用于生产高质量蛋白浓缩物和脂类的固态发酵系统和方法
【专利摘要】本发明描述了通过经由固态发酵(SSF)和混合?SSF将植物来源的材料转化为生物可利用的蛋白和脂类，产生高质量蛋白浓缩物(HQPC)和脂类的基于生物的方法，包括因此产生的此类HQPC和脂类作为营养物的用途，包括用作水产养殖食物中的鱼粉代替物的用途。还公开了SSF反应器以及使用所述反应器的方法。NRRL 5079320121130NRRL 5079220121130NRRL 5079420121130NRRL 5079520121130
【专利说明】用于生产高质量蛋白浓缩物和脂类的固态发酵系统和方法
[000。发明背景
[0002] 本研究根据合同DBI-1005068部分地在来自美国国家科学基金会（National Science Foundation)的政府支持下做出。政府在本发明中可享有一定权利。 发明领域
[0003] 本发明一般设及发酵方法，并特别地设及生产高质量蛋白浓缩物和脂类的固态发 酵(SSF)方法，包括SSF反应器、由其制备的产物，W及此类产物在营养饲料的配制中的用 途。
[0004] 背景信息
[0005] 在2008年，约28%的世界野生、海洋鱼类资源被过度开发，且52%被完全开发，正 如随着增加的人口，人均鱼类和贝类产物消耗的需求增加。随着野生鱼类资源的减少，为了 努力满足此需求的增加，商业水产养殖生产急剧增加。然而，用于水产养殖的食物制剂的主 要成分之一，鱼粉蛋白质，也是来源于野生捕拱渔业。据估计，到2012年将需要至少有 6.7mmt的鱼粉W支持商业水产养殖生产，且预期在未来几年运仅会增加。运显然是不可持 续的趋势。
[0006] 较低成本、更可持续的植物来源的蛋白质已用于在水产养殖食物中部分代替鱼 粉。脱脂大豆粉(SBM，42-48%的蛋白质）已普遍被用W在几个物种的生长食物中代替多达 总蛋白质的20%，而大豆蛋白质浓缩物(SPC，65%的蛋白）在较高的总蛋白质代替水平已被 成功地测试，很大程度上由物种的营养状态制约。运些大豆产物提供高蛋白质和相对良好 的氨基酸谱，但仍然缺乏由肉食性海洋鱼类所需的一些关键营养物(如牛横酸）dSPC可在相 比大豆粉较高的水平使用，主要因为用于产生SPC的溶剂提取方法除去了抗营养因子(如低 聚糖），且从而提高了蛋白质的生物利用度。此外，热步骤已被用于灭活热不稳定的抗原因 子。当前的溶剂提取方法的主要限制是其成本、缺乏在该工序中除去的低聚糖的使用、和质 量问题，常常限制内含物至食物中总蛋白质的50%。此外，从大豆材料向大豆粉或大豆蛋白 质浓缩物的加工可造成环境问题（例如，与处置用己烧提取相关的化学废物的问题），且当 预期总鱼粉代替时最终产物可需要用粗制的或精制的脂肪来补充。
[0007] 玉米副产物，包括干酒糟及可溶物（distiller's dried grain with solubles， 孤GS)，也已在水产养殖食物中W高达20%的鱼粉代替水平被评价。孤GS具有比大豆产物低 的蛋白质（28-32%)，及更多的纤维，但售价典型为脱脂大豆粉价值的~50%。一些乙醇工 厂已经合并了干法分馈(化y fractionation)方法W在转化方法之前除去部分纤维和油， 产生高达42%蛋白质的干馈(化y-frac)DDGS。虽然运种产物在水产养殖食物中已被用来代 替20-40%的鱼粉，仍需要更高的蛋白质、更易消化的DDGS水产养殖饲料产物。如果蛋白质 组分有较高水平的关键氨基酸，如赖氨酸、甲硫氨酸和半脫氨酸，运样的产物将是特别有吸 引力的。
[000引另外，微生物生物量来源的脂类组分被预期为多不饱和脂肪酸(PUFA)和omega-3 脂肪酸的生产中有吸引力的可再生资源，W补充高蛋白饲料，并在溶剂剥离期间作为植物 来源的脂类丧失的代替。可惜地，部分地由于包含高多締脂肪酸的真核微生物生长的有限 密度W及在实现合理生产力需要的高细胞浓度和较高溫度两者时的有限氧气可用性，生产 包含多締脂肪酸，且特别是高不饱和脂肪酸，诸如C18: 4n-3、C20: 4n-6、C20: 5n3、C22: 5n-3、 C22: 5n-6和C22: 6n-3的微生物脂类的成本仍然很高。
[0009] 固态发酵(SSF)可被用来培养用于代谢产物和/或微生物改变基质的微生物。SSF 被定义为微生物，通常是真菌在定义的气相中的固态基质上，但在游离水相的不存在下或 几乎不存在下的生长。过去的十年见证了对SSF用于生物方法开发的前所未有的兴趣，生物 方法诸如生物修复和有害化合物的生物降解、农工业剩余物的生物解毒、附加值产品诸如 生物活性次生代谢产物的生物制浆和生产，次生代谢产物包括抗生素、生物碱、植物生长因 子、酶、有机酸、生物表面活性剂、芳香化合物等。
[0010] 传统固态发酵方法技术已被证明对于适用于其中可需要严格无菌的现代生物技 术方法是困难和费力的。在托盘反应器中，死空间是生物反应器体积的约一半。因此，对特 定产品产量所需要的生物反应器尺寸在填充床中比在托盘生物反应器中显著更小，其使托 盘式生物反应器的效率更低。托盘生物反应器的操作还需要增加的人工劳动，由于每个托 盘必须单独地填充、排空和清洗。
[0011] 相比之下，填充床生物反应器通过倒入和倒出培养基易于填充和排空，且清洗也 简单。因此，填充床生物反应器比托盘生物反应器是更成本、劳动力和空间有效的。填充床 反应器中的缺点已确保均匀接种并保持最佳的解育条件。
[0012] 具有混合器的反应器已被开发用于现代SSF应用，但配备发动机的无菌混合装置 可W是非常昂贵的。当使用某些敏感载体时，混合中的机械性磨损还可损坏生长培养基的 通风、疏松结构。转筒反应器可仅对具有某种自由旋转结构的固态生长培养基提供充分混 厶 1=1 O
[0013] 即使新颖固态发酵仍使用复杂的、庞大培养基诸如用多种面粉补充的谷物巧粒来 进行。生长条件和产物形成的最佳控制可在更确定成分的培养基上实现，其中培养基可对 混合或完全浸没在液体中敏感。
[0014] 由于与液态深层发酵（SmF)相比的某些优势，存在对SS巧曽加的兴趣。此类优势包 括次级代谢产物诸如酶、芳香物质W及药物活性物质的有效产生，或者在脂类、蛋白、维生 素或其他营养产物的富集。然而，鉴于W上，对通过有效地利用由SSF提供的优势的方法生 成高质量蛋白浓缩物仍存在需求。
[001引发明概述
[0016] 本公开内容设及经由固态发酵(SSF)将植物材料转化成高度可消化的、浓缩的蛋 白源W及多不饱和脂肪酸(PUFA)的有机的、基于微生物的系统，包括单独的或与所述PUFA 组合的此类浓缩的源，该源适合于用作用于人食用化uman consumption)的动物的饲料，包 括固态发酵反应器及使用方法。此外，还公开了将液态深层发酵反应与SSF组合的方法。
[0017] 在实施方案中，公开了产生基于非动物的蛋白浓缩物的方法，所述方法包括接种 包含谷物巧粒、教、银屑、泥炭、油巧材料、木屑、及其组合的基本上干燥的基质;使所接种的 基质经历W微生物的固态发酵（SSF)，所述微生物包括出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans)、镶抱霉（Fusarium venenatum)、硬葡聚糖小核菌（Sclerotium glucanicum)、 少动銷氨醇单胞菌（S地ingomonas paucimobilis)、罗尔斯通氏菌（Ralstonia euhopha)、 深红红螺菌(I^hodospirillum rubrum)、伊萨酵母属物种（Issatchenkia S卵）、曲霉属物种 (Aspergi Ilus spp)、克鲁维酵母属物种化Iuyveromyces)和毕赤酵母属物种（Pichia S卵）、里氏木霉（Trichoderma reesei)、糖皮侧耳菌（Pleurotus OStreatUS)、根霉属物种 (化izopus spp)、及其组合;在小于约2至约3的抑或在大于约8的抑解育所接种的基质；并 回收所得的蛋白和微生物。
[0018] 在一个方面，该方法还包括混合微生物和基质W形成基本上稳定的小粒或巧料， 其中所述小粒或巧料在小粒或巧料之内和之间包含足够的空隙体积，W允许基本上没有揽 拌下稳定化的基质-微生物混合物的通风和加湿。
[0019] 在一个相关的方面，微生物是出芽短梗霉(A.pullulans)。
[0020] 在另一个方面，基质是未挤压的DDGS或未挤压的DDG。
[0021] 在一个实施方案中，公开了通过W上方法产生的蛋白浓缩物，其中浓缩物的蛋白 含量在约40%至约50%之间（基于干物质）。
[0022] 在另一个实施方案中，蛋白浓缩物被包含在组合物中，该组合物完全代替鱼饲料 中基于动物的鱼粉。
[0023] 在一个实施方案中，公开了产生基于非动物的蛋白浓缩物的方法，所述方法包括 形成原料和将原料转移至第一生物反应器;在水性介质中用至少一种微生物接种原料，其 中所述微生物将释放的糖转化为蛋白和胞外多糖并任选地将酶释放进主流体（bulk fluid)中；将液体与酸和任选地一种或更多种抗微生物剂混合;将另外的固体与混合物混 合W将混合物的水分水平减少至约40%至约60%并将所述减少水分的混合物转移至第二 生物反应器，其中混合物然后在第二生物反应器中解育足够的时间W将固体转化为所述蛋 白浓缩物。
[0024] 在一个方面，接种步骤在约30°C至约50°C进行约24小时。在另一个方面，混合另外 的固体步骤在约25 °C进行约5天。
[0025] 在一个相关的方面，微生物是真菌。在一个另外的相关的方面，真菌是出芽短梗 霉。
[0026] 在另一个方面，该方法包括用氮源补充接种物。在一个相关的方面，氮源包括硫酸 锭、尿素和氯化锭。
[0027] 在另一个方面，第二生物反应器是圆锥形或管状的。
[0028] 在一个方面，发酵在外源糖化酶的不存在下来进行。
[0029] 在一个实施方案中，公开了通过W上方法产生的蛋白浓缩物，其中蛋白含量是在 约50%至约60%之间（基于干物质）。
[0030] 在另一个实施方案中，公开了包含W上蛋白浓缩物的组合物，该组合物完全代替 鱼饲料中基于动物的鱼粉。
[0031] 在一个实施方案中，公开了产生多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括接 种包含作为提供的或通过添加的低PUFA脂类的基质，其中所述基质包括谷物巧粒、教、银 屑、泥炭、油巧材料、木屑、糖浆及其组合;使接种的基质经历W微生物的固态发酵(SSF)，所 述微生物包括腐霉属（P}fthium)、壶菌属（Thraustochytrium)和裂殖壶菌属 (Schizoch^ri皿）、及其组合;解育所接种的基质。
[0032] 在一个相关的方面，该方法还包括添加所得的PUFA提高的材料作为动物饲料中的 成分或可选地回收所得的PUFA提高的脂类。
[0033] 在另外的相关方面，公开了 W上方法的产物，其中组合物的脂类具有约50-90% = 酷甘油含量。
[0034] 附图简述
[0035] 图1示出了SSF反应器的示意图。
[0036] 图2示出了在第112天的相对生长、饲料转化率、富尔顿丰满系数（Fulton'S Condition hctorKK)和内脏体指数(Visceral Somatic Index)(VSI)平均值。字母表示 食物处理之间的显著差异且误差条代表平均值标准误差(SEM)。
[0037] 发明详述
[0038] 在描述本发明组合物、方法和方法论前，应当理解，此发明并不局限于描述的特定 的组合物、方法和实验条件，因为运样的组合物、方法和条件可W变化。也是可W理解的是， 本文所使用的术语仅是为了描述特定实施方案，并非意图限制，因为本发明的范围将仅由 所附的权利要求书限定。
[0039] 如此说明书和所附权利要求书中使用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式 "一 (a)"、"一 (an)"和"该(the)"包括复数指代对象。因此，例如，提及的"一种脂类"包括一 种或更多种脂类，和/或本文所描述的该类型的组合物，对于本领域技术人员在阅读本公开 内容后其将变得明显、等等。
[0040] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有由本发明所属领域的普 通技术人员所通常理解的相同的含义。类似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和 材料可W在本发明的实践或试验中使用，因为将会理解，修改和变化都被涵盖在本公开内 容的精神和范围内。
[0041 ]如本文所用，。约（about)"、。大约（a卵roximately)"、。基本上（substantialIy)" 和"显著（significantly)"将由本领域的普通技术人员理解，且将会取决于它们被使用的 上下文在一定程度上变化。如果其中其被使用的上下文中对本领域普通技术人员该术语的 使用是不清楚的，"约"和"大约"意味着对特定术语加或减《10%，且"基本上"和"显著"意 味着对特定术语加或减>10 %。
[0042] 如本文所用，"基本上由…组成"意指特定组分，并可包括其他组分，该其他组分不 改变所述特定组分的新颖特性或方面。
[0043] 如本文所用，术语"动物"是指属于动物界的任何生物体，且包括但不限于，人类、 鸟类(例如家禽）、哺乳动物(如牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、小鼠和马似及水产养殖生物，如 鱼(如縛鱼、娃鱼、驴鱼）、软体动物(如始)和甲壳类动物(如龙邮和邮）。
[0044] 术语"鱼类"的使用包括所有脊椎动物鱼类，其可W是硬骨(硬骨鱼)或软骨(软骨 鱼)鱼物种。
[0045] 如本文所用的"基于非动物的蛋白质"是指包括至少0.Slg粗纤维/100g组合物(基 于干物质）的蛋白质浓缩物，粗纤维是作为植物物质的化学分析的残渣获得的主要是纤维 素、半纤维素和木质素的材料。
[0046] 如本文所用，"解育方法"是指用于细菌或细胞的生长和发育的适当条件的规定， 其中运样的细菌或细胞使用生物合成途径W代谢各种饲料原料。在实施方案中，例如，解育 方法可在有氧条件下进行。在其它实施方案中，解育方法可包括厌氧发酵。
[0047] 如本文所用，术语"解育产物"是指从解育方法/反应直接得到的任何剩余物质。在 某些情况下，解育产物含有微生物使得其相比缺乏运样的微生物的解育产物具有增强的营 养物含量。解育产物可含有来自解育肉汤(broth)的适合成分。例如，解育产物可包括来自 解育肉汤的溶解的和/或悬浮的成分。悬浮的成分可包括未溶解的可溶成分(如，其中溶液 是一种或多种组分过饱和的）和/或存在于解育肉汤中的不溶性材料。解育产物可包括在解 育结束时存在的基本上全部干物质(例如，通过喷雾干燥解育肉汤、和通过培养产生的生物 质），或可包括它们的一部分。解育产物可包括来自解育的粗材料，其中微生物可被分级和/ 或部分纯化，W增加材料的营养物含量。
[0048] 如本文所用，"转化培养"是指包含在培养基中的微生物的培养，所述培养基包括 足W使微生物生长的材料，例如，水和营养物质。术语"营养物"是指任何具有营养价值的物 质。它可W是动物饲料或用于动物的食品补充剂的一部分。示例性的营养物包括但不限于 蛋白质、肤、脂肪、脂肪酸、脂类、水和脂溶性维生素、必需氨基酸、碳水化合物、酱醇、酶、功 能有机酸和微量矿物质，例如，憐、铁、铜、锋、儘、儀、钻、舰、砸、钢、儀、氣、饥、锡和娃。
[0049] 转化是在适合转化蛋白质/碳水化合物/多糖材料的条件下，培养转化培养中的微 生物的过程，例如，大豆材料转化为高品质的蛋白质浓缩物。适当的转化是指，利用90%或 更多的特定的碳水化合物，产生微生物细胞量(cell mass)和/或蛋白或脂类。在实施方案 中，转化可W是需氧或厌氧的。
[0050] 如本文所用"絮凝剂"或"清除剂"是通过凝聚促进胶体离开悬浮液的化学物质，且 包括，但不限于，多价离子和聚合物。在实施方案中，运样的絮凝剂/清除剂可包括生物絮凝 剂如胞外多糖。
[0051 ]如本文所用，"混合固态发酵"指两步骤方法，包括第一步骤，其中SMF或液态深层 发酵(在水性介质中）在微生物的存在下进行约24小时W构建细胞数目作为接种物的源，包 括其中所接种的微生物产生胞外酶，将所述酶释放进主流体中，且其中细胞和酶两者可用 于与下一步骤的固体的反应，该下一步骤包括将W上液体与另外的酸和抗微生物剂(任选 地)连同足够固体共混，W将混合物的水分水平减少至约40%至约60%，其中后者变成用于 在SSF反应器中解育的固相状态。在实施方案中，15%固相液态深层运行24小时，随后是添 加固体W使固态基质成为50%固体，其中后者在该状态下运行5天。
[0052]大量的植物蛋白质来源可与本公开内容组合使用作为用于转化的饲料原料。在饲 料工业使用植物蛋白质的主要原因是替代更昂贵的蛋白质来源，例如动物蛋白质来源。另 一个重要的因素是通过饲养动物蛋白质至相同物种的动物的传播疾病的危险。植物蛋白质 来源的实例包括，但不限于，来自W下的蛋白质：豆科(Fabaceae)植物，如大豆和花生所示 例的，来自十字花科(Brassiciaceae)植物，如油菜、棉巧所示例的，菊科(Asteraceae)植 物，包括但不限于向日葵，和栋桐科(Arecaceae)植物，包括挪子核。运些蛋白质来源，也通 常被定义为油料种子蛋白质，可完整地用于饲养，但其更通常作为油已被除去后的副产物 饲养。其它植物蛋白来源包括来自W下的植物蛋白质来源:禾本科(Poaceae),也被称为禾 本科(Gramineae),像谷类和谷物特别是玉米、小麦和水稻或其它主要作物如马铃馨、木馨 和豆科植物(魏豆类(peas)和菜豆属植物(beans))，一些研磨副产物包括胚芽粉或玉米蛋 白粉、或蒸馈/酿酒副产物。在实施方案中，蛋白质的饲料原料包括，但不限于，来自W下的 植物材料:大豆、花生、油菜巧、大麦、油菜、芝麻、棉巧、栋桐仁、葡萄巧、橄揽、红花、向日葵、 挪子核、玉米、挪子、亚麻巧、棲子、小麦、水稻、马铃馨、木馨、豆科植物、亚麻芥巧、芥菜巧、 胚芽粉、玉米蛋白粉、蒸馈/酿酒副产物、及其组合。
[0053] 在鱼类养殖业，据报道使用的植物来源的主要鱼粉代替物包括，但不限于，大豆粉 (SBM)、玉米蛋白粉、油菜巧/油菜(芸苔属(Brassica))粉、羽扇豆(羽扇豆属化upinus))，像 去壳的白（白羽扇豆化upinus a化US))、甜（狭叶羽扇豆化.日11邑1131:1的1;[113))和黄（黄羽扇 豆化.11116113))羽扇豆核粉中的蛋白质、向日葵（向日葵化611曰]11：11118曰]1]1叫13))种子粉、结 晶氨基酸；W及魏豆粉(魏豆(Pis皿sativum))、棉巧(棉属(Gossypium))粉、花生(花生;落 花生(Arachis hypogaea))粉和油渣饼、大豆蛋白质浓缩物、玉米(玉米(Zea mays))蛋白粉 和小麦（小麦（Triticum aestivum))谷蛋白、马铃馨（马铃馨（Solanum tuberosum L.))蛋 白质浓缩物W及其它植物饲料如辣木(辣木(Moringa Oleifera Lam.))叶，都W各种浓度 和组合。
[0054] 蛋白质来源可W是未经处理的植物材料的形式和处理和/或提取的植物蛋白质的 形式。作为实例，热处理的大豆产物具有高的蛋白质消化率。
[0055] 蛋白质材料包括任何类型的蛋白质或肤。在实施方案中，可W使用大豆材料或类 似材料，如全大豆。全大豆可W是标准的、商品化的大豆；W某种方式已被转基因（GM)的大 豆;或非GM身份保留的大豆。示例性的GM大豆包括，例如，被工程化W产生除了水苏糖和棉 子糖外的碳水化合物的大豆。示例性的非转GM大豆包括，例如，为了低碳水化合物、低脂肪 且低膜蛋白酶的抑制选育的Schi 11 inger品种化merge)。
[0056] 其他类型的大豆材料包括大豆蛋白质粉、大豆蛋白质浓缩物、大豆粉、和分离大豆 蛋白质，或其混合物。全大豆向其它形式的大豆蛋白，如大豆蛋白质粉、大豆蛋白质浓缩物、 大豆粉、和分离大豆蛋白质的传统加工，包括裂化清洁的、生的全大豆为数块，典型地六(6) 至八(8)块，产生大豆片和壳，然后将壳除去。然后将大豆片置于大约60°C，并片成约0.25毫 米厚。然后W惰性溶剂，如控类溶剂，通常是己烧，在多种类型的逆流提取系统之一中提取 所得到的薄片，W除去大豆油。对于大豆蛋白质粉、大豆蛋白质浓缩物、和分离大豆蛋白质， 重要的是，薄片W最大限度地减少蒸煮或烘烤大豆蛋白质的量W保持水溶性大豆蛋白质的 高含量的方式被脱溶剂。运通常是通过使用蒸气脱溶装置或急骤脱溶装置（flash desolventizers)完成的。从该过程获得的薄片，一般称为"食用脱脂薄片"或"白大豆（豆） 薄片'。
[0057] 白大豆薄片是大豆蛋白质粉、大豆蛋白质浓缩物、和分离大豆蛋白质的起始原料， 具有约50%的蛋白质含量。白大豆薄片然后被粉碎，通常在开环研磨系统中，通过键式粉碎 机、级分粉碎机、滚筒粉碎机或冲击销粉碎机首先粉碎成粗粉，并W另外的研磨，成为具有 所需的颗粒尺寸的大豆粉末。通常使用筛选W排列产物尺寸至均匀的粒径范围，并可W W 振动筛或圆筒状离屯、筛完成。其它油料种子可W W类似的方式被加工。
[0化引在实施方案中，干酒糟及可溶物(DDGS)可被使用。DDGS目前通过玉米乙醇工业来 审IJ成。传统的DDGS来自干磨设施，其中整个玉米粒被研磨和加工。在运些设施中的DDGS(例 如，"前端"发酵)通常包含28-32%的蛋白W及约9%至约13%之间的粗脂肪。然而，在"后 端"油提取中，在产生相对于没有油提取产生的DDGS具有轻微更多的蛋白和纤维的"减少的 油"DDGS(包含约5%至约9%粗脂肪)之前，约1/3的玉米油从例如，酒糟水(thin stillage) 来提取。在相关的方面，减少的油或传统的DDGS可被使用。
[0059] 蛋白质来源可W是W未经处理的植物材料的形式和处理和/或提取的植物蛋白质 的形式。作为实例，热处理的大豆产物具有高的蛋白质消化率。尽管如此，即使热不稳定抗 营养因子被排除，包含在食肉鱼的食物中的全脂或脱脂大豆粉的上限包含水平是在20到 30%的包含水平之间。在鱼类中，大豆蛋白质已经显示，W超过30%的蛋白质浓度包含水平 饲养鱼类造成肠道损伤，且通常减少不同的鱼种的生长表现。事实上，由于运些影响，大多 数养养殖户不愿意在总食物中使用多于10%的植物蛋白。
[0060] 本发明解决了运个问题，并允许植物蛋白质包含水平高达40%或甚至50%，运取 决于，除了其他因素W外，被饲养的动物物种、植物蛋白质来源的源头、不同植物蛋白质来 源的比例、蛋白质浓度、和葡聚糖和/或甘露聚糖的量、源头、分子结构和浓度。在实施方案 中，植物蛋白质包含水平高达40 %、优选高达20 %或30 %。通常存在于食物中的植物蛋白质 是介于5%和40%之间，优选在10%或15%和30%之间。运些百分比界定在动物饲料或食物 中的总植物蛋白质来源的百分比量，运包括脂肪、灰分等。在实施方案中，纯蛋白质水平高 达50%、典型地高达45%、在实施方案5-95%。
[0061] 在总饲料或食物中的植物蛋白质对其它蛋白质的比例可W是5:95至95: 5、15:85 至50:50、或25:75至45:55。
[0062] 微生物
[0063] 本公开内容的微生物必须能够在转化培养中将碳水化合物和其它营养物质转化 为高品质的蛋白质浓缩物。在实施方案中，微生物是酵母样真菌。酵母样真菌的实例是出芽 短梗霉菌。其它实例微生物包括酵母，例如克鲁维酵母和毕赤酵母、乳酸菌、里氏木霉、糖皮 侧耳、根霉，和许多类型的木质纤维素降解微生物。一般地，示例性的微生物包括那些能代 谢水苏糖、棉子糖、木糖及其它糖的微生物。然而，根据公开的方法选择其它合适的微生物 是本领域技术人员的能力范围内的，无需过多实验。
[0064] 在实施方案中，可在本方法中使用的微生物有机体包括但不限于，出芽短梗霉菌、 镶抱霉、硬葡聚糖小核菌、少动銷脂单胞菌、罗尔斯通氏菌、深红红螺菌、伊萨酵母属物种、 青霉属物种(Penicillium SPP)、克鲁维酵母和毕赤酵母、里氏木霉、糖皮侧耳、根霉，及其 组合。在实施方案中，微生物是出芽短梗霉菌。
[0065] 在实施方案中，出芽短梗霉菌适于在转化过程中遇到的各种环境/压力源。在实施 方案中，表示为NR化保藏号50793，根据布达佩斯条约的条款于2012年11月30日保藏在美国 农业研究菌种保藏中屯、（Agricultural Research Culture Collection,NRRL) ,Peoria, 111.的出芽短梗霉菌菌株，表现出较低的胶状物产生，并且适合于基于DDGS和SBM的培养 基。在实施方案中，表示为NR化保藏号50792，根据布达佩斯条约的条款于2012年11月30日 保藏在美国农业研究菌种保藏中屯、(NRRL) ,Peoria,111.的出芽短梗霉菌菌株，适用于高浓 度的抗生素四环素（例如，从大约75μg/ml四环素至约20化g/ml四环素）。在实施方案中，表 示为NR化保藏号50794,根据布达佩斯条约的条款于2012年11月30日保藏在美国农业研究 菌种保藏中屯、（NRRL) ,Peoria, 111.的出芽短梗霉菌菌株，适用于高浓度的抗生素 LACT及OL⑥（例如，从约化g/ml维吉霉素至约化g/ml维吉霉素）。在实施方案中，表示为 NR化保藏号50795,根据布达佩斯条约的条款于2012年11月30日保藏在美国农业研究菌种 保藏中屯、(NRRL)，Peoria，111.的出芽短梗霉菌菌株，适应于浓缩的玉米可溶物。
[0066] 在其他实施方案中，出芽短梗霉菌株可适应于450-55化pm LACTROL⑩（例如， 维吉尼霉素）。在实施方案中，出芽短梗霉菌株可适应于抑1.5-1.75。在实施方案中，出芽 短梗霉菌株可适应于90-110ppm Isostab。在实施方案中，出芽短梗霉菌株可适应于80- IOOppm Betastab。在实施方案中，出芽短梗霉菌株可产生纤维素酶，并且可适应于大豆粉 和DDGS。在实施方案中，出芽短梗霉选自NRRL 42023、NRRL 58522或Y-2311-1。
[0067] 在其他实施方案中，耐溫毕赤酵母(Thermotolerant Pichia)菌株可适应于大豆 粉和DDGS。
[006引在实施方案中，伊萨酵母属物种（Issatchenkia SPP)菌株可适应于大豆粉和 DDGSo
[0069] 在实施方案中，镶抱霉菌株可产生纤维素酶，并且可适应于大豆粉和孤GS。
[0070] 在其他实施方案中，青霉属物种菌株可产生纤维素酶，并且可适应于大豆粉和 DDGSo
[0071 ] 在实施方案中，米曲霉(Aspergillus orzyae)菌株可适应于大豆粉和DDGSo
[0072] 在实施方案中，能够产生包含omega-3和/或omega-6多不饱和脂肪酸的脂类的微 生物包括能够产生DHA的那些微生物。在一个相关的方面，此类生物体包括海洋微生物，例 如藻类，诸如目破囊壶菌目（Thraustochytriales)的破囊壶菌（Thraustochytrids)，更具 体地是属壶菌属和裂殖壶菌属的破囊壶菌目，包括在其的公开内容通过引用W其整体并入 的美国专利号5，340，594和5，340，742中公开的破囊壶菌目。然而，应当理解，本发明作为一 个整体，不意图被如此限制，且本领域技术人员将认识到本发明的概念将可适用于根据本 文讨论的技术产生多种其他化合物包括其他脂类化合物的其他微生物。
[0073] 如本文所用的"脂肪酸"意指脂肪族单簇酸。公认脂类是脂肪或油，包括脂肪酸的 甘油醋连同相关的憐脂、酱醇、醇、控、酬和相关化合物。
[0074] 通常采用的速记系统在本公开内容中被使用来表示脂肪酸的结构(例如，Weete," Lipid Biochemistry of Fungi and Other Organisms". Plenum Press,New York (1980))。该系统使用，字母"C"连同指示碳在控链中的数目的数字，随后是冒号和指示双键 的数字，例如，C20:5，二十碳五締酸。脂肪酸从簇基碳开始编号。双键的位置通过添加希腊 字母delta( A )随后是双键的碳数目来表示；即，C20:5omega-3 A s's'ii'M'i7。"omega"符号是 不饱和脂肪酸的速记系统，其中从簇基末端碳编号被使用。为方便起见，《3将被用来代表 "omega-3"，特别地当使用本文描述的数值速记命名法时。omega-3高不饱和脂肪酸被理解 为聚乙締脂肪酸，其中最后締键是来自脂肪酸的末端甲基基团的3个碳原子并包括脂肪酸 的末端甲基基团。因此，对于二十碳五締酸的完整命名法，omega-3高不饱和脂肪酸将是 C20:5?3A5'8'll'l4'l7。为简洁起见，双键位置（A 5'8'll'l4'l7)将被省略。二十碳五締酸然后被 命名为C20:5 O 3，二十二碳五締酸(C22:5 O 3 A 7'1〇'13'16'19)是〔22:5?3，^及二十二碳六締 酸似2:6?3么4'7'"'13'16'")是〔22:6"3。术语"高不饱和脂肪酸"意指具有4个或更多个双 键的脂肪酸。"饱和脂肪酸"意指具有1个至3个双键的脂肪酸。
[0075] 用于产生omega-3高不饱和脂肪酸的生物体的可期望的特征包括，但不限于那些： 1)能够异养生长;2)高含量的omega-3高不饱和脂肪酸；3)单细胞;4)低含量的饱和脂肪酸 W及omega-6高不饱和脂肪酸;5)耐热（在30°C W上的溫度生长的能力）；W及6)广盐性(能 够在宽范围盐度包括低盐度内生长）。
[0076] 脂类可包括W下化合物中的一种或更多种:利普司他汀、他汀类、TAPS、匹马霉素、 制霉菌素、脂溶性抗生素(例如，莱特洛霉素)脂溶性抗氧化剂(例如，辅酶QIO)、胆固醇、植 物酱醇、24-脱氨胆固醇、生育S締酪、生育酪、类胡萝h素或叶黄素类，例如e-胡萝h素、叶黄 素、番茄红素、邮青素、玉米黄素或角黄素，脂肪酸，诸如共辆亚油酸或多不饱和脂肪酸 (PUFA)。在实施方案中，脂类包含在约5wt. %或至少约IOwt. %(相对于该脂类的重量)的浓 度的W上提及的化合物中的至少一种。
[0077] 包含例如甘油S醋、憐脂、游离脂肪酸、脂肪酸醋(例如、甲基醋或乙基醋)和/或其 组合的脂类可被获得。在实施方案中，脂类具有至少约50%、至少约70%或至少约90%的= 酷基甘油含量。
[0078] 在实施方案中，脂类包含多不饱和脂肪酸（PUFA)，例如具有至少18个碳原子的 PUFA，例如Cis、C20或C22PUFA。在实施方案中，PUFA是omega-3PUFA( ? 3)或omega-6PUFA( ? 6)。在相关方面，PUFA具有至少3个双键。在实施方案中，PUFA是:二十二碳六締酸(DHA，22:6 W 3); 丫-亚麻酸（GLA, 18:3 W 6);日-亚麻酸（ALA, 18:3 W 3);二高-丫-亚麻酸（d;Lhom〇- 丫- Iinolenic 日。1(1)(061^\，20:3?6);花生四締酸(41?4,20:4?6);^及二十碳五締酸化口八， 20:5 ? 3)。
[00巧]在实施方案中，脂类包含在约5wt. %，例如至少约IOwt. %，例如至少约20wt. % (相对于该脂类的重量)的浓度的至少一种PUFA(例如ARA或DHA)。
[0080] PUFA可呈（单、双或S)甘油醋、憐脂、游离脂肪酸、脂肪酸醋（例如、甲基醋或乙基 醋)和/或其组合的形式。在一个相关的方面，脂类被获得，其中所有PUFA的至少约50%呈甘 油S醋形式。
[0081 ]脂类可W是油或脂肪，例如包含PUFA的油。
[0082] 细胞可W是包含脂类的任何细胞。通常，细胞已经产生脂类。细胞可W是完整细胞 或破裂的细胞。细胞可W是任何适合的起源。细胞可W是例如植物细胞，例如来自种子的细 胞或微生物的细胞(微生物细胞或微生物）。微生物细胞或微生物的实例是酵母细胞、细菌 细胞、真菌细胞W及藻类细胞。在实施方案中，可使用真菌，例如，诸如毛霉目（Mucorales), 例如被抱霉属(Mortierella)、须霉属(Phycomyces)、布拉霉属(Blakeslea)、曲霉属、壶菌 属、腐霉属或虫霉属化ntomophthora)。在实施方案中，花生四締酸（ARA)的来源可来自 Mortierella 曰相1]1曰三抱布拉霉（Blakeslea trispora)、上曲霉（Aspergillus terreus) 或诡橘腐霉(P5^thium insidiosum)。藻类可W是甲藻(dinoflagellate)和/或包括紫球藻 属(Po巧hyridium)、菱形藻属(化tszchia)，或隐甲藻属(Ciypthecodinium)(例如寇氏隐甲 藻（Crypthecodinium cohnii))。酵母可包括属毕赤酵母属（Pichia)或酵母属 (Saccharomyces)的那些，诸如Pichia ciferii。细菌可W是属丙酸菌属 (Propioni^bacterium)。包含脂类的植物细胞的实例是来自大豆、油菜巧、油菜、向日葵、挪 子、亚麻和栋桐巧的细胞。在实施方案中，细胞是包含脂类的植物细胞，该脂类包含ARA。在 实施方案中，如所公开的细胞可单独或组合使用。
[0083] 在实施方案中，细胞在发酵中使用。
[0084] 在实施方案中，根据本公开内容的方法包括W下步骤中的一个或更多个：（i)加热 或己氏灭菌细胞；（ii)通过机械分离从所述细胞分离水；（iii)洗涂所述细胞；W及（iv)挤 压所述细胞。
[0085] 加热或己氏灭菌可在从约65°C至约120°C的溫度来实现。它可灭活或变性酶诸如 脂酶和/或脂氧合酶。
[0086] 通过机械分离从细胞分离水可被用来获得如本文公开的水含量和/或干物质含量 的值。机械分离可例如包括过滤、离屯、、挤压、沉淀或使用水力旋流器。
[0087] 脂类还可W W任何适合的方式被处理。如果脂类通过用溶剂提取来回收，脂类可 从溶剂通过蒸发溶剂来获得。
[0088] 通过根据本公开内容的方法获得的或可获得的脂类可经历进一步处理，例如酸处 理(还称为脱胶）、碱处理(还称为中和）、脱色、脱臭、冷却(还称为冬化）。
[0089] 通过根据本公开内容的方法获得的或可获得的脂类具有许多用途。它可W例如用 于制备食品产品，例如人类食物产物(例如，婴儿配方食品），或动物饲料产品。它还可被用 于制备药物产品或美容产品。因此，本公开内容还提供了包含通过根据本公开内容的方法 获得或可获得的脂类的食物产品（例如，强化食品或营养补充剂），例如人类食物产品（例 如，婴儿配方食品）、或动物饲料产品、药物产品、美容产品。
[0090] 转化培养
[0091] 在示例性的实施方案中，预处理后，蛋白质材料(如挤压的大豆白薄片）可W至少 约5%的固体加载率与水混合，调节pH至约4.5-5.5。然后可加入合适剂量的水解酶，且浆料 在约50°CW约50-250rpm揽拌解育约3-24小时。冷却至35°C后，可W添加出芽短梗霉菌的接 种物，且培养物可再解育72-120h，或直至碳水化合物被消耗。在解育过程中，无菌空气可W W约0.5-1L/LA的速率被喷射到反应器中。在实施方案中，转化培养物经过与大豆材料解 育少于约96小时的转化。在实施方案中，转化培养物将解育约96小时和约120小时之间。在 实施方案中，转化培养物可解育多于约120小时。转化培养物可在约35 °C下解育。
[0092] 在实施方案中，当经历转化时，转化培养物的pH可为约4.5至约5.5。在实施方案 中，转化培养物的pH可W小于4.5 (例如，在pH 3)。在实施方案中，可对转化培养物主动地充 气，女日在Deshpande等人，AureobasidiumpulIulans in applied microbiology:A status repOTt,Enzyme and Microbial Technology(1992),14(7) :514 中公开的。
[0093] 在转化过程之后，高品质的蛋白质浓缩物化QPC)，W及短梗霉聚糖和铁载体，可W 从转化培养物中按照通过任选地醇沉淀和离屯、的转化方法被回收。醇的实例是乙醇，尽管 本领域技术人员明白，其它醇应当起作用。在实施方案中，盐也可W用于沉淀。示例性的盐 可W是钟、钢和儀的氯化物盐。在实施方案中，可W单独使用或与醇组合使用聚合物或多价 离子。
[0094] 在实施方案中，最终蛋白质浓缩物固体回收可W通过改变解育时间调节。例如，在 解育14天后可实现约75%的蛋白质，其中固体回收率为约16-20%。在实施方案中，解育2- 2.5天增加固体回收至约60-64%，且HQPC中的蛋白质水平为58-60%。在实施方案中，4-5天 的解育可最大化蛋白质含量(例如，但不限于大于约70%)和固体回收(例如，但不限于大于 约60%)两者。取决于饲料原料，运些数值可更大或更低。在实施方案中，蛋白浓缩物（即， 册SPC或HP-孤GS)可W具有特定的脂:蛋白质比，例如，在约0.0 lO: 1至约0.03:1、约0.020:1 至约 0.025:1、或约 0.021:1至约 0.023:1。
[00M] 在实施方案中，饲料原料可在单螺杆挤压机（例如，BRABENDER PLASTI-C0RDER EXTRUDER Model PL2000,化ckensack，NJ)中挤压，W筒长比螺杆直径为1:20和3:1的压缩 比，虽然其它几何形状和比例也可使用。饲料原料可被调整为约10%至约15%的水分，至约 15%，或至约25%的水分。饲料、筒、和挤压机的出口截面的溫度可W保持在约40°C至约50 °C、或约50°C至约100°C、约100°C至约150°C、约150°C至约170°C之间，且螺杆转速可W被设 置在约50巧m至约75巧m、或约75巧m至约10化pm、或约10化pm至约20化pm至约25化pm。在实 施方案中，螺杆转速足W提供针对筒两侧的脊形通道的剪切作用。在实施方案中，螺杆转速 被选择W最大化糖的释放。
[0096] 在实施方案中，挤压的饲料原料材料(例如，植物蛋白质或DDGS)可与水混合W达 到在反应器(例如，5L肥W BRUNSWICK BICFLO 3BI0REACT0R;3-化工作容积）中至少5%的 固体加载率。浆料可W被高压灭菌、冷却，然后通过使用酶的混合物进行酶法水解的糖化， 所述酶包括，但不限于，内切木聚糖酶和e-木糖巧酶、糖巧水解酶、e-葡糖巧酶、半纤维素酶 活性。在一方面，酶的混合物包括NOVOZYME饭酶。剂量可W包括6 % CELLICCTEK? (每克葡聚糖）、0.3% CELLICHTEK? (每克总固体）、和 0 .15 % NOVOZYME960? (每克总固体）。糖化可W进行大约12h至约24h，在40°至约50 °C，且约 15化pm至约20化9111，^增溶纤维和低聚糖为单糖。然后溫度可^降低至约30°(：至约37°(：之 间，在实施方案中至约35°C，且浆料可WW2%(v/v)的微生物的24小时培养物接种。浆料可 W Wo.化/L/min充气，且解育可一直持续到糖的利用停止或约96h至约12化。在补料分批 (fed-batch)转化中，更多的挤压的饲料原料可在糖化和/或微生物转化阶段期间被加入。
[0097] 在实施方案中，接种转化微生物前，饲料原料和/或挤压物可W用一种或多种抗生 素处理(例如，但不限于，四环素、青霉素、红霉素、泰乐菌素、维吉霉素、及其组合）W避免， 例如，被有害的细菌菌株污染。
[0098] 在解育期间，样品可W W6-1化的间隔取出。用于HPLC分析的样品可被煮沸、离屯、、 过滤(例如，通过0.22WI1过滤器）、置于自动采样瓶、并冷冻直到分析。在实施方案中，样品可 W使用WATERS HPLC系统测定碳水化合物和有机溶剂，虽然可使用其它HPLC系统。可对样品 进行平板或血球计数W评价微生物群体。样品也可使用美国国家可再生能源实验室 (National Renewable Elnergy Laboratoiy)程序测定纤维素、半纤维素和果胶的水平。
[0099] 在实施方案中，转化培养物可与生成脂类的微生物组合和/或生成脂类的培养物 的产物可与转化培养物的产物组合。在相关的方面中，生成脂类的微生物可在单独的SmF过 程中生长。在另外的相关方面，生成脂类的微生物可W是金黄色破囊壶菌 (化raustoc^trium aureum)，其中基质是糖浆，并且其中生物体耐受盐水，包括耐受糖浆 的高盐和高脂肪含量。
[0100] SSF
[0101] 根据本公开内容的方法，在固态发酵(SSF)反应器内的固体生长培养基可被用于 生产用于动物饲料的食料(food stuffs)，W及其他。
[0102] 当固体生长培养基的控制的质量流经过接种的点时，固体生长培养基可被均匀且 连续地接种。固体生长培养基可包含多种可通过行进垂直揽拌被移动的有机或无机载体， 其中螺旋推运器区段可提升发酵基质W增加通风、散发热量、散发水分，防止基质结块和压 紧。
[0103] 无机载体可包括，但不限于，赔石、珍珠岩、无定形二氧化娃或粒状粘±。运些类型 的材料是常用的，由于它们形成具有0.5-50mm的粒径和高表面积的松散、通风的粒状结构。 有机载体可包括，但不限于，谷物巧粒、教、银屑、泥炭、油巧材料、木屑或其组合。在相关的 方面，运些载体可从最终蛋白产物中来分离。
[0104] 另外，固体生长培养基可包含用于微生物的补充营养物。通常，运些包括碳源诸如 碳水化合物(糖、淀粉）、蛋白或脂肪、W有机形式的氮源(蛋白、氨基酸)或无机氮盐(锭盐和 硝酸盐、尿素）、微量元素或其他生长因子(维生素、抑调节剂）。固体生长培养基可包含用于 结构组成的助剂，诸如超级吸附剂，例如聚丙締酷胺。营养物浓度、水分含量、抑等可被调整 W优化生长条件将对本领域技术人员是明显的。
[0105] 在实施方案中，固体生长培养基可W是无菌的。例如，行进垂直揽拌床可从反应器 主体上卸下，用固体生长培养基来填充并例如，在高压灭菌器中灭菌，在运之后，它可再次 在开始操作之前被无菌地附着至反应器主体。在其他实施方案中，细菌生长可通过添加稳 定化的二氧化氯产物（例如，来自E . I. DuPont De Nemours和Co . ,Wilmington, DE的 FERMASURE?)或批准用于安全人和动物摄入的其他抗菌剂替代品被防止并代替高压灭菌， 所述其他抗菌剂替代品包括但不限于，过氧化氨、憐、盐酸、四环素W及合成的抗菌剂（参 见，例如，通过引用W其整体并入本文的美国公布号20130084615)。
[0106] 在实施方案中，在开始接种之前，培养基灭菌单元内的固体生长培养基，例如，借 助于蒸汽被原位灭菌。在其他实施方案中，培养基可被己氏灭菌或任选地根本不添加热量， 其中低水活性和低抑的使用可被用来控制细菌生长。
[0107] 接种物可W液体或固体形式供应至根据本发明的反应器中。
[0108] 如果液体培养基被用作接种物，它可呈，例如，具有小粒径的悬液的形式，W能够 使用喷射技术。在实施方案中，液体培养基可被喷射在经过接种的点的固体生长培养基的 连续流上。
[0109] 如果接种物呈固体形式，它可通过垂直揽拌/螺旋推运器类似于输送固体生长培 养基地被输送至接种的点。在实施方案中，固体接种物可使用螺旋体输送机或皮带输送机 来输送。运确保了，微生物可均等地被输送用于培养。在其他实施方案中，基质和接种物可 被混合并通过低溫挤压机W创造稳定的小粒，其中此类小粒将允许在机械揽拌不存在下反 应器中的更有效的气流。
[0110] 可存在几种不同的实现所公开的SSF的功能的结构。
[0111] 在实施方案中，公开了SSF系统，所述SSF系统包括反应器10的反应器主体101，所 述反应器10包括如图1中所示的实体。存在两个主要隔室，通过穿孔的"假(false)"板102彼 此分开的上部隔室"A"和圆锥形底部"B"，该穿孔的板102被配置为在向下方向旋转使得板 102基本上打开W允许材料向下流动并经由重力自反应器10排出至圆锥形底部B的分段，且 多个行进混合螺旋体（traveling mixing screw) 103具有附连至轴105的定位器104,该螺 旋体103被配置成在整个反应器主体101中水平移动。板102的移动通过具有定位器102b的 多个轴向杆102a来控制。圆锥形底部B包括通气输入部106和产物输出部107,排出的材料可 被装载到输送机或单独的螺旋推进器型装置20上W移动离开反应器10。在实施方案中，混 合螺旋体上的材料包含待在足够的发酵之后沉积的排出的材料。
[0112] 在实施方案中，反应器10被配置成接受溫度控制的加湿的空气进入在板102下面 的圆锥形底部B。此类配置提供微生物所需的氧气、去除热量并控制水分。
[0113] 在一个方面中，热空气在发酵循环结束时来引入。运允许组合通风板102和经由混 合螺旋体103垂直揽拌，运是将产物干燥至最终期望的水分的方法。
[0114] 如本文公开的发酵过程的性质是，它允许在发酵反应器10中进行干燥。发酵反应 器10的使用还允许在低溫更有效干燥蛋白产物，其还能够维持产物中的酶活性。此外，通风 干燥的使用是更有效的，并节约能源，由于它利用气体-蒸汽混合物的物理和热力学性质 (即，测湿法）。反应器10中的产物的干燥还提供了改进的流动能力，并将允许产物通过重力 排出，由于它避免处理和输送高水分含量材料。此外，如公开的装置10避免使用单独的干燥 系统和相关的输送机、控制装置W及伴随的大脚印（large foot prints)。
[0115] 在实施方案中，床中层化的混合和减少被提供，使得结块和凝聚的减少被实现。在 其他实施方案中，在整个上部隔室中水平行进的速率和模式是对于任何期望的条件可编程 的和可选择的。在实施方案中，反应器空气输入包含可选择的溫度和湿度水平。在一个方 面，在选择的解育期之后，湿度可被减少，且溫度被升高，W提供干燥材料并辅助排出过程。 反应器隔室的形状和尺寸可依据培养和使用的材料的需要而不同。形状不需要被限制为良 好定义的形状，但可W是可塑的或塑料状的。在实施方案中，容器的形状为圆柱状、有角的 或圆锥形。
[0116] 在实施方案中，SSF和SmF可W W任何顺序被连续使用，W产生最终产物。
[0117] 在实施方案中，SSF和SmF被组合，W实现混合固态发酵(混合-SSFKSMF或液态深 层发酵进行约24小时W构建细胞数目作为接种物的源，包括其中所接种的微生物产生胞外 酶，将所述酶释放进主流体中，且其中细胞和酶两者可用于与下一步骤的固体的反应，该步 骤包括将W上液体与另外的酸和抗微生物剂(根据需要)连同足够固体共混，W将混合物的 水分水平减少至约40%至约60%，其中后者变成用于在SSF反应器中解育的固相。在实施方 案中，15%固体液态深层运行24小时，随后添加固体W使固态基质成为50%固体，其中后者 在该状态下运行5天。
[0118] 食物制剂
[0119] 在示例性实施方案中，回收的高品质的蛋白质浓缩物和脂类用在食物制剂中。在 实施方案中，回收的高品质的蛋白质浓缩物化QPC)将是食物制剂中唯一的蛋白质来源。食 物制剂中蛋白质来源百分比不意味着是限制性的，且可包括24至80%的蛋白质。在实施方 案中，高品质的蛋白质浓缩物化QPC)将是多于约50 %、多于约60 %、或多于约70 %的总食物 制剂蛋白质来源。回收的册PC/脂类组合可代替来源，如鱼粉、大豆粉、小麦和玉米粉和谷蛋 白及浓缩物，及动物副产物，如血液、家禽肉、和羽毛粉。使用收回的HQPC/脂类的食物制剂 还可包括补充剂，如矿物质和维生素预混物W酌情满足其余的营养需求。
[0120] 在某些实施方案中，HQPC如高品质的大豆蛋白质浓缩物化QSPC)或高质量DDGS 化P-DDGS)或其他升级的基于植物的粉单独地或与生成的脂类组合的性能，可W通过比较 饲养高品质蛋白质浓缩物食物制剂的动物与饲养对照食物制剂如鱼粉的动物的生长、饲料 转化率、蛋白质功效、和存活率来测量。在实施方案中，测试制剂含有一致的蛋白质、脂类和 能量含量。例如，当动物是鱼，可测量内脏(脂肪沉积)和器官(肝和脾）的特性、修复(化ess- out) 百分比 、和鱼片近似分析 （fillet proximate analysis)、 W 及肠道组织学（肠炎）， W 评价食物响应。
[0121] 如所理解的，含有回收的HQPC和/或与回收的脂类的组合的单独食物制剂可被优 化用于不同种类的动物。在实施方案中，动物是在商业水产养殖生长的鱼。食物制剂优化的 方法是众所周知的，且本领域技术人员易于确定而无需过度实验。
[0122]全价生长食物(Complete grower diets)可W根据各种动物物种已知的营养需求 使用HQPC配制。在实施方案中，制剂可用于黄驴(例如，42%蛋白质、8%脂类）。在实施方案 中，制剂可用于虹縛鱼（35%蛋白质、16%脂类）。在实施方案中，制剂可用于上文提及的任 一种动物。
[0123] 可W使用用于基于植物食物的基础矿物质和维生素预混物，W确保微营养需求将 得到满足。任何补充剂(如通过分析认为必要)可W通过比较无补充的相同制剂来评价；因 此，饲养试验可W在析因设计中完成W考虑到补充作用。在实施方案中，饲养试验可包括基 于鱼粉的对照食物及基于ESPC和LSPC的参考食物[传统的SPC(TSPC)是从溶剂洗涂大豆薄 片W除去可溶性碳水化合物产生的；纹理(texturized)SP(XESPC)是由在潮湿、高溫下挤压 TSPC产生的；及低抗原SPC(LSPC)是从TSPC通过改变加工过程中溶剂洗涂和溫度产生的]。 可W使用实验室规模的单螺杆挤压机（例如，BRA邸ND邸PLASTI-CO畑ER EXTRUDER Model PL2000)产生用于饲养试验的小粒。
[0124] 饲养试验
[0125] 在实施方案中，每个处理（即，每个实验组和对照食物混合物)可W使用四个实验 单元的重复(例如，各约60天至120天）。试验可W在IlO-L圆形罐(20鱼/罐)进行，所述罐并 联至由离屯、累驱动并由固体胆槽、和生物反应器、过滤器（100WI1袋，碳和紫外线）组成的闭 环再循环系统。热累可被用作维持为物种特异性生长的最佳溫度必需的。水质（例如，溶解 氧、pH、溫度、氨和亚硝酸盐)可W在所有系统中被监测。
[0126] 在实施方案中，实验食物可W根据鱼的大小被递送，并分成二到五个每天饲养量。 生长性能可W通过在一至四个星期（取决于鱼的大小和试验持续时间）获取总质量测量来 确定;配给可W根据增重进行调整，W允许饱食饲养和减少废物流。消耗可从来自单个罐的 未食用的饲料的收集每两周进行评价。未食用的饲料可W干燥至恒定的溫度，冷却并称重 W估计饲料转化率。饲料蛋白质和能量的消化率可从每个实验的中点期间手动剥离的排泄 物材料，或经由饲养试验结束时从下部肠道的剖检确定。存活率、体重增加、生长速率、健康 指标、饲料转化率、蛋白质和能量的消化率、和蛋白质功效可W在各处理组之间进行比较。 可进行剖检鱼的近似分析W比较各食物处理之间鱼片的组成。根据饲养试验目标，如对鱼 片成分需要的，可进行氨基酸和脂肪酸的分析。食物处理的饲养试验响应可W与对照(如鱼 粉)食物响应比较，W确定HQPC食物的性能是否达到或超过对照响应。
[0127] 食物和饲养试验响应的统计分析可WW先验a = 〇.05完成。根据需要，在处理之间 的性能参数的分析可WW方差或协方差(Proc Mixed)和事后多重比较的适当的分析进行。 鱼性能和组织响应的分析可由非线性模型评价。
[012引在实施方案中，本公开内容提出使用，例如，GRAS状态微生物，W转化大豆薄片/粉 或DDGS中的纤维和其它碳水化合物为另外的蛋白质。还可产生微生物胞外多糖（即胶状 物），其可有助于挤压的饲料小粒形成，省去粘合剂的需求。运种微生物胶状物还可提供免 疫刺激活性，W激活保护鱼类远离自应激物产生的常见病原体的先天防御机制。免疫预防 的物质，如e-葡聚糖、细菌产物、和植物成分，在商业饲料中的使用增加，W减少由于传染病 的经济损失，并最小化抗生素的使用。本公开内容的微生物还产生胞外肤酶，运将增加代谢 过程中谷物蛋白质的消化率和吸收，提供更高的饲料功效和产量。如本文所公开，此微生物 解育方法提供了有价值的、可持续的水产养殖饲料，其每单位蛋白质比SBM、SPC和鱼粉更便 宜。
[0129] 如公开的，本发明的微生物可代谢大豆薄片/粉或DDGS中的个体碳水化合物，产生 细胞量(蛋白质）和微生物胶状物两者。运些微生物的不同菌株还增强纤维解构。本发明的 微生物还可将大豆和玉米的蛋白质转化成更易消化的肤和氨基酸。在实施方案中，W下操 作可W被执行：1)确定使用本公开内容的精选微生物转化预处理的大豆蛋白质、油料种子 蛋白质、DDGS和类似物，W约45%和55%之间或至少约50%的蛋白质浓度产生高品质的蛋 白质浓缩物化QPC)的功效，及2)评价册PC代替鱼粉的功效。在实施方案中，可W进行优化大 豆、油料种子、及DDGS预处理和转化条件，W改善微生物的性能和强壮性，对商业重要的鱼 类的范围测试所得的生长饲料，验证方法成本和能量需求，并完成规模化和商业化的步骤。 在实施方案中，本公开内容的HQPC可W能够代替至少50%的鱼粉，同时提供更高的生长速 率和转化效率。生产成本应低于商业大豆蛋白质浓缩物(SPC)且基本上低于鱼粉。
[0130] 挤压预处理后，可W评价纤维素解构酶产生糖类，本公开内容的微生物可转化糖 类为蛋白质和胶状物。在实施方案中，可W使用运些酶的连续省略(sequential omission) 和与纤维素分解微生物共培养的评价。可W评价乙醇沉淀胶状物，并提高册PC的离屯、回收。 干燥后，HQPC可被渗入到实际的食物制剂。在实施方案中，可W配制（与矿物质和维生素预 混物一起)测试生长食物，并可W在W商业重要的鱼类，如黄驴或虹縛鱼的饲养试验中，进 行与鱼粉对照和商业SPC(SPC与豆粉明显不同，因为它包含痕量的低聚糖和抗原物质大豆 球蛋白和b-伴大豆球蛋白）食物的比较。可W检查性能(如生长、饲料转化率、蛋白质功效）、 内脏的特性、和肠道组织学，W评价鱼的响应。
[0131] 在其它实施方案中，通过确定最佳预处理和转化条件同时最小化程序输入，改善 微生物的性能和稳健性，对一系列商业重要的鱼类测试所得的生长饲料，验证方法成本和 能量需求，并完成对规模化和商业化的初步步骤，可进行HQPC/脂类生产方法的优化。
[0132] 在过去的几年中，少数设施已安装了在乙醇生产方法之前去除玉米壳和胚芽的干 磨机。此干法分提方法产生具有高达42 %的蛋白质的DDGS( W下称为干法分提DDGS (化y打ac孤GS))。在实施方案中，可在预先确定的W迅速产生用于驴鱼饲养试验使用的足 够量的高蛋白质DDGS化P-DDGS)的条件下，对常规和干法分提DDGS进行比较。在实施方案 中，进行了运种转化的性能(经由化学组成变化）的仔细监测，并鉴定了对HP-孤GS品质影响 最大的参数。在一些实施方案中，低油孤GS可W用作转化的底物，其中运些低油孤GS具有比 常规的DDGS更高的蛋白质水平。在相关的方面，相比传统DDGS，低油DDGS增加出芽短梗霉菌 的生长率。
[0133] 一些研究小组正在评价W植物来源的蛋白质，如大豆粉和孤GS，部分代替鱼粉。然 而，较低的蛋白质含量、不恰当的氨基酸平衡、及抗营养因子的存在限制了代替水平至20- 40%。初步生长试验表明，没有现有的基于DDGS或SPC的食物提供类似于鱼粉对照食物的性 能。在商业化生产的DDGS和SPC之中一些缺陷已被鉴定，主要是在蛋白质和氨基酸组成方 面，运赋予生长性能和鱼组合物的变化性。但是，如本文公开的含有营养补充剂(配制W满 足或超过所有的需求）的HP-孤GS和册SPC食物提供类似于或超过鱼粉对照的生长结果。因 此，如本文公开的方法及由此开发的产物提供了更高品质的册SPC或HP-DDGS (相对于营养 需求），并支持等同于或比含有鱼粉的食物更好的生长性能。
[0134] 可W W本公开内容的鱼饲料组合物饲养的鱼包括，但不限于，西伯利亚铸、小体 铸、闪光铸、白铸、巨骨舌鱼、日本媛、美洲媛、短罐媛、长罐媛、欧洲媛、遮目鱼（加 anos Chanos)、遮目鱼(MiIkf iSh)、蓝觸太阳鱼、蓝绿鱗觸太阳鱼、白替驴、黑替驴、Asp、卡特拉 食比、金鱼、娜鱼、錢鱼、麦瑞加拉錢鱼、草鱼、經鱼、館鱼、錦鱼、Orangef in Iabeo、Roho Iabeo、红万經鱼、武昌鱼、青鱼、金体美洲编、Ni Iem carp、白阿穆尔编鱼、泰银姗、Java、斜 齿编、下觸、池塘泥餓、Bocachico、金头觸、化chamaXachama Blanca、Paco、黑綱、斑点叉尾 綱、媛科餘鱼、蓝餘鱼、六须餘鱼、巨餘(Swai，Tra，Basa)、条纹餘鱼、泥餓、菲律宾餘鱼、香港 餘鱼、北非餘鱼、大头餘鱼、Sampa、南美餘鱼、Atipa、白斑狗鱼、香鱼、白縛、白娃、粉红娃、大 马哈鱼、银大马哈鱼、樓娃、虹縛鱼、红大马哈鱼、大鱗大马哈鱼、大西洋娃鱼、海縛、北极红 点娃、溪红点娃、湖红点娃、大西洋轄鱼、银汉鱼、Lai、银盖鱼、澳洲肺鱼/亚洲海驴鱼、尼罗 河食卢鱼、虫纹石斑鱼、金驴鱼、条纹驴鱼、白驴、欧洲驴鱼、香港石斑鱼、宝石石斑鱼、驴滑石 斑鱼、斑点东星斑、银驴、白驴、宝石驴、大口黑驴、小口黑驴、欧洲驴、梭驴(Zander，Pike- perch)、黄驴、加拿大梭驴、大眼梭驴、竹芙鱼、红紐、青紐修、卵形錯錢、佛罗里达州錯、谷氏 錯、日本竹芙鱼、军曹鱼、红树林红觸鱼、黄尾笛觸、黑觸、白觸鱼、深红觸鱼、红觸鱼、真觸、 金丝觸、金头觸、红鼓鱼、绿宝丽鱼、黑带觸、淡水石斑鱼、墨西哥银驴、Pearlspot、=斑罗非 鱼、蓝罗非鱼、长罐罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、罗非鱼、荷那龙罗非鱼、黑飄罗非 鱼、伦氏非娜、福寿鱼、金綾、大鱗綾、Gold-spot mullet、Thinlip grey mullet、跳綾、Tade mullet、乌離、白離鱼、梭状離、太平洋脂塘禮、尖塘禮、白斑臭都鱼、点蓝子鱼、刺蓝子鱼、南 方黑銷、北方黑銷鱼、攀驴、Snakeskin gourami、接吻驴、巨驴、黑鱼、印尼黑鱼、斑点黑鱼、 条纹黑鱼、大菱解、大比目鱼旧本牙蝶）、夏日解、漠斑牙解、北美黄盖蝶、大西洋大比目鱼、 绿背解、欧錦、及其组合。
[0135] 技术人员可W理解，本公开内容的鱼饲料组合物可W作为用于药物活性物质的方 便的载体使用。
[0136] 根据本公开内容的鱼饲料组合物可W W液体、可倾倒的乳剂、或糊状的形式、或W 干燥的形式，例如作为挤压物、颗粒、粉末、或作为薄片被提供。当鱼饲料组合物作为乳剂， 水包脂的乳剂被提供时，其可W W相对浓缩的形式。运样浓缩的乳剂形式，也可W被称为预 乳剂，因为它可W W-个或多个步骤在水介质中稀释，W提供用于生物的最终的富集培养 基（enrichment medium)。
[0137] 在实施方案中，如公开的用于基于微生物的方法的含有纤维素的起始材料是玉 米。玉米的大约=分之二是淀粉，淀粉在发酵和蒸馈过程中转化为乙醇和二氧化碳。剩余的 营养物或发酵产物可产生冷凝蒸馈可溶物或酒糟如DDGS，它可W在饲料产物中使用。在一 般情况下，方法包括玉米的干磨或研磨的初始准备步骤。然后对加工的玉米进行水解并添 加酶W在糖化步骤分解主要淀粉组分。允许随后的发酵步骤在添加了根据本公开的实施方 案提供的微生物（如酵母）后继续进行W产生气态产物如二氧化碳。进行发酵用于产生乙 醇，其可W从发酵液中被蒸馈。然后可干燥发酵培养基的剩余物，W产生包括DDGS的发酵产 物。运个步骤通常包括通过离屯、的固/液分离方法，其中固相组分可W被收集。包括过滤和 喷雾干燥技术的其它的方法可用于实现运样的分离。然后可对液相组分进行进一步的蒸发 步骤，可W浓缩可溶性副产物，例如糖、甘油和氨基酸，成为称为糖浆或浓缩的玉米可溶物 (CCS)的材料。CCS然后可与固相组分重组，干燥为解育产物(DDGS)。应当理解，本发明组合 物可W应用于基于干磨的新的或现有的乙醇工厂，W提供集成的乙醇产生方法，其还产生 具有增加的价值的发酵产物。
[0138] 在实施方案中，根据本公开内容产生的解育产物具有比常规发酵产物更高的商业 价值。例如，解育产物可包括具有改善的氨基酸和微量营养元素含量的增强的干燥的固体。 因此可W提供"黄金色"产物，相比于深色的HQSP其通常表示较高的氨基酸消化率。例如，根 据本文的实施方案，可产生浅色的册SP，其相比于通常具有较少的营养价值的相对较深色 的产物具有增加的赖氨酸浓度。产物的颜色可W是发酵产物或册SP的品质和营养物质消化 率的评价中的重要因素或指标。颜色作为干燥过程中暴露于过量的热的指标使用，所述过 量的热引起游离氨基基团和糖的焦糖化和美拉德反应(Maillard reaction)，降低了某些 氨基酸的品质。
[0139] 干磨或研磨乙醇产生方法的基本步骤可如下所述:粉碎或研磨玉米或其它谷物产 物、糖化、发酵、和蒸馈。例如，选择的全玉米粒可通常W典型地键式粉碎机或滚筒粉碎机粉 碎或研磨。颗粒尺寸可影响蒸煮水合和随后的酶促转化。然后粉碎或研磨的玉米可与水混 合，制作被蒸煮并冷却的糊状物。在此转化的初始步骤期间包括酶可W是有用的，W降低凝 胶淀粉的粘度。然后可将混合物转移至糖化反应器中，维持在选定的溫度，如140°F，在那里 淀粉通过添加糖化酶转化为可发酵的糖如葡萄糖或麦芽糖。转化的糊状物可被冷却至所需 的溫度，例如84°F，并供应至发酵反应器，在那里可发酵糖通过使用根据本公开内容提供的 微生物的精选的菌株转化成二氧化碳，相比更传统的成分，例如酿酒酵母(Saccharomyces yeasts),其产生更富营养的发酵产物。得到的产物可W被闪蒸W分离出二氧化碳，且得到 的液体可W被供应至由蒸馈塔和汽提塔构成的回收系统中。乙醇流可被引导至分子筛，在 那里剩余的水用吸附技术除去。W少量的汽油变性纯化的乙醇，可产生燃料级乙醇。另一种 产物可通过进一步纯化初始馈分乙醇W除去杂质被产生，产生大约99.95%的非燃料用途 的乙醇。
[0140] 酒糟（whole stillage)可W从蒸馈装置的底部抽出并离屯、产生湿酒糟颗粒 (distiller's wet grains,DWG)和酒糟水（thin stillage)(液体Kdwg可WW55-65%水 分离开离屯、机，并可被作为牛的饲料湿地销售，或干燥作为根据本公开内容提供的增强的 发酵产物。运些产物包括可在本文中称为干酒糟(distiller^ S化ied grains,孤G)的增强 的最终产物。使用蒸发器，酒糟水（液体）可W被浓缩形成酒糟废液（distil Ier^ S solubles),其可W被加回酒糟过程流并与其合并和干燥。根据本公开内容的实施方案的此 合并的产物可W作为具有增加氨基酸和微量营养元素含量的增强的发酵产物销售。应当理 解，本公开内容的各种概念可应用于除本文说明的W外该领域已知的其它发酵方法。
[0141] 本发明另一方面设及具有增强的浓度的营养物并包括微生物的全价鱼粉组合物， 其特征在于增强的浓度的营养物，所述营养物例如，但不限于，脂肪、脂肪酸、脂类，如憐脂、 维生素、必需氨基酸、肤、蛋白质、碳水化合物、酱醇、酶、和微量矿物质，如铁、铜、锋、儘、钻、 舰、砸、钢、儀、氣、饥、锡、娃、及其组合。
[0142] 在本公开内容的解育方法中，碳源可被微生物水解为其组分糖W产生醇和其它气 态产物。气态产物包括二氧化碳且醇包括乙醇。解育方法后获得的解育产物通常有更高的 商业价值。在实施方案中，相比缺乏微生物的那些产物，包含微生物的解育产物具有增强的 营养物含量。微生物可存在于解育系统、解育肉汤和/或解育生物质中。解育肉汤和/或生物 质可被干燥(例如，喷雾干燥），W产生具有增强含量的营养物含量的解育产物。
[0143] 例如，根据本公开内容，解育方法后回收的耗尽、干燥的固体是增强的。运些解育 产物通常是无毒的、可生物降解、容易得到、价格低廉、且营养物丰富。微生物的选择和解育 条件对产生作为饲料或营养补充剂使用的低毒性或无毒性的解育产物是重要的。尽管葡萄 糖是从谷物淀粉的水解产生的主要的糖，通常它不是碳水化合物产生的唯一的糖。不同于 由传统的干磨乙醇生产方法产生的SPC或DDG，其包含了大量的非淀粉的碳水化合物(例如， 作为中性洗涂剂纤维测量的百分比高达35%的纤维素和阿拉伯木聚糖，按干重计算），本发 明的由非淀粉的碳水化合物的酶水解产生的富含营养物的解育产物对非反当动物更适口 和可消化。
[0144] 本公开内容的富含营养物的解育产物可W具有W重量计从至少约1%至约95%的 营养物含量。营养物含量优选在W重量计至少约10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%- 50 %、50 %-60 %、60 %-70 %、和70 %-80 %的范围内。可用的营养物含量可W取决于其所饲 养的动物，和其余食物的背景，及在动物的生命周期的阶段。例如，肉牛需要的组氨酸比奶 牛少。为饲养动物选择合适的营养物含量是本领域技术人员所熟知的。
[0145] 解育产物可制备为喷雾干燥的生物质产物。任选地，生物质可W通过已知的方法， 如离屯、、过滤、分离、倾析、分离和倾析的组合、超滤或微滤被分离。生物质解育产物可被进 一步处理W促进过瘤胃（rumen bypass)。在实施方案中，生物质产物可W从解育培养基中 分离，喷雾干燥，并任选的处理，W调节过瘤胃，并添加到饲料中作为营养源。除了在含有微 生物的解育方法中产生营养富含的解育产物，营养富含的解育产物也可W在转基因植物系 统中生成。用于产生转基因植物系统的方法是本领域已知的。可选地，当微生物宿主分泌营 养内容时，可W从通过解育产生的生物质分离富含营养物的肉汤，且澄清的肉汤可被用作 动物饲料成分，例如，W液体形式或喷雾干燥形式。
[0146] 使用微生物的解育方法后得到的解育产物可W作为动物饲料或作为人的食品补 充剂。解育产物包括至少一种成分，其具有来自非动物来源(例如，细菌、酵母、和/或植物） 的增强的营养物含量。特别是，解育产物富含W下的至少一种或多种:脂肪、脂肪酸、脂类， 如憐脂、维生素、必需氨基酸、肤、蛋白质、碳水化合物、酱醇、酶、和微量矿物质，如铁、铜、 锋、儘、钻、舰、砸、钢、儀、氣、饥、锡和娃。在实施方案中，肤含有至少一种必需氨基酸。在其 它实施方案中，必需氨基酸被封装在解育反应中使用的本发明的修饰的微生物内。在实施 方案中，必需氨基酸包含在由微生物表达的异源多肤中。当需要时，在合适的微生物中（例 如，真菌)表达异源多肤，并储存在包涵体中。
[0147] 在实施方案中，解育产物具有高的营养物含量。结果是，可W在全价动物饲料中使 用较高比例的解育产物。在实施方案中，饲料组合物包括按重量计至少约15%的解育产物。 在全价饲料、或食物中，运种材料将与其它材料一起饲养。根据其它材料的营养物含量、和/ 或被提供该饲料的动物的营养需求，修改的解育产物的范围可W从饲料的15%至饲料的 100%。在实施方案中，由于高营养物含量，本发明的解育产物可W提供较低比例的混合。在 其它实施方案中，本发明的解育产物可提供非常高的级分饲养，例如超过75%。在合适的实 施方案中，饲料组合物包括至少约20 %、至少约25 %、至少约30 %、至少约35 %、至少约 40%、至少约45 %、至少约50%、至少约60%、至少约70 %、或至少约75 %的本发明的解育产 物。通常，饲料组合物包括按重量计至少约20 %的解育产物。更常见地，饲料组合物包括按 重量计至少约 15-25%、25-20 %、20-25%、30%-40 %、40 %-50 %、50%-60%、或60%-70% 的解育产物。当需要时，本发明的解育产物可W作为饲料的唯一来源使用。
[0148] 为了多种用途，例如，为了增加重量和动物健康的总体改善，全价鱼粉组合物可具 有关于一种或多种必需氨基酸的增强的氨基酸含量。因为在解育产物中游离氨基酸的存在 和/或包括必需氨基酸的蛋白质或肤的存在，全价鱼粉组合物可具有增强的氨基酸含量。必 需氨基酸可包括组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、牛横酸(横酸）、异亮氨酸、 和/或色氨酸，其可作为游离氨基酸或作为富含所选择的氨基酸的蛋白质或肤的一部分存 在于全价动物饲料中。富含至少一种必需氨基酸的肤或蛋白质在肤或蛋白质中可具有每总 氨基酸残基至少1%的必需氨基酸残基、在肤或蛋白质中每总氨基酸残基至少5%的必需氨 基酸残基、或在肤或蛋白质中每总氨基酸残基至少10%的必需氨基酸残基。通过向动物饲 养营养平衡的食物，进行营养物含量的最大利用，实现可比较的生长率、牛奶产生需要较少 的饲料，或减少存在于排泄物的营养物，减少废物的生物负载。
[0149] 具有增强的含量的必需氨基酸的全价鱼粉组合物，可具有相对于粗蛋白质和总氨 基酸含量的重量的至少2.Owt%的必需氨基酸含量(包括游离的必需氨基酸和存在于蛋白 质或肤中的必需氨基酸），且更适宜地，相对于粗蛋白质和总氨基酸含量的重量的至少 5.Owt%。全价鱼粉组合物包括来自于微生物的其它营养物，包括但不限于，脂肪、脂肪酸、 脂类，如憐脂、维生素、碳水化合物、酱醇、酶、及微量矿物质。
[0150] 全价鱼粉组合物可包括全价饲料形式组合物、浓缩形式组合物、渗合物形式组合 物、及基本形式组合物。如果组合物是W全价饲料的形式，百分比营养物水平可W是百分之 约10至约25,更适宜地百分之约14至约24,其中营养物获得自解育产物中的微生物;然而， 如果组合物是W浓缩物的形式，营养物水平可W是百分之约30至约50,更适宜地百分之约 32至约48。如果组合物是W渗合物(blender)的形式，组合物中的营养物水平可W是百分之 约20至约30,更适宜地百分之约24至约26;及如果组合物是W基本混合物的形式，组合物中 的营养物水平可W是百分之约55至约65。除在本文另有说明外，百分比是基于重量百分比 计。如果HQPC的单一营养物例如Lys是高的，它将W低比例用作补充剂;如果它的氨基酸和 维生素如维生素A和E是平衡的，它将是更全价的饲料且将W更高的比例饲养并补充有低蛋 白质、低营养饲料原料，如玉米賴杆。
[0151] 鱼粉组合物可包括存在于解育产物中的具有至少约2%的必需氨基酸含量的肤或 粗蛋白质级分。在实施方案中，肤或粗蛋白质级分可具有至少约3%、至少约5%、至少约 10%、至少约15%、至少约20%、至少约30%、至少约40%的必需氨基酸含量，和在实施方案 中，至少约50%。在实施方案中，肤可W是100%的必需氨基酸。通常，鱼粉组合物可包括存 在于解育产物中的具有高达约10%的必需氨基酸含量的肤或粗蛋白质级分。更常见地，鱼 粉组合物可包括存在于解育产物中的具有约2-10%、3.0-8.0%、或4.0-6.0%的必需氨基 酸含量的肤或粗蛋白质级分。
[0152] 鱼粉组合物可包括存在于解育产物中的具有至少约2%的赖氨酸含量的肤或粗蛋 白质级分。在实施方案中，肤或粗蛋白质级分可具有至少约3%、至少约5%、至少约10%、至 少约15 %、至少约20 %、至少约30 %、至少约40 %的赖氨酸含量，和在实施方案中，至少约 50%。通常，鱼粉组合物可包括具有高达约10%的赖氨酸含量的肤或粗蛋白质级分。如果需 要，鱼粉组合物可包括具有约2-10%、3.0-8.0 %、或4.0-6.0%的赖氨酸含量的肤或粗蛋白 质级分。
[0153] 鱼粉组合物可包括解育产物中从约Ig/Kg的干固体至900g/Kg的干固体的营养物。 在实施方案中，鱼粉组合物中的营养物可W W至少约2g/Kg的干固体、5g/Kg的干固体、IOg/ Kg的干固体、50g/Kg的干固体、lOOg/Kg干固体、200g/Kg的干固体、及约300g/Kg的干固体存 在。在实施方案中，营养物可^^至少约400邑/蛇的干固体、至少约500邑/蛇的干固体、至少 约600g/Kg的干固体、至少约700g/Kg的干固体、至少约800g/Kg的干固体、和/或至少约 900g/Kg的干固体存在。
[0154] 鱼粉组合物可包括存在于解育产物中的具有约Ig/Kg干固体至900g/Kg的干固体 含量的必需氨基酸或含有至少一种必需氨基酸的肤。在实施方案中，在鱼粉组合物中的必 需氨基酸或含有至少一种必需氨基酸的肤可W W至少约2g/Kg的干固体、5g/Kg的干固体、 lOg/Kg干固体、50g/Kg的干固体、lOOg/Kg的干固体、200g/Kg的干固体、及约300g/Kg的干固 体存在。在实施方案中，必需氨基酸或含有至少一种必需氨基酸的肤可W W至少约400g/Kg 的干固体、至少约500g/Kg的干固体、至少约600g/Kg的干固体、至少约700g/Kg的干固体、至 少约800g/Kg的干固体、和/或至少约900g/Kg的干固体存在。
[0155] 全价鱼粉组合物可包含在解育期间形成的W生物质的形式的富含营养物的解育 产物和至少一种另外的营养组分。在另一个实例中，鱼粉组合物包含从解育期间形成的解 育肉汤溶解和悬浮的富含营养物的解育产物和至少一种另外的营养组分。在进一步的实施 方案中，鱼粉组合物具有粗蛋白质级分，其包括富含至少一种必需氨基酸的蛋白质。鱼粉组 合物可W配制W提供必需氨基酸的改善的平衡。
[0156] 对于包括DDGS的组合物，全价组合物形式可包含一种或多种成分，如麦教("wheat m i dd S ")、玉米、大豆粉、玉米蛋白粉、酒糟或酒糟及可溶物、盐，常量矿物质、微量矿物质和 维生素。其它潜在的成分通常可包括，但不限于向日葵粉、麦芽和大豆壳。渗合物形式的组 合物可包含麦教、玉米蛋白粉、酒糟或酒糟及可溶物、盐、常量矿物质、微量矿物质和维生 素。可选择的成分可通常包括，但不限于，玉米、大豆粉、向日葵粉、棉巧粉、麦芽和大豆壳。 基本形式组合物可包含麦教、玉米蛋白粉、和酒糟或酒糟及可溶物。可选择的成分可通常包 括，但不限于，大豆粉、向日葵粉、麦芽、常量矿物质、微量矿物质和维生素。
[0157] 微生物中的高不饱和脂肪酸化UFA),当暴露于氧化条件下可转化成为不希望的不 饱和脂肪酸或成为饱和脂肪酸。然而，通过向饲料中引入合成的抗氧化剂或天然存在的抗 氧化剂，如e-胡萝h素、维生素 E和维生素 C，《-3HUFA的饱和可被减少或阻止。合成的抗氧化 剂，如BHT、BHA、TB册或乙氧哇，或天然抗氧化剂如生育酪，通过将它们添加到产物中可被渗 入到食品或饲料产物，或它们可W通过在合适的生物中原位生产被渗入。W运种方式渗入 的抗氧化剂的量取决于，例如，随后的使用需求，例如产物配制、包装方法、和希望的保质 期。
[0158] 解育产物或含有本公开内容的解育产物的全价鱼粉，也可W作为用于人类消耗的 营养补充剂使用，如果方法W人等级的原材料开始，且贯穿方法遵守人类食品的质量标准。 如本文公开的，解育产物或全价饲料是高营养物含量的。营养物如蛋白质和纤维与健康食 物有关。可开发在食品中利用本公开内容的解育产物或全价饲料的食谱，所述食品如谷类 食品、薄脆饼干、馆饼、饼干、糕饼、披萨饼皮、熏香肠、肉丸、奶昔，并W食用食品的任何形 式。另一种选择可W是开发本公开内容的解育产物或全价饲料为零食或零食棒，类似于燕 麦棒(grano Ia bar )，其可容易地进食，方便分发。零食棒可包括来自谷物的蛋白质、纤维、 胚芽、维生素、矿物质，W及营养制品，如葡萄糖胺、HUFA、或辅因子，如维生素Q-10。
[0159] 包含本发明的解育产物的鱼粉还可补充香料。具体香料的选择将取决于被提供饲 料的动物。天然和人工的香料和芳香剂，可用于使得饲料更容易接受和适口。运些补充剂可 与所有的成分良好地混合，且可作为液体或干产物的形式获得。将在动物饲料中补充的合 适的香料、引诱剂、和芳香剂，包括但不限于鱼信息素、胡芦己、香蕉、樓桃、迷迭香、小茵香、 胡萝K薄荷牛至(peppermint oregano)、香草，茵香、加朗姆、枫树、焦糖、相橘油、下酸乙 醋、薄荷醇、苹果、肉桂，其任何天然或人工的组合。香料和芳香剂可在不同的动物之间互 换。类似地，人工的或天然的各种水果香料，可加入到用于人类消耗的包括本发明的解育产 物的食品补充剂。
[0160] 本公开内容的解育产物或全价饲料的保质期通常可W比缺乏微生物的解育产物 的保质期更长。保质期可W取决于因素，例如，产物的水分含量、多少空气可W流过饲料块、 环境条件和防腐剂的使用。可向全价饲料加入防腐剂W增加保质期至几周和几个月。其它 增加保质期的方法包括类似青胆饲料管理的管理，如与其它饲料混合和包装，W塑料覆盖 或装袋。凉爽的环境，防腐剂和从饲料块排出空气均延长湿副产物的保质期。全价饲料可W 在煤仓(bunker)或青胆鲁袋中储存。将湿的解育产物或全价饲料干燥也可增加产物的保质 期，并改善一致性和品质。
[0161] 本公开内容的全价饲料可W被长时期储存。保质期可W通过青胆、添加防腐剂如 有机酸、或与其它饲料如大豆壳混合而延长。货物桶(Commodity bins)或大容量存储仓库 可用于储存全价饲料。
[0162] 如本文所用，"室溫"是在标准压力下约25°C。
[0163] 下面的实施例是说明性的，并不旨在限制本公开的主题的范围。 实施例
[0164] 实施例1。册-孤GS的生产：
[01化]在预处理评价中，DDG在单螺旋体挤压机（BRA肥NDER PLASTI-C0RDER EXT抓DER MODEL PL2000，HACKENSACK，NJ) W1: 20的桶长度对螺旋体直径和3:1的压缩比来挤压。孤G 被调整至约25-30%水分，挤压溫度被设置在175°C，且螺旋体转速被设置在50rpm，提供针 对在桶的两侧上的脊状通道的剪切效应。
[0166] 挤压的DDG(SOKg)然后与45化水混合W实现在60化生物反应器中10%的固体载量 率。pH被调整至5且浆料被加热。在冷却之后浆料使用酶混合物来糖化。然后降低溫度，调整 pH至3.0( W优化细胞生长），且浆料用2% (v/v)24h培养物接种。浆料然后在浸没状态通风 96h。在解育期间，样品W12-24h间隔取出，用于pH、HPLC(糖)及培养物纯度分析。在解育后， 转化的浆料经历乙醇沉淀和离屯、W回收蛋白和微生物生物量化P-DDGS)。尽管不受理论束 缚，沉淀胶状物的存在改进回收悬浮固体时离屯、的效率。大约33.3Kg的固体被回收，具有基 于干重43.43 %的蛋白浓度。该HP-孤GS (称为浸没的WT28)在鱼饲养试验中被使用。
[0167] 固态试验
[0168] 单独的试验W未挤压的DDGS(试验PAT 2.3)对未挤压的DDG(试验PAT 2.4)进行。 两种原料(3.5Kg)与水混合W实现50%的水分含量，将抑调整至3-3.5,并添加2ml商业抗生 素的10-2储备溶液，W防止细菌污染。6.25% (v/v)24-4她微生物培养物的接种物被混合进 固体糖浆中。运些材料然后被放置进单独的16cm直径X 76cm高配备有假底的管中，W允许 加湿的空气向上流。将管在室溫静态解育16化。在解育后，固体被取出、干燥并分析蛋白含 量。孤GS样品（PAT 2.3)为39.75%蛋白且孤G(PAT 2.4)为41.28%蛋白。因此，与HP-孤GS产 物相比，在W未挤压的原料的固态试验中蛋白水平轻微较低。尽管不受理论束缚，认为运主 要是由于在先前浸没转化过程中的"洗涂"效应。SSF产物也在鱼饲养试验中被测试。
[0169] 浸没过程中孤G预处理的比较
[0170] 使用未挤压的DDGS和未挤压的DDG作为对照，对DDG的几个另外的预处理使用浸没 过程来评价。稀酸预处理在12rc使用1%出S化溶液进行20分钟。热水煮预处理在160°C进行 20min。25-30 %水分孤G的挤压如W上所述来进行（175 °C和50巧m)。包含减少纤维水平的精 制的商业化DDGS (St i 1 IPro)还被测试。
[0171 ] 对于转化，预处理的原料与水混合W实现在化New化unswick Bioflo 3生物反 应器(3-化工作体积）中在5的pH的10 %的固体载量率。在高压灭菌和冷却之后，浆料被糖化 2地。然后将溫度减少至30°C，抑处于5或减少至3,且浆料用2%(v/v)24h培养物接种。浆料 然后通气12化。在解育期间，样品W6-12h间隔取出。样品经历HPLC分析用于碳水化合物和 血细胞计数，W评估微生物种群。样品还经历乙醇沉淀和离屯、，W分离蛋白和微生物生物量 (HP-DDGS)。
[0172] HP-DDGS作为鱼粉代替物在驴鱼饲料中的性能的评价
[0173] 鉴于祀物种，特别是专注于黄驴的需求，对源自W上过程的产物分析营养能力。样 品经历化学分析(近似分析、纤维、不溶性碳水化合物、氨基酸、脂肪酸W及矿物质），然后配 制饲料。
[0174] 实验设计概述
[0175] 饲养试验在再循环水产养殖系统(RAS)中来进行。每处理四个实验单元(20条鱼/ 11化容器）的重复在持续112天的饲养试验中被使用。热累被用来维持黄驴生长的最佳溫 度。水质量(例如，溶解氧、pH、溫度、氨和亚硝酸盐)每日监测。
[0176] 实验食物根据鱼大小（~5g起始重量)来递送，分为每日早上60 %每日配给量和晚 上40%每日配给量的两次喂养。生长性能通过每四周采取的总质量测量来确定。配给量根 据允许相对于饲养饱食的增加并减少废物流来调整。摄入通过W下来评估:计数在喂食30 分钟之后容器中剩余未食的小粒，并调整至喂食的小粒的90%摄入。存活、体重增加、生长 速率、健康指数、饲料转化率、蛋白和能量消化率，W及蛋白效率在处理组之间进行比较。
[0177] 食物和饲养试验响应的统计分析用先验a = 〇.05来完成。处理之间的性能参数的 分析可根据需要用方差或协方差(Proc Mixed)W及事后多重比较的适当的分析来进行。 [017引饲料制备
[0179] 全价实用食物根据因子设计中用于黄驴的已知营养需求使用DDGS或转化的DDGS 来配制。用于基于植物的食物的基础矿物质和维生素预混合料被用来满足微量营养物的需 求。所有饲养试验包括基于鱼粉的对照食物和包含一系列商业和实验两者的DDGS产物的食 物。
[0180] 包括实验DDGS产物、商业DDGS、和緋鱼鱼粉对照的屯种测试蛋白成分在食物制剂 中被使用（表1)。食物通过调整小麦面筋、小麦粉、cellufil、緋鱼和玉米油被配制为等氮 (13011；[付0邑6]10113)和等脂质（18〇11口1(1；[(3)。勒1向食物近似组成(血13)是45%蛋白、9%脂类， W及大约27g蛋白/MJ GE的蛋白与能量比(PE)(表2)。所有食物被配制为包括维生素和矿物 质补充剂W及适口性和小粒质量增加物的复合实用食物。实施完全随机嵌套设计，其中 DDGS食物的每个被重复两份并用牛横酸、甲硫氨酸、组氨酸和精氨酸来补充W满足或超过 已知的黄驴需求。
[0181] 表1。被渗入进饲养试验的基础成分
[0182]
[0183] 大颗粒成分用具有0.51mm筛网的Fitzpatrick粉碎机（Fitzpatrick Company, Elmhurst, IL)来研磨，然后干燥共混。干成分使用化bad化200混合器共混15分钟，然后水 和油被添加，并然后共混另外的5min。饲料然后使用具有2.Omm钢模(die)的化bad 4146研 磨机螺旋加压并用Despatch输送机烘干机在210了来干燥。在干燥后，饲料被放置在-20°C 冷冻储藏，等待喂食。大约化g每种食物被制备，所述食物包括3.化g包含1% (干食物)氧化 铭用于表观消化率确定。
[0184] 主要蛋白源(表2)和饲料(表3)的化学分析通过私人实验室来完成。分析仅对四种 基础食物来完成，由于赖氨酸和甲硫氨酸W已知浓度来补充。分析为粗蛋白（AOAC 2006，方 法990.03 )、粗脂肪(AOAC 2006，方法990.03 )、粗纤维(AOAC 2006，方法978.10 )、水分(AOAC 2006,方法934.01)和灰分(A0AC，方法942.05) W及氨基酸(AOAC 2006,方法982.30E(a、b、 C))来完成。
[01化]表2。基础成分组成谱(基于干重）
[01861
[0187]表3。预测的食物接近值(proximatesKg/lOOg dmb，除非指明）。 「niRRl
[0189] 饲养实验设计
[0190] 560个幼体黄驴(y ± SE，4.13 ± 0.64g)被随机投放进28个在RAS容器内的圆形塑料 容器（IlOL)中。初始容器质量(每容器21条鱼，86.78±2.94g)在容器之间无显著差异(P = 0.76)。对商业化食物系统适应=天之后，将鱼引入商业化食物和特定处理食物的分级混合 物中持续四天，并然后喂食100%处理食物一周。在试验的开始，每容器鱼生物量被称重并 监测可见健康。
[0191] 鱼用手每天喂饱两次，且喂食率根据按容器计鱼重量、观察的生长速率W及饲料 摄入评估来修改。摄入率（％ )从未食用的重量除W提供的总饲料来估计。未食用的饲料重 量从计数在喂食30min之后未食用的小粒的数目来计算，所述喂食30min之后符合当小粒开 始崩解且单独的小粒将不再被食用或区别的时间。运由于易于实施被选为摄入方法，并且 每周两次估计摄入，W于特定饲养周期配给量对应。容器摄入估计每周进行两次，并乘W喂 食的配给量，W获得饲料摄入(g)。按容器计鱼生物量(+0.Olg)每四周来测量，W监测鱼健 康并计算生长性能。
[0192] 每四周还对从每个处理随机取样的鱼测量个体长度(mm)和重量(+0.Olg)。测量的 其他性能变量是：
[0193] 饲料转化率(FCR;被计算为：
[0194]
[0195]
[0196] '…
[0197] 富尔顿型丰满系数(；Fulton-type condition factorKK);被计算为：
[019 引 K =重量(g)/长度(mm)3xl00,000。
[0199] 比生长速率(SGR);被计算为：
[0200]
[0201] 试验成分的蛋白和能量消化使用在饲料内的氧化铭(Cr〇3)标志物来估计。粪便物 质经由在饲养试验完结时距离肠道的远端1/3剥离和尸检来收集。
[0202] 结果和讨论
[0203] HP-孤GS的组成被确定并示于表4中。
[0204] 表4。液态深层方法中DDG微生物预处理的比较
[02051
[0206] 与固态试验中~40%蛋白相比，未挤压的DDGS在液态深层试验中导致45.75%蛋 白产物，再一次，尽管不受理论束缚，可由于液态深层试验中添加的"洗涂"效应。然而，在未 挤压的DDG试验中最终的蛋白水平类似:在液态深层试验中的38-42% (表4)对在先前固态 试验中的~41 %。运些蛋白水平还可比得上HP-孤GS产物中挤压的DDG的41-43 %的蛋白，表 明挤压不提供显著益处。在测试的其他预处理中，稀酸不改进蛋白浓度。然而热水煮预处理 显示显著的改进。
[0207] 液态深层方法中分解纤维素的真菌对挤压的DDG的比较
[0208] 为了确定昂贵的纤维素酶是否可被使用分解纤维素的真菌所代替，经由挤压加工 的DDG使用与W上相同的方案来测试，不同的是纤维素酶和糖化步骤被省略。结果显示，当 纤维素酶被特定分解纤维素的真菌所代替时的36-45.6%的蛋白水平与当纤维素酶与非分 解纤维素的菌株一起使用时观察到的38-42%蛋白水平进行比较。
[0209] 生长试验结果:饲料营养
[0210] 预测的45%蛋白的食物组成示于表5中。所有的食物用精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲 硫氨酸和牛横酸来补充W满足或超过最小黄驴需求。
[0211] 表5。饲养试验中使用的计算的食物组成。
[0212]
[0213] 生长性能；
[0214] 生长试验度量在第112天最终取样后来分析。最终相对生长示于图2中。鱼粉对照 显示最高的相对生长(443.53±37.63g)，而SSFPAT 2.3(333.08±52.05g;p = 0.2059)和 PAT 2.4(313.86 ±40.44g;p = 0.3682)显示与该参考食物类似的性能。液态深层处理 (111.61±15.91g)显示最低的相对生长性能，并与鱼粉对照食物显著不同（p<0.0001)。
[0215] 鱼粉还产生比所有其他处理显著更高的容器生物量（678. gOgKSSF PAT 2.4 (557.33g)和SSF PAT 2.3(542.65旨)产生下一个最高的容器生物量。浸没的^28(248.75邑） 比所有其他处理产生显著更低的生物量。商业化基于玉米的食物Still Pro 50(485.53g) 和Novi化(512.68g)产生类似的容器生物量。
[0216] SGR遵循与鱼粉类似的性能趋势(2.01)，胜过所有基于玉米的食物，但仅显著不同 于浸没WT28(0.88)。存活在组之间显著不同（p = 0.3424)。SSFPAT2.4和StillPro50具 有最高的存活率(90%)，但显著不同于其他食物处理。富尔顿丰满系数化)在处理之间无显 著不同（P = O. 1324)，但最高的是原湿饼状物喂食的鱼（1.39)，且最低的是浸没的WT28喂食 的鱼（1.24)。饲料转化率(FCR)在食物之间无显著不同（P = O. 22)。结果表明，原湿饼状物展 示出最佳的FCR(1.43)(图2)。对于实验HP-DDG共混物，SSF PAT 2.4也产生最佳的FCR (1.37)。蛋白效率比(P邸)在处理之间显著不同（P = O.028)。阳R在鱼粉中是最高的（1.25)， 随后是原湿饼状物（1.21)，且仅与浸没的WT28显著不同（0.79)。
[0217] 尸检变量
[0218] 在试验结束后，每容器五条鱼被安乐死并解剖W表征由于食物响应的鱼健康。鱼 形态学和解剖学中由于试验食物存在显著差异(表6)。
[0219] 表6。在第112天健康指数化IS，肝体;VSI，内脏体;VFI，内脏脂肪;SSI，脾体）的总 结(平均值±标准差）。
[09901
/\-j J 心 |HJ u'j W丄,JH WJ ] H 文乂、* I'丄 /了LJ-dr兀、P一u . 丄 / 〇 1又M'J " i 么 出最低的VFI(3.41)。所有固态发酵食物(SSF PAT 2.4和SSF PAT 2.3)产生了平均具有比 商业化Still Pro 50食物更高的VFI的鱼。体腔内脂肪被认为是不健康的指示。另外，过量 的脂类可影响视觉感、最终产品的气味并降低屠宰率。
[0222] 肝体指数化SI)在食物之间是显著不同的（P = O.005)。在尸检期间，一些处理鱼的 肝脏表现为具有苍白色。苍白肝色已在具有必需脂肪酸缺乏的食物饲养的其他物种中被发 现。当鱼未适当利用脂类或存在n-3/n-6脂肪酸的不平衡时。浸没的WT28具有比其他食物更 大的方差，HIS包括其他处理。脾体指数(P = O.659)或内脏脂肪指数(P = O.051)中不存在显 著的差异。
[0223] 生产过程经历了显著变化，其导致产品成本大幅减少。质量平衡的比较可见于表7 中。
[0224] 表7。第I代(液态深层的)方法和第2代(固态)方法的质量平衡
[0225]
[0226] 第1代数据来自50kg方法运行，其产生33kg产物，导致66%产品产率百分比。质量 损失发生于呼吸损失和浓缩物损失两者。第2代数据来自3.5kg方法运行，其产生3. Okg产 物，导致86%产品产率。第2代方法导致更有效的质量平衡，由于它不具有与浓缩物相关的 损失。非蛋白组分在浓缩物中的损失给予增加的蛋白浓度，但预期固态方法的进一步优化 可减轻运种影响。预期，当该方法按比例增加时，由于取样和收集损失的减少的影响，产品 回收率将被进一步改进。
[0227] 结论
[0228] 增加DDGS蛋白浓度和营养价值的DDGS的微生物提高已在研究第一阶段显示出显 著的潜力。该方法已被简化W减少成本和提高产品性能。
[0229] 该方法已在大规模试验中显示将蛋白浓度增加了超过36 % (31.93 %至43.43 % ) 的能力，且一些台架试验(bench trials)已显示超过50%的蛋白水平。由于水产饲料中的 高蛋白需求，运些结果对使用DDGS作为水产饲料成分的可行性是重要的。
[0230] 已证明，HP-DDGS的性能相比于商品DDG W及甚至相比于专口的DDGS产品如 StillPro或Novameal被改进。StillPro或Novameal与微生物转化方法的组合提供了进一步 改进W及甚至更高蛋白水平的潜力。
[0231] 微生物提高孤GS中的蛋白W开发鱼粉代替物的技术已被证明是技术上可行的、经 济上有吸引力，并且是对水产养殖饲料中代替鱼粉的高质量蛋白成分增加的需求的可持续 的解决方法。
[0232] 实施例2。在Omcan反应器(~10化)中的混合固态发酵(混合-SSF)试验
[0233] 原料选自W下列表:大豆粉(SBM)、挤压的大豆粉、孤GS、挤压的白色薄片或Novi化 Novameal。然后15%固体载量率的原料被添加至用蒸馈水浸没的生物反应器中，W达到总 计化。magrabar止泡剂（2ml)被添加，且pH使用浓硫酸被调整至期望的水平(通常3-5)。在 12rC高压灭菌30分钟之后，将材料冷却1)如果糖化阶段将要被进行，至50°C，或者2)如果 糖化阶段被省略，至30°C。当糖化被使用时，Novozyme酶化ec2(3ml)和Ctec(5ml)被添加，并 且浆料W20化pm被揽拌24小时。在冷却至30°C之后，浆料用50ml生长在5 %葡萄糖、0.5 %酵 母提取物培养基上的接种物的24培养物来接种。测试的培养物包括：出芽短梗霉物种 (A.pullulans SP. )42023、出芽短梗霉物种58522或出芽短梗霉物种Y-2311-1。在一些发酵 中，抗菌剂也被添加（例如，FERMASURE或Lactrol)。解育W200rpm进行24小时，然后被用来 接种固相基质。
[0234] OMCAN(Mississauga，ON，Canada)反应器最初被消毒，并然后原料、水、硫酸和抗菌 剂(任选的)被添加，W实现50 %的固体载量和约3的抑。该OMCAN的内容物在室溫解育120小 时，每日WlO化pm持续30分钟混合两次。样品每24小时被采取并监测干重、pH、微生物计数、 糖和蛋白。较小的样品被置于15ml具有5ml水的圆锥形管中并用于划线平板、革兰氏染色、 抑和HPLC分析。在解育之后，将剩余内含物如W上弄干、研磨并分析。
[02对结果
[0236] 表8。来自混合固态试验的结果。
[0237]
[0238」*侃酸巧、化素或氯化巧。
[0239] 如在表8中可见，使用混合SSF方法，不需要糖化W实现高于50%的蛋白含量(例如 与表4的实施例数据相比）。
[0240] 混合-SSF册SPC作为鱼粉代替物在驴鱼中的性能评价
[0241] 此前鉴定了商业可得的SPC之间的若干差异，主要在于蛋白质和氨基酸组成和抗 营养性质，其对生长性能和鱼的组成赋予了可变性。运些实验证明了开发将支持等同于或 优于含鱼粉的食物的生长性能的较高品质SPC产物的需要。饲养试验利用黄驴进行，W提供 混合-SSF册SPC大豆产物相比商业SPC和緋鱼粉对照的评价。
[0242] 每种食物制备大约12kg，包括含有Ig氧化铭/100g的2kg用于确定消化率。试验食 物配制为W42:10的适当的蛋白质：脂类目标含有等同的SPC量。具有69%的最低蛋白质含 量的大豆蛋白质浓缩物（SPC，例如，来自Solae,St.Louis,Missouri或Netzcon Ltd.Rehovot，Israel)，通过醇水溶液提取脱脂的非烘烤的白薄片制成。SPC明显不同于大 豆粉，因为它含有微量低聚糖和抗原物质大豆球蛋白和e-伴大豆球蛋白。
[0243] 干混合前，大颗粒成分WFitzpatrick粉碎机化化urst，IL)用0.51mm筛研磨。干成 分使用具有增强棒的 VI-IO 混合器（化 nguard Pharmaceutical Machinery, Inc. ,Spring, TX)混合20min。然后转移干混合的饲料原料至化bad化200混合器(Troy，OH)，其中加入油 和水并混合约5min。然后使用化bad 4146研磨机W3/16"冲模螺杆挤压饲料，及在冷却、强 制通风条件下干燥。干燥后，使用食品加工机将饲料研磨成小粒，筛分W达到一致的小粒大 小，并放置于-20°C冷冻储存。
[0244] 小粒特性
[0245] 每种食物样品一式S份分析水分（％)、水分活度(aw)、单位密度化g/m3)、小粒耐 久性指数（％ )、水稳定性(min)、和颜色化、a、b); Wn= 10个重复确定了抗压强度(g)、和直 径(mm)。水分（％ )使用标准方法2.2.2.5 (NFTA，2001)获得。2g小粒样品的水分活度(aw) W Lab Touch aw分析仪（Nocasina,Lachen SZ,Switzerland)测量。S色变量W分光光度色量 计（spectrophotocolorimeter)(LabScan XE,HunterLab,Reston,VA)作为Hunter L(亮度/ 暗度）、化nter a(红度绿度)和化nter b (黄度/蓝度)分析。单位密度(UD)通过称量100mL颗 粒并W质量（kg)除Wo. OOOlm3估算。小粒耐久性指数(PDI)根据标准方法S269.4(ASAE 2003)确定。PDI计算为:PDI(%) = (Ma/Mb)x 100,其中Ma是翻转后的质量(g)且Mb是翻转前 的质量(g)。小粒的稳定性(min)由静态(W縮)方法(Ferouz等人，Cereal Chem(2011 )88: 179-188)确定，W模拟罐中的颗粒浸取直到其被耗尽。稳定性W从浸取的重量损失/最初样 品的干重量计算。使用常规的卡错测量小粒直径。使用TA.XT Plus Texture Analyzer (Scarsdale，NY)测试了小粒的抗压强度。
[0246] 饲养试验
[0247] 黄驴(2.95g±0.05SE)被W21条鱼/罐随机放养至并联连接成闭环再循环水产养 殖系统(RAS)的28个圆形罐（110升KW双固体储水罐组成的离屯、累、生物反应器、珠过滤 器、UV过滤器、和热累保持RAS水流和水质。系统的水是市政的，将其脱氯并储存在15,2001 罐。每个处理的四个重复在罐中随机应用。水流量保持在~1.化/min/罐。溫度保持在22°C ± TC。Wysi Pro Plus (Yellow Springs Instrument Company ,Yellow Springs, OH)测量 溫度和溶解氧。氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、碱度（W化C〇3)、及游离氯使用化Ch DR 3900 分光光度计化ach Company,Loveland,CO)测试。
[0248] 鱼W手工每天两次饲养至饱食，饲养率依据罐重量、观察的生长速率和饲料消耗 评价修改。消耗（％ )从饲养的已知数量的小粒并通过计数饲养30min后未食用的小粒估算。 未食用的饲料的收集，及随后的干重也被用于估算消耗。每周的罐消耗估算值乘W每周的 配给，得到每周的消耗(g)。处理的适口性通过消耗或拒绝的饲料数量确定。每隔一周测量 罐质量(+0.Olg) W调整饲养速率并计算性能指标。每隔一周还对四条从各处理随机取样的 鱼测量个体的长度(mm)和重量(+0.Olg)。
[0249] 佑IM掉化燕化CRU的+傳责.
[0巧0]
[0251]
[0 巧 2]
[0 巧 3]
[0 巧 4]
[0 巧5]
[0 巧 6]
[0257]食物和饲养试验响应的统计分析W方差分析(AN0VA，先验a = 〇.05)进行。显著F检 验后进行了事后化key检验。
[025引其他测定
[0259] 试验分析的结束可包括最终的生长、FCR、P邸、消耗和经由剖检的对于营养不足的 检查。对赖氨酸和甲硫氨酸，可使用标准方法完成血浆测定(Plasma assay)。个体鱼可通过 颈脱位法安乐死，W便定量肌肉比、肝体指数、脏体指数、鱼片组成、及后肠组织学(肠炎的 炎症评分）。试验食物中蛋白质和能量的可用性可W使用饲料和排泄物材料中的氧化铭 (吐〇3)标志物估计(Austreng E ,Aquacul1:ure( 1978) 13:265-272)。排泄物材料可经由剖检 从肠道下部收集。
[0260] 对于试验食物中的营养物的表观消化系数(ADC)可W使用W下公式计算：
[0261 ] ADQis欄?=ADC测擲奸[(ADC测擲沪40接％|*)) X (0.7xD#%/0.3 址臘?）]
[0262] 其中D#%=参考食物糊状物（原样）的％营养(kj/g总能量)且D嫩>=测试成分（原 样)的％营养化J/g总能量）。
[0263] 实施例3dPUFA使用微生物转化的产生
[0264] 具有约5%脂肪剩余的压棒机化xpeller)提取的大豆粉被使用。材料的水分含量 按原样是约10%。大豆粉的pH和水分含量通过预混合适当量的水和酸来调整。作为实例， 8.8千克大豆粉被按量配给。单独地410克浓硫酸被混合进6升水中。粉和酸溶液然后在水平 奖式混合器中被彻底混合在一起。pH然后被证明接近于3.0的目标。然后下一步骤是添加1 升制备的金黄色破囊壶菌接种物并再次彻底混合。混合器W定时器来设置，使得它将每3小 时混合5分钟。发酵过程被允许继续进行144小时。材料在低溫炉中干燥下来并储存用于分 析。
[0265] 本文引用的所有参考文献都通过引用W其全文并入。
[0266]从上文的讨论，本领域的技术人员能确定本发明的本质特征，且可W对实施方案 进行各种变化和修改，W适应各种用途和条件而不偏离其精神和范围。因此，实施方案的各 种修改，除了本文所示和描述的那些，从前面的描述将对本领域技术人员是明显的。运些修 改也旨在落入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种生产基于非动物的蛋白浓缩物的方法，所述方法包括： 接种选自由以下组成的组的基本上干燥的基质：谷物籽粒、麸、锯肩、泥炭、油籽材料、 木肩、及其组合； 使所接种的基质经历以选自由以下组成的组的微生物的固态发酵(SSF):出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)、镜抱霉（Fusarium venenatum)、硬葡聚糖小核菌 (Sclerotium glucanicum)、少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis)、罗尔斯通 氏菌（Ralstonia eutropha)、深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum)、伊萨酵母属物种 (Issatchenkia spp)、曲霉属物种（Aspergillus spp)、克鲁维酵母属物种 (Kluyveromyces)和毕赤酵母属物种(Pichia spp)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、糖皮 侧耳菌(Pleurotus ostreatus)、根霉属物种(Rhizopus spp)、及其组合； 在小于约2至约3的pH或在大于约8的pH孵育所接种的基质；以及 回收所得的蛋白和微生物。2. 如权利要求1所述的方法，所述方法还包括混合所述微生物和所述基质以形成基本 上稳定的小粒或坯料，其中所述小粒或所述坯料在小粒或坯料之内和之间包含足够的空隙 体积，以允许基本上没有搅拌下稳定化的基质-微生物混合物的通风和加湿。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述微生物是出芽短梗霉(A.pullulans)。4. 如权利要求1所述的方法，其中所述基质是未挤压的DDGS或未挤压的DDG。5. 通过权利要求1所述的方法生产的蛋白浓缩物，其中蛋白含量是在约40 %至约50 % 之间（基于干物质）。6. -种组合物，所述组合物包含权利要求5所述的蛋白浓缩物，所述组合物完全代替鱼 饲料中基于动物的鱼粉。7. -种生产基于非动物的蛋白浓缩物的方法，所述方法包括： a) 将原料转移至第一生物反应器； b) 在水性介质中用至少一种微生物接种所述原料，其中所述微生物将释放的糖转化为 蛋白和胞外多糖并任选地将酶释放进主流体中； c) 将步骤(b)中的所述液体与酸和任选地一种或更多种抗微生物剂混合； d) 将另外的固体与步骤(c)的混合物混合以将所述步骤(c)的混合物的水分水平减少 至约40 %至约60 %并将所述减少水分的混合物转移至第二生物反应器， 其中步骤(d)的所述混合物在所述第二生物反应器中孵育足够的时间以将所述固体转 化为蛋白浓缩物。8. 如权利要求7所述的方法，其中步骤(b)在约30 °C至约50 °C进行约24小时。9. 如权利要求7所述的方法，其中步骤(d)在约25°C进行约5天。10. 如权利要求7所述的方法，其中所述微生物是真菌。11. 如权利要求10所述的方法，其中所述真菌是出芽短梗霉。12. 如权利要求8所述的方法，所述方法还包括用氮源补充所述接种物。13. 如权利要求12所述的方法，其中所述氮源选自由以下组成的组:硫酸铵、尿素和氯 化铵。14. 如权利要求7所述的方法，其中所述第二生物反应器是圆锥形或管状的。15. 如权利要求7所述的方法，其中所述发酵在外源糖化酶不存在下来进行。16. 通过权利要求7所述的方法生产的蛋白浓缩物，其中蛋白含量在约50 %至约60 %之 间（基于干物质）。17. -种组合物，所述组合物包含权利要求16所述的蛋白浓缩物，所述组合物完全代替 鱼饲料中基于动物的鱼粉。18. -种生产多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括： 接种包含作为提供的或通过添加的低PUFA脂类的基质，其中所述基质选自由以下组成 的组:谷物籽粒、麸、锯肩、泥炭、油籽材料、木肩、糖浆及其组合； 使所接种的基质经历以选自由以下组成的组的微生物的固态发酵（SSF):腐霉属 (Pythium)、壶菌属（Thraustochytrium)和裂殖壶菌属（Schizochytrium)及其组合； 孵育所接种的基质。19. 如权利要求18所述的方法，所述方法还包括添加所得的PUFA提高的材料作为动物 饲料中的成分或可选地回收所得的PUFA提高的脂类。20. -种组合物，所述组合物包含权利要求18所述的方法产物，其中所述组合物的脂类 具有约50-90 %三酰甘油含量。
【文档编号】C12P39/00GK105934519SQ201480055185
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2014年8月6日
【发明人】詹森·A·布茨马, 威廉姆·R·吉本斯, 迈克尔·L·布朗
【申请人】普莱瑞阿夸泰克公司