用亲水性聚合物助剂减弱生物分子的吸附的制作方法

专利名称：：用亲水性聚合物助剂减弱生物分子的吸附的制作方法
技术领域：
：本发明涉及流控技术，尤其是微流控技术。
背景技术：
：微流控技术涉及到微型流体设备；通常将该技术定义为在至少大小小于1毫米的通道中典型地处理较小的流体体积(亚毫升体积)的技术。当然，该定义是灵活的，并且本发明能用于具有不同构造和不同大小的设备中。事实上，存在根本没有限制通道的微流控设备。典型的微流控设备具有微型机械结构(微通道、微阀门等)并使用各种流体运动方法，比如机械部件(例如，微型泵)液压装置/方法和基于电的效应(电泳、介电泳、电渗析、电润湿、光-电润湿、这些效应的变形以及其他效应)。在生物医学应用中，一些微流控设备被设计以进行试样处理，包括浓缩、过滤、洗涤、分配、混合、传送、分样、溶解试样以及其他的试样处理操作。生物分子吸附对微流控设备来说是一个问题，这是因为在试样处理、操作或检测期间暴露于试样液体的表面会因各种生物分子的吸附而变"脏"。因不希望有的生物分子的表面吸附而导致的表面性能的改变会导致交叉污染、损失可用于感应的靶分子、降低感应表面、和/或降低表面效应的被动控制和主动控制、需要用于试样处理的阀门和其他机械效应。一个己知的减弱生物分子吸附的方法是在试样处理之前用封闭剂预处理或涂覆微流控设备的表面。例如，"聚乙二醇化"是指用聚乙二醇(PEG)预涂覆微观流体表面以阻断试样处理期间的非特定吸附。PEG的反应衍生物可用于确保其共价结合到表面上。附加的封闭剂包括各种常用的包含大分子比如普通蛋白质和较小分子的亲水物质，该亲水物质可以包括羧酸衍生物、碳水化合物、甚至含硅化合物。当表面能经封闭剂的被动吸收而"聚乙二醇化"(包括用其他的封闭剂处理)时，通常优选在封闭剂与表面间产生共价联接。预处理或预涂覆微流控设备以防止非特定结合的一个可能的缺点是，该处理会导致表面特性的永久改变，从而会妨碍为获得局部和间歇的试样处理效果所需的对表面效应(吸附、润湿性等)的主动控制。用封闭剂预涂覆的另一缺点是，特定的试样液体或分子需要特定的封闭剂或表面涂覆，从而使设备不适用于其他的试样分子或试样液剂。
发明内容正如所料，不同类型的分子具有不同的污染流控技术表面的倾向。生物试样中的蛋白和其他组分(即"生物分子")通常具有异乎寻常的污染效果。我们已经发现，通过在相关操作之前将某些亲水性聚合物与试样液体混合，能被动地和主动地减弱微流控设备表面的分子吸附。至于"亲水性聚合物"，是指包含亲水基团比如羟基基团的重复性单体的有机聚合物，优选该聚合物是两亲性的并至少具有一些表面活性剂特点，即能降低表面张力、并且/或者与疏水物质和亲水物质均能相互作用。人们相信，有效的亲水性聚合物或许可以通过代替污染分子占据表面位置、或通过与污染分子相互作用，以防止它们与表面结合，从而防止在许多类型的微流控设备中所发现的污染分子与表面的结合。有时候，亲水性聚合物可以因主动诱导的表面电荷而暂时和局部地聚集在表面处。该聚集既可发生在带电聚合物中，也可发生在具有充足的偶极矩的聚合物中以响应诱导的电荷。在表面上或附近的亲水性聚合物的存在能防止或屏蔽污染分子与表面随后进行的相互作用。当表面吸附因此而减弱时，微流控设备可容易地处理包含生物分子的试样，从而实现活性试样的浓縮、过滤、洗涤、传送、混合及其他试样处理操作。一个优选的减弱方法是向试样液体中实际添加亲水性聚合物。在该情况中，亲水性聚合物分子可直接与污染分子相互作用或另外屏蔽住污染分子，从而防止污染分子结合到表面上。在某些情况中，简要的预处理可以防止或减轻污染，同时不出现于传统的表面涂覆技术中常见的表面特性的永久改变。微流控设备中的分子吸附污染可以用较宽范围内的亲水性聚合物和聚合物表面活性剂成功地降低，该聚合物表面活性剂尤其为非离子型表面活性剂，包括(但不限于)普卢兰尼克表面活性剂、聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、聚山梨酸酯(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯或Tweej^)、聚氧乙烯辛基苯基醚(TritonX-I00)、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸(和交联的聚丙烯酸比如卡波姆)、聚苷(非离子型的配糖表面活性剂比如辛基果聚糖)和可溶性多糖(和其衍生物)比如肝素、葡聚糖、甲基纤维素、丙基甲基纤维素(及其它纤维素酯和醚)、糊精、麦芽糖糊精、半乳甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、P-葡聚糖、藻酸盐、琼脂、角叉菜胶、和植物胶比如黄原胶、车前草、瓜尔胶、胺黄树胶、刺梧桐树胶、印度胶和阿拉伯树胶。为实现与特定的微流控试样的最大相溶性，可选用特定的助剂。在粘度较低的聚合物中，降低表面污染所需的这些助剂的体积浓度重量可从低于0.01%到高于25%(w/v)。两性分子显示出是最有效的亲水性聚合物。聚合度(即平均每个聚合物链中的单体数目)的范围也是相当得宽这些助剂的分子量也可以从几百到几万。我们已经发现，表面污染的降低对特定的亲水性聚合物助剂的分子量(MW)、浓度或种类敏感。例如，较高分子量的聚合物比较低分子量的相同单体成分的聚合物更显著有效。虽然大多数测试使用单个亲水性聚合物进行，但几种聚合物的混合物也是有效的，并可以显示出特别的优点。具体实施方式本发明提供下述说明，以使本领域的所有技术人员均能使用本发明，接着列举实施本发明的发明人预期的最佳方式。然而，由于本发明的一般原理在此已被具体地定义为提供一种用于防止微流控设备中的表面污染的方法，故该方法的各种变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。试验结果本发明体系如何在存在"污染"剂的条件下允许微流控试样处理的一个实施例，通过使用一组进行基于介质上电润湿(EWOD)的液滴驱动的微流控设备而得以实施[参见作为EWOD背景知识的1)J.Lee，H.Moon，J.Fowler，T.Schoellha匪er和C,J.Kim，"用于微量液体处理的电润湿和介质上电润湿"，SensorsandActuators,Vol.A95，2002，pp.259-268;和2)S,K.Cho，H.Moon和C.-J.Kim，"通过用于数字微流控电路的基于电润湿驱动的产生、传送、中断、和合并液滴"，JournalofMicroelectromeehanicalSystems,Vol.12巻，2003，pp.70-80]。将EWOD用于测试的原因至少有两个1)EWOD对表面性能极其敏感，于是不用借助放射性化合物等就能较容易地对污染效应进行检测；和2)EWOD在许多微流控应用领域中是极其有用的，这是因为它的敏感性不会容易地与许多生物分子一起被利用(至少本发明如此)。应当注意，一旦EWOD表面已被污染，那么将极其困难或甚至基本不可能恢复设备的正常运行。EWOD是与电润湿机理相关的许多手段中的一种。至于电润湿机理，是指使用电润湿方法以控制和移动流体液滴。已使用几种不同的生物分子作为试验的污染剂。水溶性球状蛋白辣根-过氧化物酶(HRP)(MW40,000)用于许多受EWOD自动控制的诊断过程，但不幸的是，HRP是非常有效的污染剂。因此，在此我们选用HRP以说明在EWOD环境中的本发明。作为对照，将25R1的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中HRP液滴(1.0units/ml-0.1mg/ml)沉积在EWOD设备的活性表面上。然后施加各种直流(DC)和交流(AC)驱动电压(20100伏的均方根)和驱动频率(1010,000Hz)以移动液滴。没有观察到液滴的移动，从而证实了HRP作为污染剂的效力。将0.01%w/v的聚乙二醇(PEG)(MW=3,300)添加到PBS溶液中的HRP中。然后将25^1的PEG/HRP溶液的液滴沉积在EWOD设备上。接着施加相同参量的驱动电压。观察到液滴的快速移动并且该移动在预定路径上重复进行。由此可见，少量的PEG能克服HRP污染，从而使利用EWOD的微流控设备能处理含HRP的试样。应当注意，极低浓度的污染剂比如HRP能抑制通常的EWOD效应。由于几乎在涉及生物试样的EWOD的所有使用中均可能发现类似的蛋白，故本发明克服该问题的能力可使EWOD操作的使用延伸到较宽范围的诊断和生物技术应用领域。类似地，创造性地向其它微流控设备添加有效的亲水性聚合物，较易防止分子污染从而避免复杂性和永久性表面涂层的缺点。进行附加的试验以研究聚合物大小(即聚合物的MW)的影响。使用如上所述的EWOD条件，但使用不同的污染剂。在这些试验中，以仅50ng/ml为最小浓度(约为上述使用的HRP重量的一半)使用可变浓度的牛血清白蛋白(BSA)。BSA是具有约67,000的分子量的球状蛋白，其作为蛋白保护剂用于许多生化试验中。此外，这对将出现在涉及人血和许多其他人源液体的试验中的人血清白蛋白来说也是一个合理的模型。因此，克服因白蛋白引起的污染是非常重要的。由于BSA具有更高的分子量和更低的试验浓度，故在上述试验中存在比HRP分子更少的BSA分子-这仅仅突出了BSA作为污染剂的效果。进行一系列的试验以确定能有效地克服不同浓度BSA的负面影响的各种PEG聚合物的浓度。在试验中，用如表1所示的不同浓度的BSA和不同浓度的PEG配制试液。换句话说，试验条件与HRP试验中的相同，并且使25pl的各个试液的液滴经历测试的EWOD运动。该表表明了克服特定浓度的BSA所需的PEG浓度一即允许含BSA的液滴被EWOD驱动。表1:各种分子大小的PEG聚合物克服各种浓度的BSA所需的PEG浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>这些结果表明，在聚合物长度或大小(MW)与效果之间存在显著的令人惊奇的关系。至于PEG聚合物，聚合物越大，抗污效果越好。因此，在50pg/ml的BSA浓度处，将聚合物MW从400增加到6000会使所需的PEG的浓度从10%降低到0.01%(wt%)。该关系是偶然的，这是因为较高MW的聚合物倾向于更有粘性，只是极大增加的效力消除了过高粘性的任何问题。在给定MW的聚合物中，在BSA的含量与PEG的有效量之间存在粗略的关系。对于400MW的PEG，在其浓度系列的低浓度端，BSA浓度的加倍需要加倍量的PEG。对于更高浓度的BSA，较小增加量的PEG是完全有效的。然而，对于MW为6000的PEG，虽然很低总浓度的PEG是有效的，但BSA浓度的加倍需要十倍增加量的PEG(至少在较低的浓度处)。此时对该行为进行说明不易理解。然而，该效果表明更高分子量的聚合物可能是优选的，直至达到极限粘度为止。在实际的生物实验室测试情形中，不可能预先确切地知道污染物存在的水平。因此，需要制备具有足够高效力的试剂以压制可预期的最恶劣的污染状况。按表l所示的那些曲线关系进行的试验可以相当简单地确定不同聚合物抑制各种水平污染剂的相对效果。于是，可以选出具有可能最低浓度的最有效的防污试剂。也就是说，一旦测试表明特定的试样或特定类型的试样包含污染剂，就可以制备其中添加了一系列浓度的多种候选亲水性聚合物的试样基体。然后用EWOD分析试样，以确定哪种候选的聚合物能最有效地克服污染(即，最低浓度的效力)。一些亲水性聚合物显示出即使在测试的最高浓度处也是无效的。例如，许多品级的葡聚糖聚合物是可用的。在医学中使用葡聚糖以包覆血小板，于是预期这些聚合物对降低污染可能是有效的。测试表明包含葡聚糖的液滴在测试的EWOD设备中被正常地驱动。也就是说，在葡聚糖具有包覆性能的同时，其本身并不会成为污染剂。然而，20wt。/。的两种不同的葡聚糖聚合物(3,000MW和25,000MW)的溶液在防止BSA污染上是完全无效的。尽管存在如下事实，即该重量百分比是在使用PEG聚合物时具有较高效果的重量范围内。就这点来说，不能确定葡聚糖聚合物是否仅是无效的，或者受测聚合物在测试的浓度处是否具有不足的有效单体数。至于PEG，显而易见，较长的聚合物(有较多的单体单元)是更有效的。在葡聚糖中，每个单体(葡萄糖分子)都比PEG的那些单体(乙二醇分子)大得多。因此，测试的葡聚糖聚合物可能仅是因为单体数不足(这些结果也暗示糖在防止污染中可能是本质上更低效的单体)。然而，人们相信水溶性的葡聚糖可能具有不充足的两亲性以提供防污染效果。该推测与如下发现相一致，即具有显著表面活性剂特性的亲水性聚合物显示出最显著的防污染性能。可进行下述试验以确认聚山梨酸酯(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯或Tween-2(f)如何有效地防止BSA的污染效果。该试验与上述BSA试验相同。用300pg/ml的BSA溶液进行该试验。结果发现，仅需O.OP/。wt/v的聚山梨酸酯表面活性剂就足以克服该含量的BSA的污染效果。这相对于显示出较弱表面活性剂特性的PEG有了IOO倍的提高。对于较低浓度的BSA，该表面活性剂显得更有效。对于200pg/ml的BSA溶液，仅需0.005%wt/v的聚山梨酸酯，这相对于PEG有了200倍的提高。可以预料，具有类似化学结构的更高分子量的表面活性剂(例如Tween-8(f)将更有效。当对另一表面活性剂聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯与聚氧乙烯辛基苯基醚(TritonX-10(f)进行平行试验时，结果也发现其比PEG有效得多。对于30(Hig/ml的BSA溶液，仅需约0.005%wt/v的聚氧乙烯辛基苯基醚以避免污染效果。然而，并非所有的亲水性聚合物均是有效的。例如，测试已经表明聚乙烯醇(PVA)本身是极其有效的污染剂。使用的PVA具有平均值为60100,000的MW。向测试液滴中添加PVA，使得液滴不可能通过EWOD而移动，即使没有BSA也是如此。已知PVA具有显著的成膜性能；可能是PVA包覆了EWOD表面，从而抑制表面张力的任何改变。有可能较小的聚合物或许不是污染剂，而实际上可能是防污剂。换句话说，有可能当亲水性聚合物变得太大时，它们会变成污染剂而不是防污剂。于是应当将如下权利要求理解为包括了如上所述具体说明的内容、概念上等效的内容、明显可替换的内容、以及实质上结合有本发明主要构思的内容。本领域的技术人员对上述优选实施方式所作的各种改进和修改均不超出本发明的保护范围。已列举的实施方式仅用于示例，不应看作是对本发明的限制。因此，应当理解，在附后的权利要求的范畴内，可以用不同于此处具体说明的方式来实现本发明。权利要求1.一种用于防止分子吸附于微流控设备表面的方法，其包括添加一定量的能够有效防止微流控设备中所用试样的表面吸附的亲水性聚合物的步骤。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述亲水性聚合物是非离子型表面活性剂。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自于由聚氧乙烯辛基苯基醚和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯所构成的组。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自于由聚乙二醇和甲氧基聚乙二醇所构成的组。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述微流控设备利用了选自于由机械效应、电效应、光学效应、化学效应及上述效应组合所构成的组。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微流控设备采用了液滴。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电效应被用于实施选自于由电润湿、光-电润湿、静电、电泳、介电泳、电渗析和上述机制组合所构成的组的机制。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述电效应用于操控液滴。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微流控设备利用了电润湿机制。10.—种用于选择最佳亲水性聚合物以防止污染电润湿型微流控设备的方法，包括如下步骤使用电润湿型微流控设备对第一等份的包含潜在污染剂的流体试样进行处理；以及如果电润湿微流控设备被所述第一等份的流体试样污染，则通过如下步骤测试侯选亲水性聚合物组将侯选亲水性聚合物组中的各个成员添加到多个等份的流体试样中并逐渐增加所述成员的量，从而获得包含一系列浓度的各个成员的等份试样；对所述多个等份试样中的各个试样进行处理，以确定任一所述等份试样是否能防止污染;以及选取最佳的亲水性聚合物作为以最低浓度防止污染的亲水性聚合物组中的成员。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述亲水性聚合物是表面活性剂。全文摘要通过在相关微流控操作期间或之前将某些亲水性聚合物(具有重复的亲水基团的有机聚合物-优选聚合物是两亲性表面活性剂)与试样液体混合，能被动地和主动地减弱微流控设备表面的分子吸附。非离子型表面活性剂比如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和聚氧乙烯辛基苯基醚尤其有效。高分子量的聚乙烯聚合物也是有效的。亲水性聚合物显示出通过代替污染分子占据表面位置、或者通过与污染分子相互作用以防止污染分子与表面的结合，从而防止污染分子结合到微流控设备上。当表面吸附因此而减弱时，微流控设备可容易地处理包含生物分子的试样，从而实现活性试样的浓缩、过滤、洗涤、传送、混合及其他试样处理操作。文档编号B01L3/00GK101237934SQ200680026250公开日2008年8月6日申请日期2006年5月18日优先权日2005年5月21日发明者义贞·布兰登·李,彼得-帕特里克·德古茨曼,韦恩·博-文·刘申请人:精华微技有限公司