一种胰岛素类似物的化学合成方法
【专利摘要】本发明公开一种胰岛素类似物的化学合成方法，包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤，将胰岛素类似物的A链和B链分片段合成，第一个二硫键氧化时，将A链中Cys-Asn和B链先氧化在一起，由于Cys-Asn二肽价格低廉，分子间氧化时，二肽可大大过量，以提高分子间氧化效率，而在过量的氧化二肽，由于没有其他活性基团，可用强还原途径回收二肽，从而解决分子间二硫键氧化得率低的问题，通过片段缩合方法得到的AB链已经在一起的胰岛素前体，其结构与C链在的情况下的胰岛素类似，通过一定条件下的谷胱甘肽氧化-还原体系进行复性，得到得率很高的胰岛素。
【专利说明】
一种胰岛素类似物的化学合成方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种胰岛素类似物的化学合成方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，胰岛素为重要的内分泌激素，是治疗糖尿病的特效多肽激素化合物。而人胰岛素容易出现血糖波动、注射时间不灵活等问题，为了解决这些问题，科学家通过改变人胰岛素的分子局部结构，研发出了获得更佳作用时间和作用效果的胰岛素类似物。
[0003]现有胰岛素类似物的合成方法以发酵法和合成法为主，发酵法是通过发酵合成胰岛素原，再经还原复性，变成胰岛素前体，用蛋白酶切除C链，变成胰岛素，用化学合成的方法，加入修饰基团；缺点:由于胰岛素上有3个反应活性氨基，所以在加入修饰基团的时候，很容易把3个活性反应氨基同时修饰，导致产品的得率低、纯度低。
[0004]合成法:(I)胰岛素合成的最早方法是中科院合成的结晶牛胰岛素，常规的方法都是通过分别合成胰岛素的A链和B链，然后通过还原复性的方法形成胰岛素，但由于胰岛素的复性过程需要C链参与；缺点:在缺少C链参与的反应情况下，复性的产率极低，无生产价值；(2)后续改进了合成工艺，通过分别采用不同的保护基团保护胰岛素的6个半胱氨酸，然后采用一次脱保护的方法，形成3个二硫键；缺点:该方法合成胰岛素得率太低，没有实际生产价值，主要是因为3个二硫键通过化学方法氧化时需引入3种脱保护机制完全不同的保护基团，保护基团的价格昂贵，生产出来的产品成本高，另一方面，氧化过程需3次才完成，尤其在A链和B链二硫键环化的时候，由于是分子间环化，形成AA链、BB链、AB链的概率基本一致，造成得率偏低，虽然可以将AA链、BB链重新打开后再环化，但由于AA链和BB链都是大分子，在打开二硫键的同时会引入其它活性及软的修饰，导致最后的合成失效。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种得率高、纯度高、便于产业化生产的胰岛素类似物的化学合成方法。
[0006]本发明的技术方案为:
一种胰岛素类似物的化学合成方法，胰岛素类似物包括A链和B链，其中A链序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN, B 链序列为 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R) T，其合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤:
(O片段合成:将A链序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分别合成，B链序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T片段、FVNQHLCG片段分别合成，CN片段采用液相合成二肽Cys-Asn，GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成保护多肽Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH, SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 片段采用固相合成法合成N端保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保护多肽片段Boc-FVNQHLCG-COOH ；
(2)片段缩合:步骤(I)中Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T 游离的-SH和二肽Cys-Asn中游离的巯基通过二硫键氧化缩合成中间体1，中间体I和Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH通过酰胺键缩合成中间体2，中间体2通过脱保护剂脱去Fmoc之后再与Boc-FVNQHLCG-COOH缩合成中间体3，中间体3通过TFA脱去所有的保护基团得到膜岛素前体；
(3)还原复性:将步骤(2)中胰岛素类似物前体溶于谷胱甘肽的复性液中，复性1-5天，得到胰岛素类似物粗品；
(4)纯化:将步骤(3)得到的胰岛素粗品再经过HPLC纯化，得到高纯度胰岛素类似物。
[0007]优选的，其步骤(I)由以下步骤组成:
(al)用 Boc-Cys (Trt) -OH 和 Asn 液相合成二肽 Cys-Asn ；
(bl)提供一树脂作为固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保护的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，并用TFA裂解得到氨基端为Fmoc，侧链游离的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T ；
(Cl)提供一树脂作为固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保护的Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH 片段；
(dl)提供一树脂作为固相支持物，用FMOC固相合成方法合成全保护的Boc-FVNQHLCG-COOH 片段。
[0008]优选的，其步骤(2)由以下步骤组成:
(a2) N 端保护侧链游离的 Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 中游离的-SH 和 Cys-Asn中游离的巯基通过氧化剂氧化成二硫键，氧化缩合后的中间体I在反应液中析出，干燥后待用；
(b2)中间体I溶于DMF中，加入经步骤(cl)活化好的氨基端为保护基团Fmoc或Boc的GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，反应12小时，加水析出中间体2，经硅胶柱一次纯化，再加入一脱保护剂脱去保护基团Fmoc或Boc，经硅胶柱二次纯化；
(c2)中间体2溶于DMF中，加入经步骤(dl)活化好的氨基端为保护基团Fmoc或Boc的FVNQHLCG-C00H，反应12小时，加水析出中间体3，经硅胶柱进行纯化，再加入TFA脱去中间体3的所有保护基团，得到胰岛素前体。
[0009]优选的，步骤(2)氧化缩合过程中Cys-Asn与N端保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T 的摩尔比介于 5:1 与 500:1 之间。
[0010]本发明的有益效果:采用过量的二肽方法，将A链中Cys-Asn和B链先氧化在一起，由于Cys-Asn 二肽价格低廉，分子间氧化时，二肽可大大过量，以提高环化效率，而在过量的环化二肽，由于没有其他活性基团，可用强还原途径回收二肽，从而解决分子间环化得率低的问题。
[0011]通过片段缩合方法得到的AB链已经在一起的胰岛素前体，其结构与C链在的情况下的胰岛素类似，通过用生物合成是相似的谷胱甘肽还原复性方法，得到得率很高的胰岛素。
[0012]【具体实施方式】:
下面结合实施例对本发明作进一步说明: 当R= Myr时，表示该胰岛素类似物为地特胰岛素，其合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤:
(一)片段合成
(1)A链序列CN片段合成:
取46.4克BOC-Cys (trt)溶于I升DMF中，加入11.5克H0SU，搅拌5分钟，加入21克DCC,反应24个小时，过滤除去沉淀，加入10升冷水，析出产物，过滤干燥后，溶于I升DMF中；
取25克Asn，加入200ml水溶液，加入三乙胺调节PH=9，把ASN水溶液加入上述的I升DMF中，反应24个小时，加水析出沉淀，用硅胶柱纯化，得到44.5克的BOC-Cys (trt)-Asn，将44.5克BOC-Cys (trt)-Asn加入I升50%TFA 二氯甲烷溶液，反应2个小时，用乙醚沉淀得到20克二肽Cys-Asn ；
(2)A 链序列 BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY 片段合成:
取100克2-cl Trt树脂，用二氯甲烷溶胀后，加入溶于I升DMF中的Fmoc-Tyr(tbu)-0H138克，反应12个小时，用I升20%的哌啶DMF溶液，脱去Fmoc，取300克FMOC-Asn(trt) -0H,68克H0BTU61克TBTU，溶于I升DMF中，加入树脂，反应4个小时，用I升20%的呢啶 DMF 溶液，脱去 fmoc ;依次将 Fmoc-Glu (otbu) -0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Gln (trt) -0H、Fmoc-Tyr (tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Cys (trt)-OH、Fmoc-1le-0H、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Gln (trt) _0H、Fmoc-Glu (otbu) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-1le-OH 和 Fmoc-Gly-OH 缩合的树脂上，脱去Fmoc后，用110克B0C20溶于I升DMF中，加入树脂，反应24个小时；将树脂干燥后用5升3%TFA的二氯甲烷溶液，反应I个小时，得到143克全保护的多肽片段BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY ；
(3)B 链序列 SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Myr)T 片段合成:
取100克wang树脂，用二氯甲烷溶胀后，加入溶于I升DMF中的Fmoc-Thr (tbu)-OH200克、TBTU161克，反应12个小时，用I升20%的哌啶DMF溶液，脱去Fmoc ;取243克Fmoc-Lys (Myr)-OH^68克H0BTU61克TBTU,溶于I升DMF中，加入树脂，反应4个小时后用I升20%的哌啶DMF溶液，脱去Fmoc ;依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Tyr (tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Glu (otbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (trt) -OHn Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (otbu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (trt)-OH 和 Fmoc-Ser (tbu)-OH 缩合的树脂上，保留 Fmoc 基团；将树脂干燥后用5升TFA裂解溶液，反应2个小时，乙醚沉淀后，用HPLC纯化，得到侧链游离的的多肽片段 FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (Myr) T47 克；
(4)B链序列BOC-FVNQHLCG片段合成:
取100克2-cl Trt树脂，用二氯甲烷溶胀后，加入溶于I升DMF中的FM0C_Gly-0H89克，反应12个小时，用I升20%的哌啶DMF溶液，脱去Fmoc ;取293克Fmoc-Cys (trt)_0H、68克H0BT、161克TBTU，溶于I升DMF中，加入树脂，反应4个小时后用I升20%的哌啶DMF溶液，脱去 Fmoc ;依次将 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (trt)-OH、Fmoc- Gln(trt)-OH、Fmoc-Asn(trt )-0H、Fmoc-Val-OH 和 Fmoc-Phe-OH 缩合的树脂上，脱去 Fmoc 后，用 110 克 B0C20 溶于I升DMF中，加入树脂，反应24个小时；将树脂干燥后用5升3%TFA的二氯甲烷溶液，反应I个小时，得到53克全保护的多肽片段BOC-FVNQHLCG ；
(二)片段缩合
(I )CN 与 FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (Myr) T 分子间二硫键氧化，称取 20 克二肽 CN、10 克 FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (Myr) T，溶于 10mlDMF 中，加入 30mlDMS0，反应至无游离的FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Myr)T为止，过滤沉淀，干燥后得到11.6克中间体I ;
(2)取全保护片段BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH 9 克，溶于 500ml DMF 中，加入 DCCl克，H0SU0.9克，反应2个小时，过滤除去沉淀，将上清用水沉淀后干燥得到活化的全保护片段，将10克中间体I溶于200mlDMF中，加入三乙胺调节PH=9，加入活化好的全保护片段，反应24个小时，加水沉淀后干燥，用20%的哌啶脱去FM0C，用HPLC纯化，得到15克中间体2 ；
(3)取全保护片段BOC-FVNQHLCG-C00H 6克，溶于500ml DMF中，加入I克DCC、0.9克H0SU，反应2个小时候，过滤除去沉淀，将上清用水沉淀后干燥得到活化的全保护片段，将15克中间体2溶于200mlDMF中，加入三乙胺调节PH=9，加入活化好的全保护片段，反应24个小时，加水沉淀后干燥，用TFA剪切液裂解，用HPLC纯化，得到5.8克胰岛素类似物前体；
(三)还原复性
将5.8克胰岛素类似物前体溶于I升的谷胱甘肽复性液中，每隔12小时检测复性完成情况，直至复性完成；
(四)纯化
将复性完成的胰岛素类似物，用高效液相色谱，进行纯化，得到3.6克高纯度的胰岛素类似物-地特胰岛素，纯度为98.3%。
【主权项】
1.一种胰岛素类似物的化学合成方法，所述胰岛素类似物包括A链和B链，其中A链序列为 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN, B 链序列为 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，R 为脂肪酸及其类似物包括但不限于(C8，C1, C12，C14，C16，C18)，Rl-Glu (OH)-OH，其特征在于:合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤: (O片段合成:将A链序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分别合成，B链序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段、FVNQHLCG片段分别合成，所述CN片段采用液相合成二肽Cys-Asn，所述GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成全保护多肽 Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，所述 SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 片段采用固相合成法合成N端Fmoc保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，所述FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保护多肽片段Boc-FVNQHLCG-COOH ; (2)片段缩合:步骤(I)中Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T 游离的-SH 和二肽Cys-Asn中游离的巯基通过二硫键氧化缩合成中间体I，所述中间体I和Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH通过酰胺键缩合成中间体2，所述中间体2通过脱保护剂脱去Fmoc之后再与Boc-FVNQHLCG-COOH缩合成中间体3，所述中间体3通过TFA脱去所有的保护基团得到胰岛素类似物前体； (3)还原复性:将步骤(2)中胰岛素类似物前体溶于谷胱甘肽的复性液中，复性1-5天，得到胰岛素类似物粗品； (4)纯化:将步骤(3)得到的胰岛素粗品再经过HPLC纯化，得到高纯度胰岛素类似物。2.根据权利要求1所述的一种胰岛素类似物的化学合成方法，其特征在于:步骤(I)由以下步骤组成: (al)用 Boc-Cys (Trt) -OH 和 Asn 液相合成二肽 Cys-Asn ； (bl)提供一树脂作为固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保护的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，并用TFA裂解得到氨基端为Fmoc，侧链游离的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T ； (Cl)提供一树脂作为固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保护的Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH 片段； (dl)提供一树脂作为固相支持物，用FMOC固相合成方法合成全保护的Boc-FVNQHLCG-COOH 片段。3.根据权利要求1或2所述的一种胰岛素类似物的化学合成方法，其特征在于:步骤(2)由以下步骤组成: (a2) N 端保护侧链游离的 Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 中游离的-SH 和 Cys-Asn中游离的巯基通过氧化剂氧化成二硫键，氧化缩合后的中间体I在反应液中析出，干燥后待用； (b2)将步骤(a2)得到的中间体I溶于DMF中，加入经步骤(cl)活化好的氨基端为保护基团Fmoc或Boc的GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，反应12小时，加水析出中间体2，经硅胶柱一次纯化，再加入一脱保护剂脱去保护基团Fmoc或Boc，经硅胶柱二次纯化； (c2)将步骤(b2)得到中间体2溶于DMF中，加入经步骤(dl)活化好的氨基端为保护基团Fmoc或Boc的FVNQHLCG-C00H，反应12小时，加水析出中间体3，经硅胶柱进行纯化，再加入TFA脱去所述中间体3的所有保护基团，得到胰岛素前体。4.根据权利要求3所述的一种胰岛素类似物的化学合成方法，其特征在于:所述步骤(2)氧化缩合过程中Cys-Asn与N端保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T的摩尔比介于5:1与500:1之间。
【文档编号】C07K1/04GK105884879SQ201510037398
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】王宇
【申请人】漳州博欣生物技术有限公司