-11，H-3 与 C-1、C-2、C-4和C-5，H-6 与C-5、C-7、C-8和C-10，H-7 与 C-6、C-8和C-11，H2-13与C-7、C-11和C-12，H3-14与C-10相关信号，可以构建该化合物的连接方式，并且上述波 谱数据表明该化合物为桉叶烷型倍半萜，该化合物中的C-l、C-3、C-4、C-7和C-10为手性碳， 通过N0ESY试验与H-H偶合常数确认了相对构型。通过N0ESY谱中H-3/H 3-14、H-3/H3-15以及 H3-14/H3-15相关信号确定C-3与C-4的环氧结构为a构型。N0ESY谱中H-1/H-90、H-1/H 3-14、 11-3/出-15、11-7/11-13、11-邪/11-13、11-郎/出-14以及出-14/113-15相关信号表明该化合物(：-1、 C-3、C-4、C-7和C-10构型为11?、31?、43、73和101?。综合氢谱、碳谱、腿8(：谱和勵￡3￥谱，以及文 献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确 定，理论值与实验值基本一致。该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0025] 实施例2:药理作用
[0026] 1、材料与方法
[0027] 1.1动物
[0028] 清洁级昆明种小白鼠120只，体重20±2g，雌雄各半，四川农业大学实验动物中心 提供。
[0029] 1.2试剂与样品
[0030]胆茶碱购自中国食品药品检定研究院。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。环磷 酰胺(cyclophosphamide，CTX)(江苏恒瑞），黄芪多糖(APS，江苏华东贝尔生物药业），台盼 蓝（Sigma)，RPMI 1640培养液(HycIon)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma)，脂多糖（LPS，Sigma)，MTT (Si gma)，二甲亚砜(DMSO)，pH7.2TOS，5 %鸡红细胞(CRBC)，豚鼠血清(广州蕊特生物），小鼠 细胞因子IL-2，IL-4和IFN-y 检测试剂盒(B0STER)，CD3+(FITC Hamster anti-mouse)单克 隆抗体，⑶4+(PE rat anti-mouse)单克隆抗体，Q)8+(PerCP rat anti-mouse)单克隆抗体 (BOSTER)，溶血素（Versalyse ? Lysing Solution)。
[0031] 1.3仪器
[0032] 紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器），流式细胞仪（BD FACSCcalibur TM)，超净工作台（AIRTECH)，倒置显微镜(Motic)，离心机(Thermo)，酶联免疫检测仪(BIORAD )， C02 培养箱 (Thermo) 。
[0033] 1.4动物分组及处理
[0034] 将60只健康小鼠随机分空白组、模型组、阳性组、胆茶碱组、化合物（I)组、胆茶碱 与化合物（I)组合物组，每组10只。空白组和模型组每天腹腔注射生理盐水〇. 2ml、阳性组每 天腹腔注射20g ? I^APS 0.2!111，胆茶碱组、化合物（1)组、胆茶碱与化合物（1)组合物组分别 每天腹腔注射胆茶碱20g ? I/1、化合物（I)20g ? I/1、胆茶碱与化合物（I)组合物【胆茶碱 l〇g ? I/1-化合物（I)10g ? LlOJml，连续7d;给药后d5~7，除空白对照组外其余各组每天 腹腔注射CTX 100mg ? kg一、
[0035] 1.5腹腔巨噬细胞功能及免疫器官指数检测
[0036] 按"1.4"处理，各组分别于给药后d7称重，并腹腔射5 %鸡红细胞0.5ml，8h后处死 小鼠，腹腔注入PBS 2ml，轻揉小鼠腹部lmin，吸取腹腔液体0.5ml于载玻片上在37 °C孵育 30min，1:1丙酮-甲醇液固定5min，Giemsa染色，每张涂片油镜下计数200个巨细胞，按以 下公式计算吞噬率和吞噬指数：
[0037] 吞噬率/% =(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞数）X 100% ;
[0038] 吞噬指数=(被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞数）+2。
[0039] 另取各组小鼠脾和胸腺称重，按以下公式计算：
[0040] 脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g);
[0041] 胸腺指数=胸腺重量(mg) /体重(g)。
[0042] 1.6数据统计分析
[0043]采用SPSS 19.0分析软件进行数据统计，方差分析组间差异。
[0044] 2、实验结果
[0045] 2.1对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞功能和免疫器官指数的影响
[0046]与空白组比较，模型组的各项指标均明显降低(P<0.01)。与模型组相比，阳性组 的黄芪多糖(APS)、胆茶碱组、化合物（I)组均能明显提高吞噬率和吞噬指数(P<0.05);与 模型组相比，胆茶碱与化合物（I)组合物组小鼠的吞噬率、吞噬指数、脾脏指数和胸腺指数 均明显升高(P<〇.〇l)。结果见表1。
[0047]表1对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞功能和免疫器官指数的影响
[0049] 上述结果表明，胆茶碱、化合物（I)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和免疫 器官指数，胆茶碱和化合物（I)联合使用可以进一步提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和 免疫器官指数，效果优于胆茶碱或化合物（I)单独作用效果，可以开发成提高免疫力的药 物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
[0050] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。对本发明技术方案进行修改或者等同替换不脱离本发明技术方案的实质和保护范 围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物α)，2. -种胆茶碱的药物组合物，其特征在于:包括胆茶碱、如权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的胆茶碱的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载体包 括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或 润滑剂。4. 根据权利要求2所述的胆茶碱的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、胶囊 剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓 剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将茵 陈粉碎，用85~95%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用70%乙醇洗脱 12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液，洗 脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用90%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备增强免疫力的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的胆茶碱的药物组合物在制备增强免疫力的药物中的应 用。
【文档编号】C07D301/32GK105820143SQ201610258328
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月23日
【发明人】吴珺
【申请人】吴珺