一种吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及应用
【专利摘要】本发明涉及将微生物合成方法与化学合成方法领域，具体涉及一种吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及应用,本发明中的通过微生物粘质沙雷氏菌Serratia marcescens y2发酵产生的三吡咯化合物，母环7位为甲氧基，3位为甲基和2位为戊烷基的灵菌红素（PG）。PG氟硼化后得到的荧光染料4,4?二氟?2?戊烷基?3?甲基?5?吡咯基?7?甲氧基?BODIPY可以透过细胞膜，进入细胞内特异染色细胞器。本发明获得荧光染料经生物合成与化学合成结合的方案，生产及环境成本低，荧光结构特异性，并可特异性进入穿透细胞膜染色细胞质中细胞器，不与细胞核结合，无细胞毒性可作为活细胞示踪荧光染料。CCTCC M 201617620160405
【专利说明】
一种吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及将微生物合成方法与化学合成方法紧密结合，将一种微生物的次级代 谢产物合成为生物学研究用的荧光染料，一种透过细胞膜，可以特异性结合动物细胞内细 胞器的无细胞毒性荧光染料。
【背景技术】
[0002] 灵菌红素具有低细胞毒作用，对肿瘤细胞作出多方面的攻击，浓度大于300nM时具 有明显的淋巴细胞抑制作用。灵菌红素对一系列的癌细胞，如肺，结肠，肾和乳房的癌细胞 系具有促凋亡作用。
[0003] 氟硼吡咯类化合物(B0DIPY)是一类具有刚性结构的有机化合物，因大部分化合物 具有较高的荧光量子产率，较窄的荧光发射光谱，较好的光热及化学稳定性，较小的分子 质量和较低的细胞毒性而促使科研工作者将其研制成化学传感器，荧光探针，长波荧光染 料等功能性物质。
[0004] 关于B0DIPY的化学合成方法已日益成熟，1988年，Richard等人利用吡咯醛缩合而 成，其他常用方法包括醛与吡咯缩合再氧化配位、酰氯或酸酐与吡咯的缩合配位、吡咯醛自 身缩合配位以及α、β不饱和酮硝化、成环再缩合，配位等。2012年，焦丽娟等人从吡咯醛 及吡咯出发合成一系列带有吡咯基的长波长氟硼二吡咯化合物，很大程度上简化了反应的 步骤。但以上合成反应无一例外在合成聚吡咯类骨架时都是以醛或吡咯醛类等有毒性有机 化合物为底物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于利用本发胆所提供的产灵菌红素的微生物粘质沙雷氏菌 ?Serraiia ?arcesce/3s y2出发，将生物合成与化学合成衔接，以y2为基础，尝试新型培养基 大量得到其次级代谢产物灵菌红素，最大限度提取后（1.1 g/L，柱层析产率）;本发明筛选 出最佳化学反应条件对其结构进行修饰，得到荧光染料吡咯基氟硼二吡咯化合物。在此过 程中，一步化学反应即可完成B0DIPY的合成，还不使用醛类化合物作为底物，减少了过程反 应中产物的损失，提高了整个过程产率，拓展了合成方法范围。核磁，质谱，红外确定其结构 后，将其应用于（胃癌BGC-823细胞株)细胞的染色，发现可以对细胞器进行荧光染色，且对 细胞无毒性。
[0006] 本发明涉及一株产红色素粘质沙雷氏菌y2 (保藏单位：中国典型培养物保藏中 心;保藏地址：中国武汉，武汉大学;保藏编号:CCTCC Μ 2016176;保藏时间：2016年4月5号， 分类命名为:粘质沙雷氏菌Sferraiia ?arcesce/3s y2)，及其产灵菌红素经一步化学反应生 成荧光染料B0DIPY(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基），该荧光染料具有特 征戊烷基，应用于肿瘤细胞染色能进行细胞膜，与细胞器结合，不与细胞核结合;无毒能用 于活细胞示踪观察。
[0007] 所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,其特征在于:其16 S序列： aggcgctgtcttacacgtgcggtcgagtggtagcacaagggagcttgctcttgggtgacgagcggcggatggg aaagtaatgtctgggaaactggctgatggagggggataactactgtaaacggtagctaagaccgcataacgtcgcaa gacctaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggc tcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactecta cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgagcttaatacgctcatcaattgacgttactcgcagaaga agcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag cgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagct agagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa ggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc acgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcc tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaataaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaac tctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcgctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct tatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgac gtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgttctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcga gagcaagcggacctcataaagtaagtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgcta gtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggg ttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctagcactttgat 所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2，其代谢生产灵菌红素的方法如下： 从保藏斜面培养基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化钙1.1 g/L，琼脂20 g/L)上挑取 单菌落，转接液体培养基(牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化钙1.1 g/L)，28 °C条件下以200 r/min的转速摇床培养24 h，按5%的接种体积另行扩大培养64 h，250 mL三角瓶培养基装液 量为100mL。固体培养在直径9 cm培养皿中进行，吸取种子培养液300 yL，涂布均匀，28 °C 培养24 h，最大得率。
[0008] 所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,其产生的灵菌红素的萃取方法： 将发酵液1000 Hz离心15 min，收集分为固液两相，分别加入50 ml乙醇超声助溶解5 min，再加入25 ml CH2CI2,最后加入25 ml水，待溶液分层后，萃取。
[0009] 当有机相再不能进行进一步的提取时，收集菌体再进行离心，萃取，重复几次直至 菌体接近无色。液体萃取同样进行萃取，薄层层析检测至无灵菌红素后结束萃取。有机相收 集干燥，减压蒸馏等得粗提物，整个过程应注意避光。
[0010]所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,其产生的灵菌红素的分离纯化方法： 湿法装柱，用CH2C12溶解灵菌红素粗提物直接上样。
[0011] 干法装柱，用CH2C12溶解灵菌红素粗提物，加入柱层析硅胶，减压除溶剂，得负载固 体，上样。洗脱剂为石油醚与二氯甲烷体积比为1/1的混合系，柱层析过程中，灵菌红素主要 产物呈鲜红色的条带，容易区分。得到的红色洗脱液于旋转蒸发仪中45°C减压浓缩，烘干 后-80°C冷冻过夜，随后冷冻干燥24h，置于_80°C冰箱中冻存备用。
[0012] 所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,以其产生灵菌红素一步化学反应生成荧光 染料B0DIPY条件： 反应过程:在lOOmL圆底烧瓶中加入灵菌红素（lmmol)，CH2C12 30mL，搅拌溶解或混合均 匀，再加入三乙胺1.4ml，反应混合物在-10°C下用注射器逐滴加入BF3'Et20 1.4ml，磁力搅 拌反应lOmin后，升温至30°C，反应4小时后结束，反应完成后加入蒸馏水淬灭，有机相用 Et20 (3 X 5mL)萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩除溶剂。柱层析纯化(CH2C12: PE=1: 10)得2(56%)。反应条件筛选，产物用高效液相检测：C18反相柱(Eclipse plus C18, 4.6 x 1 00mm)，液相条件(H2〇:CH3〇H:PH=2的磷酸缓冲溶液=15:80:5)，ti=2 · 4min，t2=12min。 [0013] 优化后反应条件:CH2C12为溶剂，Et3N与BF3'Et 20为10eq，在30°C下反应4小时为最 佳条件来合成目标化合物。
[0014]反应化学式见图2。 所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,以其产生灵菌红素化学反应所得的B0DIPY(化 合物2)结构特征:经核磁共振。^、々、^(^、质谱^工外与紫外光谱测试"亥化合物的结构鉴 定4,4_二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基，是具有立体结构的氟硼化合物（经 NMR、IR、LC-MS测试），1号氢与8号氢原子相关，化合物处于顺式，具有五烷基。
[0015]所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,以其产生灵菌红素化学反应所得的B0DIPY (化合物2 )用于细胞染色的方法： 离心收集细胞样品于1.5 ml离心管内，加入lml固定液重悬细胞，4°C固定10分钟或者 更长时间。离心去固定液，用PBS洗1遍，洗涤期间手动晃动。去上清，加入lml PBS或完全培 养液重悬细胞，再加入5ul浓度为lmg/ml B0DIPY置于37°C染色20-30分钟。离心去2染料，加 入50-100ul PBS重悬细胞，并去5-10ul滴于洁净载玻片上，盖上洁净盖玻片，尽量避免产生 气泡。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下检测。激发波长为340 nm，480 nnuUV下可持续 lmin,染色1.5 h小时即可持续30min分钟。
[0016]在荧光显微镜下观察，B0DIPY(化合物2)染色效果明显好于PG。但在荧光显微镜下 未能分辨出其染色部位。在激光共聚焦显微镜对其进行观察，三种波长下（560 nm、500 nm 和365 nm)，观察到B0DIPY(化合物2)对BGC-823的细胞器染色清晰;染色结果在能在显微镜 下看到明亮的红、绿、蓝色荧光。不特异性染色细胞核。
[0017] 所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,以其产生灵菌红素化学反应所得的B0DIPY (化合物2 )对细胞无毒，能用于细胞活性染色，示踪观察。
[0018] 不同浓度染色剂PG和B0DIPY(化合物2)对BGC-823细胞存活率的影响，采用 Biotool Cell Counting Kit_8 (CCK-8)试剂盒完成，0.0001-0.01 mg/ml作用浓度范围 内，作用时间为48小时，原反应物灵菌红素(PG)具有毒性，实验所选浓度范围内，随着作用 浓度增大，细胞存活率下降，浓度为〇. 〇lmg/ml时，细胞存活率只有4%;但B0DIPY(化合物2) 未显不毒性。
【附图说明】
[0019] 图1细菌培养时间产色素及存化后PG层析图（1，混合体系;2,培养时间72 h; 3， PG ) 图2反应化学式(其中反应物成分1为灵菌红素 PG;产物化合物2为荧光化合物B0DIPY) 图3条件筛选的液相图（表一 Entry 1) 图4条件筛选的液相图（表一 Entry 2) 图5条件筛选的液相图（表一 Entry 4) 图6化合物2的立体结构 图7化合物2的19F NMR，溶剂为CDC13 图8化合物2的1H NMR，溶剂为CDC13 图9化合物2的13C NMR，溶剂为CDC13 图10化合物2的NOESY图 图11化合物2的红外图 图12化合物2的LC-MS图· 图13化合物2的裂解图 图14荧光显微镜下化合物1(PG)对细胞的染色效果 图15荧光显微镜下化合物2对细胞的染色效果 图16激光共聚焦扫描显微镜下BODIPY2对细胞的染色效果 图17 PG和BODIPY(化合物2)对BGC-823细胞存活率的影响。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0021] 实施例1 (1)粘质沙雷氏菌yS^ei-raiia ?a_rcesce/3s y2)的分离鉴定： 本发明涉及一株产红色素粘质沙雷氏菌y2，由2007年5月从南京市郊田野麦田表面分 离获得，保藏在中国典型培养物保藏中心;保藏编号:CCTCC Μ 2016176;保藏时间：2016年4 月5号，分类命名为:粘质沙雷氏菌ferraiia ?arcescaos y2)，及其产灵菌红素经一步化学 反应生成荧光染料B0DIPY(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基），该荧光染料 具有特征戊烷基，应用于肿瘤细胞染色能进行细胞膜，与细胞器结合;无毒能用于活细胞示 踪观察。
[0022]所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌y2,其特征在于:其16 S序列： aggcgctgtcttacacgtgcggtcgagtggtagcacaagggagcttgctcttgggtgacgagcggcggatggg aaagtaatgtctgggaaactggctgatggagggggataactactgtaaacggtagctaagaccgcataacgtcgcaa gacctaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggc tcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactecta cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgagcttaatacgctcatcaattgacgttactcgcagaaga agcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag cgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagct agagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa ggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc acgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcc tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaataaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaac tctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcgctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct tatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgac gtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgttctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcga gagcaagcggacctcataaagtaagtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgcta gtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggg ttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctagcactttgat (2)粘质沙雷氏菌y2,其代谢生产灵菌红素的培养方法 从保藏斜面培养基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化钙1.1 g/L，琼脂20 g/L)上挑取 单菌落，转接液体培养基(牛肉膏18 g/L，蔗糖20g/L，氯化钙1.1 g/L)，28 °C条件下以200 r/min的转速摇床培养24 h，按5%的接种体积另行扩大培养64 h，250 mL三角瓶培养基装液 量为100mL。固体培养在直径9 cm培养皿中进行，吸取种子培养液300 yL，涂布均匀，28 °C 培养24 h(图1中1、2)。
[0023] (3)粘质沙雷氏菌y2产生的灵菌红素的萃取 将发酵液1000 Hz离心15 min，收集分为固液两相，分别加入50 ml乙醇超声助溶解5 min，再加入25 ml CH2CI2,最后加入25 ml水，待溶液分层后，萃取。
[0024]当有机相再不能进行进一步的提取时，收集菌体再进行离心，萃取，重复几次直至 菌体接近无色。液体萃取同样进行萃取，薄层层析检测至无灵菌红素后结束萃取。有机相收 集干燥，减压蒸馏等得粗提物，整个过程应注意避光。
[0025] (4)粘质沙雷氏菌y2产生的灵菌红素的分离纯化 湿法装柱，用CH2C12溶解灵菌红素粗提物直接上样。
[0026]干法装柱，用CH2C12溶解灵菌红素粗提物，加入柱层析硅胶，减压除溶剂，得负载固 体，上样。洗脱剂为石油醚与二氯甲烷体积比为1/1的混合系，柱层析过程中，灵菌红素主要 产物呈鲜红色的条带，容易区分。得到的红色洗脱液于旋转蒸发仪中45°C减压浓缩，烘干 后-80 °C冷冻过夜，随后冷冻干燥24 h，置于-80 °C冰箱中冻存备用（图1中3)。
[0027] (5)化学反应(反应式1)过程 在100 mL圆底烧瓶中加入1(1 mmol)，CH2Cl2 30 mL，搅拌溶解或混合均匀，再加入三乙 胺1.4 ml，反应混合物在-10 °C下用注射器逐滴加入BF3'Et20 1.4 ml，磁力搅拌反应10 min后，升温至30 °C，反应4小时后结束，反应完成后加入蒸馏水淬灭，有机相用Et20 (3X5 mL)萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩除溶剂。柱层析纯化(CH2C12: PE=1:10)得2(56%)。 反应条件筛选（图3);产物用高效液相检测:C18反相柱，Eclipse plus C18, 4.6 X 100mm (H2〇:CH3OH:PH=2的磷酸缓冲溶液=15:80:5)，ti=2.4 min，t2=12 min。
[0028] (6)反应物的量筛选过程 首先，我们对反应物的量进行筛选(表1);不添加催化剂三乙胺的话(Entry 5)，发现反 应不能进行，加入等摩尔的三乙胺与三氟化硼（Entry 1)反应几乎没有进行，加入10 eq (Entry 2)反应达到最好（图4)，但加入20 eq(Entry 3)时反应就开始有所降低。由此，我们 可以得出三乙胺作为吡咯氢的活化剂，需要和三氟化硼相同的量（10 eq)，才能使反应更好 的进行，单独升高或减少其中一个化合物的量(Entry 4、6)，都不能得到更高的产率。
[0029]反应式1 B0DIPY(化合物2)的合成方法(见图2) 表1不同反应物的量对产率的影响
[а] 由HPLC所得 (б) 反应温度、反应时间、溶剂的筛选(表2) 随后，我们进行了温度的筛选，在_l〇°C条件下(Entry 1)，不能反应，随着温度的升高， 产率也慢慢有所提高(Entry 2、3、4)(图5)，到30°C产率达到最高(Entry 5)。40 °C时产率 反而下降，杂质增多。在确定温度后又对反应时间进行筛选，得出最佳反应时间为4小时。太 短的反应时间反应产量比较低(Entry 7、8)反应时间延长至6小时(Entry 9)，产率反而有 所下降；特别是延长12小时(Entry 10)，而体系又不加密封时(Entry 11)，生成的氟硼化合 物竟然分解。在进行溶剂的筛选时，我们发现CH2C12较其它溶剂甲醇，Et 20，EA，CH3⑶CH3 (Entry 12、13、14、15、16)的产率高。最终，我们确定以〇12(：12为溶剂4七必与8? 3飞^0为10 eq，在30 °C下反应4小时为最佳条件来合成目标化合物。
[0030]表2反应条件的筛选
[a]由HPLC所得 实施例2 BODIPY(化合物2)的结构鉴定 与其他文献不同，我们得到的沙雷氏菌的次级代谢产物灵菌红素是支链为五烷基的灵 菌红素。在进行氟硼化后，我们甚至可以得到具有立体结构的氟硼化合物（图6)。分析结构 应用了 NMR、IR、LC-MS测试实验，如图7、8、9、10、11、12。就是说1号氢与8号氢原子相关，化合 物处于顺式(图6，裂解方式见13 )，该成分具有五烷基。
[0031] 实施例3: 染色应用 (1)染色方法 离心收集细胞（胃癌细胞株BGC-823)于1.5 ml离心管内，加入1 ml固定液重悬细胞，4 °C固定10分钟或者更长时间。离心去固定液，用PBS洗1遍，洗涤期间手动晃动。离心去上清， 加入lml PBS或完全培养液重悬细胞，再加入5ul浓度为lmg/ml B0DIPY(化合物2)置于37 °C染色20-30分钟。离心去染料，加入50-100 ul PBS重悬细胞，并去5-10 ul滴于洁净载玻 片上，盖上洁净盖玻片，尽量避免产生气泡，化合物PG的染色方法相同。荧光显微镜或激光 共聚焦显微镜下检测。
[0032] (2)染色条件优化 在筛选染色条件时，我们发现细胞与2染色10 min，在荧光显微镜UV照射下，不到10 s， 就完全淬灭。染色20 min时，UV下可持续1 min,染色1.5 h小时即可持续30min分钟以上，与 染色2 d效果基本一致。
[0033]如图15，在荧光显微镜，能清楚地观察它的染色效果（效果明显好于PG图14)。但在 荧光显微镜下我们不能分辨出其染色部位。于是，我们选择了激光共聚焦显微镜对其进行 观察，三种激发波长下（560 nm、500 nm和365 nm)，我们可以清楚地观察到其对细胞器进行 染色（图16)。
[0034] (3)PG和B0DIPY(化合物2)细胞毒性实验 不同浓度染色剂PG和B0DIPY(化合物2)对BGC-8 2 3细胞存活率的影响，采用 BiotoolCellCountingKit-8 (CCK-8)试剂盒完成，在 0.0001-0.01 mg/ml作用浓度范围 内，作用时间为48 h;原反应物灵菌红素（PG)具有毒性，实验所选浓度范围内，随着作用浓 度增大，细胞存活率下降，浓度为0.01 mg/ml时，细胞存活率只有4%;但B0DIPY(化合物2)未 显示毒性（图17)。该实验表明了本发明中的化合反应使得原反应物PG，这一对肿瘤细胞有 毒性的色素，经一步法反应生成的B0DIPY类化合物2，有了荧光染料的特征，其特征还体现 在该染料不但能透过细胞膜进入细胞，特异性染色细胞器，但不特异性着色细胞核;进一 步，其特征还体现在本发明生成的B0DIPY类化合物2又去除了原反应物PG的细胞毒性，具有 了新的活细胞示踪染料的特性。
【主权项】
1. 一株产红色素粘质沙雷氏菌ferraiia ?arcescaos y2，中国典型培养物保藏中心； 保藏编号:CCTCC M 2016176。2. 权利要求1所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌《Serraiia ?arcesce/3s y2,其产生的 色素灵菌红素经一步化学反应合成BODIPY类化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯 基-7-甲氧基-B0DIPY)的方法。3. 权利要求2所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌ferraiia ?arcesce/3s y2,其发酵产 生色素灵菌红素用SCN培养基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化钙1.1 g/L)最大产率1.1 g/L(柱层析产率)。4. 权利要求2所述的一株产红色素粘质沙雷氏菌《Serraiia ?arcesce/3s y2,其产生的 色素灵菌红素经一步化学反应合成BODIPY类化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯 基-7-甲氧基-B0DIPY)，其一步化学反应条件为：以CH 2Cl2为溶剂，催化剂Et3N与反应物 BF3'Et20为I Oeq，在30 °C下反应4小时。5. 权利要求2所述的BODIPY类化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧 基-B0DIPY)具有特征集团戊烷基，能特异性进入穿透细胞膜染色细胞质中细胞器，不染色 细胞核。6. 权利要求2所述的BODIPY类化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧 基-B0DIPY)对细胞无毒，用于活细胞示踪荧光染料的用途，用于观察细胞长期活动的实验。
【文档编号】C12R1/43GK105907660SQ201610217491
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月9日
【发明人】王飞, 罗海澜, 马翠云, 游颜杰, 赵丽芳
【申请人】漯河医学高等专科学校