[0070] -些研究人员对产甲烷型RFA-P合酶进行了部分纯化和表征，并且来自闪烁古生 球菌（Archaeoglobusfulgidus)的酶被纯化至均一，克隆并且异源性地过表达。所述反应 经由氧基碳正离子中间体和它与pABA的加合物进行（Rasche和White，1998)。然而，最重 要的是，其它研究小组（Dumitru等，2003)集中在设计作为pABA的结构类似物的竞争性抑 制剂。抑制RFA-P合酶的pABA类似物具有高度选择性，这是因为氨基是大部分的pABA依 赖性反应中的亲核体，而环碳4是RFA-P合酶催化的反应中的亲核体。
[0071]
[0072] 由Dumitru等（2003)所提出的抑制剂在产甲烷菌的纯培养物中损伤RFA-P合酶 活性并且抑制产甲烷。向培养物中供给过量的天然底物pABA减轻了所述抑制作用，这表明 RFA-P合酶是细胞靶标。所述抑制剂对产乙酸型细菌的生长没有不利影响。
[0073] 必须指出的是，pABA还更广泛地被称为维生素B10。维生素B10是复合维生素B 的一部分并且被认为是水溶性维生素。pABA是蝶酰谷氨酸酯的组分；它曾经被认为是维生 素并且被命名为维生素B-x，这是因为它作为维生素原用于一些细菌。
[0074]Dumitru等（2003)合成了各种抑制剂，所有这些抑制剂均是pABA的N-取代的衍 生物，并且使用PFA-P合酶来测定它们的抑制常数。结果表明在RFA-P合酶中pABA的结合 位点在氨基附近具有相对大的疏水袋。测试所述pABA类似物中的每一种抑制产甲烷菌马 氏甲烧杆菌（M.marburgensis)(原先被称为嗜热自养甲烧杆菌）的产甲烧作用和生长的能 力。在生长完全受到抑制的马氏甲烷杆菌培养物的顶空中测量到很少量的甲烧。在ΙΟΟηΜ， 目前最强效的抑制剂，即4-[(2_吡啶甲基）氨基]苯甲酸完全抑制了马氏甲烷杆菌的产甲 烷菌生长和甲烷形成。将培养基补充以pABA完全逆转了抑制作用，这表明pABA与抑制剂 之间在细胞靶标处的竞争性相互作用，所述细胞靶标最有可能是RFA-P合酶。
[0075] 产乙酸作用是在许多的无氧生境中与产甲烷作用竞争的一种厌氧的和氢营养型 细菌过程。测试所述抑制剂中的每一种对产乙酸型细菌热醋穆尔氏菌（M.thermoacetica) 的生长的影响。甲烷蝶呤并不是细菌存活所必需的；因此，在此所述的RFA-P合酶抑制剂中 没有一种在高达ImM的浓度下影响了热醋穆尔氏菌的生长（Dumitru等，2003)。
[0076] 测试所述抑制剂对甲烷形成和挥发性脂肪酸（VFA)产生的影响。5mM的4-(乙氨 基）苯甲酸酯或9mM的4-(异丙基氨基）苯甲酸酯完全抑制了甲烷的产生。5mM的4-(2-羟 基乙氨基）苯甲酸酯将甲烷的产生抑制到对照水平的2. 5%。作为对照，ImM的溴代乙磺酸 盐（一种甲基-辅酶Μ还原酶抑制剂）在所有实验中均完全抑制了（P< 0. 01)甲烷的产 生（Dumitru等，2003)。
[0077] 还测试了有效抑制剂中的一些对VFA产生的影响。以完全阻止产甲烷的浓度添加 RFA-P合酶抑制剂没有抑制VFA的产生。举例来说，当将7mM的4-乙氨基苯甲酸酯添加到人 工瘤胃系统中时，相对于未暴露于抑制剂的对照，乙酸盐（P< 〇. 05)和丙酸盐（P< 0. 10) 水平升高。这些结果与使用产乙酸型细菌的纯培养物进行的研究是一致的，并且表明所述 抑制剂对其它细菌没有不利影响（Dumitru等，2003)。
[0078] Sharma等（2011)测试了洛伐他汀（Lovastatin)和康帕克汀（Compactin)(美伐 他汀（Mevastatin))在产甲烷期间对来自史氏甲烷短杆菌的F42。依赖性NADP氧化还原酶 所具有的潜在抑制作用。基于他们的研究结果，发现洛伐他汀和康帕克汀（美伐他汀）这 两种化合物均有效作为F42。依赖性NADP氧化还原酶蛋白质的潜在抑制剂。
[0079] 根据本发明，本发明的组合物内的天然存在的他汀类药物（statin)发挥了抑制 产生甲烷的生物体的途径内的甲烷产生的功能。一种这样的天然存在的他汀类药物是洛伐 他汀，它可以从红曲米以及其它来源中获得。洛伐他汀（C24H3605)是真菌生长繁殖期（次生 相）的次生产物并且是酶3-羟基-3-乙基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶（人类的胆 固醇产生途径中的关键酶）的抑制剂。人类的胆固醇形成与古菌的细胞膜形成之间存在相 似性，这是因为古菌的细胞膜中磷脂的脂质侧是类异戊二烯链。类异戊二烯形成是胆固醇 产生途径（甲羟戊酸途径）的中间步骤并且HMG-CoA还原酶也是产生它的关键酶。因此， 作为HMG-CoA还原酶的抑制剂，洛伐他汀抑制了古菌中类异戊二烯的产生并且因此抑制了 胆固醇的合成和膜的形成。Wolin和Miller(2005)证实洛伐他汀显著地减少了纯产甲烷细 菌的生长和活性而对纤维分解细菌没有任何负面影响。
[0080] 如上所述，F42(]H2-NADP是在催化NADP+与F42。之间的电子转移步骤期间起作用，从 而通过接受来自F42。的一个或多个氢负离子（H)将NADP还原成NADPH的辅酶中的一种。
[0081] Sharma等（2011)确定了来自史氏甲烷短杆菌的F42。依赖性NADP氧化还原酶的三 维模型结构。基于他们的F42。依赖性NADP氧化还原酶的蛋白质模型，他们检测到这些残基 构成了配体结合位点袋，并且在进一步研究之后，他们发现配体F42。结合在蛋白质腔处。抑 制剂化合物洛伐他汀和康帕克汀（美伐他汀）与天然配体F42。相比对模型蛋白质显示出更 大的亲和力。它们与F42。共用相同的腔并且由相似的残基围绕。换句话说，抑制剂化合物 洛伐他汀和康帕克汀（美伐他汀）非常有效地阻断用于产生甲烷的活性位点，这是因为酶 不能与底物结合，从而使得甲烧产生减少。洛伐他汀是从土曲霉（Aspergillusterreus) 的培养物中分离的真菌代谢物并且康帕克汀（美伐他汀）是来自短密青霉菌（Penicillium brevicopactum)的抗真菌代谢物。Sharma等（2011)确定洛伐他汀和康帕克汀（美伐他 汀）可以用作F42。依赖性NADP氧化还原酶蛋白质的强效抑制剂以阻断它的活性位点。
[0082]
[0083] 研究人员已经发现红曲米，一种通过使酵母（紫红曲霉（Monascuspurpureus)) 在水稻上发酵而制成的亚洲主食，含有诸如洛伐他汀的他汀类药物的活性成分。因此，研究 已经证实红曲米可以成功地抑制关键酶羟基甲基戊二酸单酰-SCoA(HMG-CoA)还原酶，从 而引起对产甲烷活性的抑制。
[0084] Miller和Wolin(2001)还使用洛伐他汀来抑制关键前体甲羟戊酸酯的形成。甲羟 戊酸酯是由羟甲基戊二酸单酰-SCoA(HMG-CoA)的还原而形成的。基于他们的结果，他们发 现洛伐他汀抑制甲烷短杆菌的生长和CH4的产生。实际上，每毫升培养基4nmol对生长产 生50%的抑制作用并且每毫升培养基多lOnmol的浓度完全抑制生长。甲烷形成也被显著 抑制。同时，非产甲烷菌的群体没有受到影响。
[0085] 辅酶M(C〇M;HSCH2CH2S03)是存在于所有产甲烷菌中，但是不存在于其它细菌或古 菌中的辅因子（Liu和Whitman2008)。CoM参与甲烷生物合成的最终步骤，其中由CoM所 带有的甲基由甲基-CoM还原酶还原成甲烷。涉及这一组的产甲烷抑制剂通常包括2-溴 代乙磺酸盐（BES)、2-氯代乙磺酸盐（CES)、2-巯基乙磺酸盐（MES)、以及2,4-二氧四氢蝶 啶（Liu等，2011)。这些抑制剂可以竞争性地制约在使用氏和0)2的产甲烷菌中在甲烷形 成期间的最终还原步骤时的甲基转移反应。在正常情况下，这些化合物可以相对低的浓度 抑制所有组的产甲烷菌。CoM和BES的传统结构类似物已经被广泛使用并且在微生物研究 中被认为是产甲烷菌特异性抑制剂。Conrad等（2000)报道10mMBES是抑制水稻根系中 的厌氧产甲烷菌的最佳浓度。在厌氧消化器的高温环境中，通过使用至少50mM的BES实 现了对产甲烷的完全抑制。与乙酸分解型产甲烷菌相比，抑制氢营养型产甲烷菌需要更高 的BES浓度（Zinder等，1984);然而，类似的系统只需要10mM的BES来抑制产甲烷过程 (Siriwongrungson等，2007)。其它研究证实在土壤中5mM-20mM的浓度（WUst等，2009)确 实有效抑制产甲烷。MES和CES也具有相似的抑制作用并且用于降低连续流产甲烷固定膜 柱中的产甲烷活性（Bower和McCartyl983)。各种报道证实蝶呤化合物2,4_二氧四氢蝶 啶[2,4-(1H，3H)-蝶啶二酮]以0.6mM的浓度完全抑制多种产甲烷型古菌的生长并且对于 嗜热自养甲烷杆菌菌株马尔堡（Marburg)菌株具有杀细菌性（Nagar-Anthal等，1996)。
[0086] 因此，上文被认为是仅说明了本发明的原理。此外，由于许多的修改方案和变化方 案将容易被本领域技术人员想到，因此并不期望将本发明限于所示的和所描述的确切构造 和操作，并且因此，可以采用