本发明涉及一种区分细胞中gsh、cys、nac荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术：
氨基酸是构成蛋白质的基本物质，并且与生物的生命活动有着密切的联系。半胱氨酸(cys)、n-乙酰半胱氨酸（nac）和谷胱甘肽(gsh)是生物体内常见的巯基化合物，在维持生物的正常生理活动中起着重要的作用。医学研究表明不正常的生理浓度可能引起很多疾病，比如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病、肌肉损伤、皮肤松弛等，它们在生物体内含量变化可以作为这些疾病诊断的依据。因此，在生理条件下高选择性、高灵敏性地检测小分子生物硫醇是非常重要的，当前已引起广泛的关注及深入研究。
目前已经应用的技术包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学检测、光学分析和质谱鉴定，这些方法仅可以在体外监测半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。荧光分子探针不仅灵敏度高选择性好，而且能够在活细胞中检测分析物，所以研究者们开始关注将荧光分子探针的这项技术应用于对体外和活细胞内的半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽进行监测或者细胞荧光成像。目前已经报导了多种基于化学反应的该类荧光探针，例如michael加成和亲核取代反应等。在这些方法中，利用迈克尔加成使荧光恢复是一种特别有效的方法。由于这三种氨基酸都含有巯基(-sh)并且在结构和反应活性上相差较小，所以这类荧光探针很难将gsh、cys和nac区分开，因此研发能够区分细胞中gsh、cys、nac的荧光探针是很有必要的。
技术实现要素：
针对现有探针对区分细胞中gsh、cys、nac区分度不够的问题，本发明提供一种反应灵敏、检测限低、特异性好的可区分细胞中的gsh、cys、nac的荧光探针co-na，可用于评价和研究细胞内gsh、cys、nac的生理功能。
本发明的另一目的是提供一种简便地合成上述区分细胞中gsh、cys、nac的荧光探针co-na的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种区分gsh、cys和nac的荧光探针，简称为co-na，具有如式（i）所示的结构：
式（i）。
一种上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
2,3,3-三甲基吲哚季铵盐与7-二乙胺基-3-氯-4-醛基香豆素在哌啶存在下于乙醇中加热反应，反应结束后分离提纯得荧光探针。
所述2,3,3-三甲基吲哚季铵盐、7-二乙胺基-3-氯-4-醛基香豆素与哌啶的摩尔比为0.8-1:1-1.2:1。
所述加热温度为70-80℃，加热时间为8-10h。
所述分离提纯步骤优选为将溶剂蒸馏除去，然后以二氯甲烷：甲醇=40:1（v/v）为淋洗液，使用柱层析提纯。
合成路线如下：
一种上述荧光探针用于检测溶液或细胞中gsh、cys或nac的应用。
本发明中荧光探针的识别机理如下：
gsh、cys和nac结构如下所示，均能够与本发明所述区分细胞中gsh、cys、nac的荧光探针co-na发生反应：
荧光探针本身由于7-二乙胺基与吲哚季铵盐之间组成强推拉电子体系使探针的荧光发射在670nm左右。当探针与gsh分子作用后，化合物co-na的与gsh发生迈克尔加成反应，导致探针推拉电子体系能力降低，使得荧光蓝移至525nm。当探针与cys分子作用后，化合物co-na的与cys发生亲核加成反应，导致探针推拉电子体系能力降低，使得荧光蓝移至460nm。当探针与nac分子作用后，化合物co-na只与nac发生亲核取代反应，波长没有变化。
识别反应如下：
本发明具有以下优点：
本发明的co-na荧光探针是一种简单，快速，灵敏的区分细胞中gsh、cys、nac的探针；在低浓度下即可特异与细胞中gsh、cys、nac反应，抗多种活性氧、氨基酸及含巯基化合物的干扰；在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为co-na的1hnmr谱图；
图2为co-na荧光探针对不同分子或离子的选择性；
图3为不同浓度的gsh下co-na的荧光强度与波长；
图4为不同浓度的cys下co-na的荧光强度与波长；
图5为co-na荧光探针对细胞内nac、cys、gsh荧光图像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1co-na荧光探针的合成：
将化合物2,3,3-三甲基吲哚季铵盐(1.9g,10.0mmol)、化合物7-二乙胺基-3氯-4-醛基香豆素(2.6ml,12.0mmol)与哌啶(1ml,10.0mmol)加入到20ml乙醇溶液中加热回流8h，反应结束后将溶剂除去，使用柱层析提纯（二氯甲烷：甲醇=40:1，v/v），最终获得化合物co-na；其1hnmr谱图如图1所示。
实施例2co-na荧光探针对不同分子或离子的选择性
将实施例1中co-na荧光探针配制成浓度为1mm的母液。
将下列物质br-,clo-,cu2+,f-,fe2+,h2o2,hclo,hg2+,hpo42-,mg2+,n3-,na+,na2s,nahs,no2-,no3-,oac-,onoo-,s2o32-,scn-,so42-,zn2+,单线态氧,nac,gsh,hcy,cys以磷酸缓冲液（0.01mm，ph=7.4）配制成5ml浓度为40mm的母液。
取28支试管，分别加入25μl探针母液、225μldmso和各离子或分子的母液，对照以等量水代替干扰物质；用磷酸缓冲液（0.01mm，ph=7.4）定容至5ml，使各离子或氨基酸的终浓度为3mm，活性氧和活性氮的终浓度为100mm。各溶液摇匀后进行荧光检测（λex=614nm,λem=770nm）；40min后再次检测（λex=614nm,λem=770nm）。以770nm荧光强度为纵坐标，以不同分子或离子为横坐标作图2；其中，1-28分别为co-na,br-,clo-,cu2+,f-,fe2+,h2o2,hclo,hg2+,hpo42-,mg2+,n3-,na+,na2s,nahs,no2-,no3-,oac-,onoo-,s2o32-,scn-,so42-,zn2+,单线态氧,羟基自由基,gsh,hcy,cys。由图2可以发现，其他离子或分子的加入荧光强度几乎没有影响，而探针能够根据波长的变化对nac、cys、gsh进行很好的区分。
实施例3不同浓度的gsh下co-na的荧光强度与波长变化
配制10ml浓度为100mmgsh的母液，并用水稀释为1-9mm共17个等差浓度，以水为对照。将实施例2中co-na母液稀释为5μm，分别加入不同浓度的gsh，反应40min后进行荧光检测（λex=480nm,λem=700-500nm），检测各体系中荧光强度，以荧光强度-gsh浓度作曲线，如图3所示。由图可知，当gsh浓度为最低的试验浓度（2μm）下，co-na即有荧光响应；随着gsh浓度的增加，反应体系不但荧光强度增强，发射波长也发生蓝移，当gsh浓度达到40μm时，反应体系荧光强度在525nm达到饱和状态。
实施例4不同浓度的cys下co-na的荧光强度与波长变化
配制10ml浓度为100mmcys的母液，并用水稀释为1-9mm共17个等差浓度，以水为对照。将实施例2中co-na母液稀释为5μm，分别加入不同浓度的cys，反应40min后进行荧光检测（λex=380nm,λem=600-400nm），检测各体系中荧光强度，以荧光强度-gsh浓度作曲线，如图3所示。由图可知，当cys浓度为最低的试验浓度（2μm）下，co-na即有荧光响应；随着cys浓度的增加，反应体系不但荧光强度增强，发射波长也发生蓝移，当cys浓度达到40μm时，反应体系荧光强度在460nm达到饱和状态。
实施例5co-na荧光探针对gsh、nac、cys细胞成像
将本发明荧光探针co-na应用于hela细胞中进行荧光成像，得图5，具体操作步骤如下：
（1）将4份密度为3×105个/ml的hela细胞在温度为37℃，co2浓度为5%的培养箱中培养至细胞贴壁；
（2）取一份细胞，加5μmco-na孵育40min，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下分别明场、dapi（625-675nm）通道、fitc（500-550nm）通道、tritc（500-550nm）通道和cy5（610-675nm）通道成像，激发波长为614nm；
（3）取另一份细胞，加5μmco-na孵育40min，加入gsh孵育30min后，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下分别明场、dapi（625-675nm）通道、fitc（500-550nm）通道、tritc（500-550nm）通道和cy5（610-675nm）通道成像，激发波长为480nm；
（4）取另一份细胞，操作同（3），不同在于将gsh换为cys，激发波长为360nm；
（5）取另一份细胞，操作同（3），不同在于将gsh换为nac，激发波长为614nm。
由图5可知，荧光探针co-na可以与细胞内gsh、nac、cys反应，gsh与co-na反应后在tritc和fitc通道能够检测到信号，cys与co-na反应后在fitc和dapi通道能够检测到信号，单独荧光探针co-na或nac与co-na反应过后仅在cy5检测到信号，说明gsh或cys与co-na反应后能使发射波段发生明显的蓝移，nac与探针反应后发射波段没有变化。