一种胎盘造血干细胞提取制备方法
【专利摘要】本发明公开一种胎盘造血干细胞提取制备方法，按照下述步骤制取：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A；用灌洗液分别灌洗胎盘脐静、动脉内的血液，收集灌洗后的液体B；将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C；将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，混合液离心后取细胞沉淀；将细胞沉淀通过重悬后获得所述胎盘造血干细胞。本发明节省了制备时间，有利于细胞活力的保持；整个操作过程简单有效，实验操作时间短，显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量大大提高，细胞数量较稳定。
【专利说明】
一种胎盘造血干细胞提取制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物提取技术领域，涉及一种胎盘造血干细胞提取制备方法。
【背景技术】
[0002]造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
[0003]造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。
[0004]一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，根据其来源分别称之为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，与上述三种来源的造血干细胞相比，胎盘中所含造血干细胞的数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，且移植后反应较轻且不需要采用药物。此外，作为胎盘造血干细胞来源-胎盘，来源广泛，孕妇生产后往往成为废弃物，其采集不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。诸多优点使胎盘造血干细胞有望取代骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞用于造血干细胞移植中。
[0005]人类足月胎盘存在大量的造血干细胞，比脐带血有更多的造血干细胞，而且这些胎盘造血干细胞在冷冻储存前后都可以分离出来。胎盘造血干细胞菌落形成单位(CFU)的活性是确定的，在免疫缺陷鼠中的移植实验已经证明胎盘细胞在移植中的潜力。这些结果有力地表明，人类足月胎盘有可能成为一种新型的用于移植的造血干细胞的来源。并且胎盘中有大量的造血干细胞，胎盘血干细胞是较为早期的干细胞，能在体内分化成各种细胞，胎盘血内含有丰富的各种阶段早期造血干细胞，其含量大约是脐带血的十几倍，一个胎盘中的造血干细胞可完全满足于两个成年人的需求，若能和脐带血细胞一起应用于病人，无疑大大增加了造血干细胞的含量，使这造血干细胞可完全应用于所有的适用人群。
[0006]然而本领域仍然期待有新的、更有效的方法获取造血干细胞，例如期待有新的、更有效的从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种胎盘造血干细胞提取制备方法。
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0009]—种胎盘造血干细胞提取制备方法，该方法按照下述步骤制取:
[0010]步骤I，在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A;[0011 ]步骤2，用灌洗液分别灌洗胎盘脐静、动脉内的血液，收集灌洗后的液体B;
[0012]步骤3，将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C;
[0013]步骤4，将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，混合液离心后取细胞沉淀；
[0014]步骤5，将细胞沉淀通过重悬后获得所述胎盘造血干细胞。
[0015]所述的清洗液由青-链霉素双抗与生理盐水按质量比为0.4-0.5:1-1.2混合制得，浓度为 120-130mg/L。
[ΟΟ??] 所述的灌洗液由30011^凡的青-链霉素双抗、0.05-0.111^/11^酸妥拉明，l_3mg/mL维生素C、0.5-2mmol/L PBS缓冲液和2支肝素钠注射液制得。
[0017]所述的酶解液中含有IL DEME培养液、0.01-0.05mg/mL胶原酶VIIK0.01-0.05mg/mL胰酶、10-50U/mL肝素钠、0.01-0.lmg/mL酚妥拉明与I _5mg/mL维生素C。
[0018]步骤3中，所述的胎盘剪碎至3-6cm，酶解液室温酶解0.5-1.5h。
[0019]步骤4中，所述的混合液在6-10°C，1500r/min，离心15min，弃上清，加入DEME培养液，吹打混匀。
[0020]步骤5中，所述的重悬步骤为:依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞5_15min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，取上层液体离心后弃去上清；用RPM1-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
[0021]本发明的有益效果:本发明节省了制备时间，有利于细胞活力的保持;操作方便，效率高，大大缩短的从制备到应用的周期;本发明方法从胎盘中灌洗出来的造血干细胞损伤小，数量多，纯度高，活性高，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复；
[0022]本发明酶解液比较温和，同时使用胶原酶VI和胰酶，不仅减少对细胞的损伤，还可以在短时间内更好的消化胎盘组织，释放出组织里面的造血干细胞，提高分离得到的胎盘造血干细胞的数量和活率;酶解液中血管扩张剂酚妥拉明具有良好的血管扩张作用；
[0023]整个操作过程简单有效，实验操作时间短，显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量大大提高，细胞数量较稳定；同时优化提取分离的条件，尽可能的提高造血干细胞的存活率，细胞污染率极低。
【具体实施方式】
[0024]下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]实施例1:
[0026]胎盘造血干细胞的获得，按照下述步骤制取:
[0027]步骤I，在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A，清洗液由青-链霉素双抗与生理盐水按质量比为0.4:1.2混合制得，浓度为120mg/L;
[0028]步骤2，用灌洗液分别灌洗胎盘脐静、动脉内的血液，收集灌洗后的液体B，灌洗液由300mg/L的青-链霉素双抗、0.lmg/mL酚妥拉明，lmg/mL维生素C、2mmol/L PBS缓冲液和2支肝素钠注射液制得；
[0029]步骤3，将胎盘剪碎至3cm，酶解液室温酶解1.5h，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C，酶解液中含有IL DEME培养液、0.0 lmg/mL胶原酶V1、0.05mg/mL胰酶、1U/mL肝素钠、0.lmg/mL酸妥拉明与lmg/mL维生素C；
[0030]步骤4，将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，混合液在10°C，1500r/min，离心15min，弃上清，加入DEME培养液，吹打混匀，混合液离心后取细胞沉淀；
[0031 ] 步骤5，将细胞沉淀通过重悬，重悬步骤为:依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞5min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置40min，取上层液体离心后弃去上清；用RPM1-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
[0032]本发明灌洗液组分简单，除了双抗、PBS外，含有酚妥拉明、维生素C;青-链霉素双抗具有抗菌作用，防止污染。PBS用于维持细胞内外渗透压。酚妥拉明和维生素C的作用与其在酶解液中的作用相同，维生素C用于增强细胞的抗氧化能力，提高细胞的活率;酚妥拉明起血管扩张作用，利用实验中的灌注操作。
[0033]实施例2:
[0034]胎盘造血干细胞的获得，按照下述步骤制取:
[0035]步骤I，在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A，清洗液由青-链霉素双抗与生理盐水按质量比为0.5:1混合制得，浓度为130mg/L;
[0036]步骤2，用灌洗液分别灌洗胎盘脐静、动脉内的血液，收集灌洗后的液体B，灌洗液由300mg/L的青-链霉素双抗、0.05mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C、0.5mmol/L PBS缓冲液和2支肝素钠注射液制得；
[0037]步骤3，将胎盘剪碎至6cm，酶解液室温酶解0.5h，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C，酶解液中含有IL DEME培养液、0.05mg/mL胶原酶V1、0.0 lmg/mL胰酶、50U/mL肝素钠、0.0 lmg/mL酚妥拉明与5mg/mL维生素C ；
[0038]步骤4，将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，混合液在6°C，1500r/min，离心15min，弃上清，加入DEME培养液，吹打混匀，混合液离心后取细胞沉淀；
[0039]步骤5，将细胞沉淀通过重悬，重悬步骤为:依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞15min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置20min，取上层液体离心后弃去上清；用RPM1-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
[0040]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0041]以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的【具体实施方式】。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
【主权项】
1.一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，该方法按照下述步骤制取: 步骤I，在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，然后用清洗液对胎盘进行前期清洗处理，收集处理后的液体A; 步骤2，用灌洗液分别灌洗胎盘脐静、动脉内的血液，收集灌洗后的液体B; 步骤3，将胎盘剪碎，用酶解液消化胎盘组织，收集酶解后得到的液体C; 步骤4，将上述收集的液体A、液体B与液体C并为混合液，混合液离心后取细胞沉淀； 步骤5，将细胞沉淀通过重悬后获得所述胎盘造血干细胞。2.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，所述的清洗液由青-链霉素双抗与生理盐水按质量比为0.4-0.5:1-1.2混合制得，浓度为120-130mg/L。3.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，所述的灌洗液由300mg/L的青-链霉素双抗、0.05-0.lmg/mL酸妥拉明，l_3mg/mL维生素C、0.5_2mmol/LPBS缓冲液和2支肝素钠注射液制得。4.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，所述的酶解液中含有IL DEME培养液、0.01-0.05mg/mL胶原酶VIIK0.01-0.05mg/mL胰酶、10_50U/mL肝素钠、0.01-0.lmg/mL酸妥拉明与1-5mg/mL维生素C。5.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，步骤3中，所述的胎盘剪碎至3_6cm，酶解液室温酶解0.5-1.5h。6.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，步骤4中，所述的混合液在6-10°C，1500r/min，离心15min，弃上清，加入DEME培养液，吹打混匀。7.根据权利要求1所述的一种胎盘造血干细胞提取制备方法，其特征在于，步骤5中，所述的重悬步骤为:依次用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞5-15min，离心后弃上清；用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，取上层液体离心后弃去上清；用RPM1-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
【文档编号】C12N5/0789GK105969721SQ201610570495
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】张正亮
【申请人】安徽惠恩生物科技股份有限公司