综合微液体装置及其方法

专利名称：综合微液体装置及其方法
技术领域：
本发明有关于微液体领域和应用微液体于生物化学和分子生物学领域上。本发明 还涉及综合微液体平台仪器和相关的方法。本发明亦有关于使用微液体装置于预备，扩增 和检测目标生物学分子如核酸。本发明亦有关于使用微液体装置预备，扩增和检测目标生 物学分子如核酸的方法。
背景技术：
分子生物学可以概括地定义为处理大分子如核酸和蛋白的组成，结构和功能，和 其在细胞复制和传递遗传讯息的角色，以及操纵核酸以使其可以顺序，突变，和进一步在一 生物的基因组内作操纵以研究所述突变的生物学效果的一门生物学分支。常规生物化学和分子生物学的实践，可以经常需要到与所述研究对象体积成反比 的实质工序资源。例如，预备和纯化一个生物学样本如核酸片段的仪器和化学工序，及其预 期的分析可能需要一个备有无菌设施的标准生物实验室。此外，将所述核酸片段以聚合酶 链反应(PCR)工序进行扩增可能通常地需要到一个规模相当的环境隔离设施。2.1微液体系统“微液体"普遍地指处理体积细小的流体的系统，装置，和方法。微液体系统可以 整合成一变化广阔的操作以操纵流体。这些流体可能包括化学或生物学的样本。这些系统 亦有多种应用范围，例如生物学上的分析(用于如医学诊断，新药研发和药物传输技术)， 生物化学感应器，或大体上的生命科学研究和环境分析，工业工序监察和食品安全测试。其中一种微液体装置是一微液体芯片。微液体芯片可包括微观尺度特征(或"微 特征")。例如信道，阀门，泵，反应装置和/或贮存器以供流体贮存，在芯片上由和往不同 位置导流流体，和/或供流体试剂起反应。然而，现存的微液体系统，除经过预订的流向模式外都缺乏足够结构以供管理操 纵多种流体，因而限制了所述系统用于不同的化学或生物学分析的实用性。这因为现实世 界的分析经常需要到不同试剂的反复操纵以达至不同的分析目的。而且，许多现存的微液体装置都是限制于一种特定用途，和不可以在没有完全从 新设计的情况下容易地改做或制定成用于其它用途。这些装置缺乏可组合次性，所以不可 能分享共同装置组件，允许一个设计进行多种功能。这种缺乏弹性的设计导致生产成本增加，因为每次使用都需要生产不同的系统。此外，很多现存的微液体系统，都缺乏任何直截了当作出终点分析的方法，而这种 方法可容易检测到分析物的交互作用或在所述分析结果存在与否。例如，在分析后经常使 用到视觉检测样本颜色变异以评估所述分析结果如此，需要有一种可以分析生物学或化学样本的改良微液体系统以处理液体，特 别地是检测和分析从样本如DNA，RNA，氨基酸和蛋白中衍生的有生物活性的巨大分子。所述 系统最好是可以大量生产的，便宜的，和用完即弃的。所述系统最好是操作简单和实质上多 数或所有液体处理步骤都是全自动的。所述系统最好是可定制的和可以模块化的，从而使 所述系统可以简单和快捷的重新装配，以配合不同的应用，而当中是需要检测巨大分子的。 所述系统亦最好可提供直截了当和有意义的分析结果。在本发明申请文件第二部份内或任何其它分段所引用或确认的任何参考文献，不 应被认为是承认所述参考文献是本发明的现有技术。

发明内容
本发明提供一个微液体装置以分析一个目标样本，其包括a) 一个微液体装置体，其中所述微液体装置体包括i) 一个样本预备区域，ii) 一个核酸扩增区域，iii) 一个核酸分析区域，和iv) 一个由多个液体通道互相连接成的网络，而其中每一个所述样本预备区域，所述核酸扩增区域和所述核酸分析区域，是流 动地以最少一个在所述网络的所述多个液体通道互相连接至最少一个所述其它的两个区 域。本发明亦提供一个微液体装置以分析一个目标样本，其包括a) 一个微液体装置体，其中所述微液体装置体包括i) 一个样本预备区域，ii) 一个核酸扩增区域，和iii) 一个由多个液体通道互相连接成的网络，而其中每一个所述样本预备区域和所述核酸扩增区域，是流动地以所述液体通道 互相联系至其它区域。在一实施方案中，所述微液体装置可以包含一个差压源，其可以在所述微液体装 置体上的一个预先选择区域施加一个相对于周围压力的正压力或负压力。在另一实施方案中，所述微液体装置可以包含一个差压传送系统，可操作地连接 至所述差压源和所述微液体装置体。在另一实施方案中，所述微液体装置可以包含最少一块排列在个别或选定的液体 通道内或之间的隔膜，用以转换从所述差压源释出的一个压力成所述膜片的一个需要的开 或关位置。在另一实施方案中，所述样本预备区域包括一个样本进口贮存器；
一个样本预备剂贮存器；和样本纯化媒介；其中所述样本进口贮存器，所述样本预备剂贮存器和所述样本纯化媒介是流动地 互相连接的。在另一实施方案中，所述微液体装置可以包含一个样本纯化媒介贮存器，其中所 述样本纯化媒介是排列在所述样本纯化媒介贮存器内。在另一实施方案中，所述样本纯化媒介是排列在所述多个液体通道的其中一个 内。在另一实施方案中，所述样本纯化媒介是排列在所述样本纯化贮存器的底部内。在另一实施方案中，所述核酸扩增区域包括一个核酸扩增反应器；—个核酸扩增试剂贮存器；和一个核酸扩增结果贮存器；其中所述核酸扩增反应器，所述核酸扩增试剂贮存器，和所述核酸扩增结果贮存 器是流动地互相连接。在另一实施方案中，所述目标样本是一流体物料，一气体物料，一实质上溶于一液 体物料内的固体物料，一乳状物料，一浆状物料，或一有粒子悬浮在内的流体物料。在另一实施方案中，所述目标样本包括一生物学上的物料。在另一实施方案中，所述目标样本包括一在流体内的悬浮细胞。在另一实施方案中，所述微液体装置体包括多个的弱溶剂-粘合聚苯乙烯层。在另一实施方案中，所述样本预备区域包括一个样本混合隔膜流动地连接至所述 样本进口贮存器。在另一实施方案中，所述核酸萃取媒介是一无水硅酸膜。在另一实施方案中，所述微液体装置体包括一个供风干所述样本纯化媒介的一个 手段。在另一实施方案中，所述样本预备区域包括一个清洗贮存器。在另一实施方案中，所述样本预备区域包括一个废物贮存器。在另一实施方案中，所述样本预备区域包括一个洗脱作用贮存器。在另一实施方案中，所述样本预备试剂包括有磁性的珠子。在另一实施方案中，样本纯化试剂是放置在样本纯化贮存器内。在另一实施方案中，所述样本纯化试剂是有磁性的珠子。在另一实施方案中，所述样本预备试剂是一细胞溶解试剂(lysing agent)。在另一实施方案中，所述核酸扩增反应器是一热循环反应器。在另一实施方案中，所述热循环反应器的底部是一聚苯乙烯薄层。在另一实施方案中，所述热循环反应器的底部在热循环时以一个不在所述微液体 装置体之上或之内的加热器所加热。在另一实施方案中，所述核酸扩增选自以下群组包括聚合酶链反应(PCR)，逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)，cDNA末端快速扩增(RACE)，滚环扩增，核酸基础序列扩增 (NASBA)，转录介导的扩增(TMA)，和连接酶链反应。
在另一实施方案中，所述核酸分析区域包括一个检测所述目标核酸和一个所述目 标核酸的探针之间的相互作用的区域。本发明亦提供一种检测目标核酸的方法，其步骤包括获得一个怀疑包含所述目标 核酸的标本；提供一个微液体装置；导入所述样本至所述样本预备区域内；预备所述样本 以作核酸扩增；导入所述已预备好的样本至所述核酸扩增区域；在所述核酸扩增区域内进 行一核酸扩增反应以扩增所述目标核酸；导入所述已扩增的目标核酸至所述核酸分析区 域；和检测所述已扩增的目标核酸。在一实施例中，所述目标核酸是与一种目标疾病或失调有关的。在另一实施方案中，所述检测步骤包括检测所述已扩增的目标核酸和所述目标核 酸的探针之间的相互作用。在另一实施方案中，所述检测步骤包括观察颜色强度，荧光强度，电力讯号强度或 化学发光强度。在另一实施方案中，所述检测步骤包括产生一个与标本内最少一个目标份子对应 的强度数值。在另一实施方案中，所述强度数值选自以下群组包括颜色强度数值，荧光强度数 值和化学发光强度数值，电流或电压。在另一实施方案中，产生所述颜色强度数值包括分析一个与所述样本对应的影 像以产生多个的像素；为所述多个像素提供各自一个数字的数值；和为所述颜色强度数值 产生数字的数值。在另一实施方案中，所述方法进一步包括计算一阀值和与所述阀值比较所述颜色 强度数值以检测所述目标分子。在另一实施方案中，所述方法进一步包括在数据库内储存最少一个所述颜色强度 数值和所述阀值。在另一实施方案中，所述阀值是用最少一个负控制样本计算的。本发明亦提供一种在对像中判断其患有或倾向患有一种目标疾病或失调的方法。 所述方法包括从所述对像中获得一样本，其中所述样本是怀疑包含一种与所述目标疾病或 失调有关的核酸；和检测在所述样本中与所述目标疾病或失调有关的核酸，其中所述检测 步骤包括从一样本中获得怀疑包含所述目标核酸；提供一个微液体装置；将所述样本导入 所述样本预备区域；预备所述样本以作核酸扩增；将所述已预备的样本导入所述核酸扩增 区域；在所述核酸扩增区域内进行一核酸扩增反应以扩增所述目标核酸；将所述已扩增的 目标核酸导入所述核酸分析区域；和检测所述已扩增的目标核酸，其中检测所述已扩增的 目标核酸是与患有或倾向患有一种目标疾病或失调有关的。在一实施方案中，所述检测步骤包括判断所述已扩增的目标核酸的数量(或水 平)，而其中所述方法进一步包括将所述数量(或水平)与一所述目标核酸预先选定的数量 (或水平)作比较。在另一实施方案中，所述预先选定的数量(或水平)与所述数量(或水平)的差 别，是对判断是否患有或倾向患有一种目标疾病或失调有指标性的。


本发明在此参照附图阐述，贯穿若干附图，其中相似的参考字符代表相似的要素。 在一些例子当中，应当理解的是所述发明的不同外观可能会被放大或夸大以使所述发明易 于明白。图1是所述微液体装置(“芯片")实施例的立体图，其中所述芯片有三个功能性 区域，一个样本预备区域101，一个核酸扩增区域102和一个核酸分析区域103用以作出一 终点检测分析。试剂贮存器111。分析区域的贮存器113。废物贮存器114。图2是图1所示的所述微液体装置的等大分解图，显示出所述微液体装置的三层 (为清晰起见，所述连续膜并没有显示)。图3A是图1所示的所述微液体装置的实施例的俯视图，显示出所述样本预备区域 (“核酸(NA)萃取区域")，所述核酸扩增区域(在此实施例中，使一个"PCR区域")和 所述核酸分析区域(“RDB区域")。所述装置上的阀门，微液体通道，通孔，和一低密度 DNA过滤器的编排亦一并显示。在此实施例中，一个逆向点杂交法(RDB)终点检测分析可以 在所述核酸分析区域中进行。废物废物贮存器。图3B是图1所示的所述微液体装置的实施例的俯视图，显示出所述样本预备区域 101，所述核酸扩增区域102(包含一个核酸扩增反应器112)和所述核酸分析区域103，和所 述装置上阀门，微液体通道和通孔的编排。分析区域的贮存器113。图4是图1所示的所述微液体装置的实施例的俯视图，显示出所述装置的功能性 编排，包括在所述装置个别层上的贮存器，核酸扩增反应器(或间隔)，阀门，微液体通道和 通孑L。图5是图1所示的所述微液体装置的实施例的俯视图，显示出在所述装置上的阀 门的计划图。图6是图1所示的所述微液体装置的实施例的俯视图，显示出在所述装置上的贮 存器的计划图。图7是图1所示的所述微液体装置的实施例的俯视图，显示出在所述装置上的功 能性区域的计划图，和指示出在贮存器内所述试剂的位置。样本预备区域101。核酸扩增区 域102 (包含一个核酸扩增反应器112)。核酸分析区域103。和所述装置上阀门，微液体通 道和通孔的编排。分析区域的贮存器113。图8显示备有两个功能性区域的所述微液体装置的另一个实施例，其中包括所述 样本预备区域和所述核酸扩增区域。如箭嘴所指，所述样本预备区域包括贮存器以供样本 的导入和预备，样本纯化和核酸萃取。所述核酸扩增区域包括一个核酸扩增反应器(“扩增 间隔")。所述装置的这个实施例亦包括一个核酸扩增结果萃取区域("扩增结果萃取区 域")，它是一个当核酸扩增完成后，扩增子从所述微液体装置中萃取出来的区域。在这实 施例所显示的所述装置的尺寸是50mmX38mm。图9是如图8所示的所述微液体装置的实施例的分解图，显示出所述微液体装置 的三层(为清晰起见，所述连续膜并没有显示)。图10是图8所示的所述微液体装置俯视图的图解，显示出在所述装置个别层上 泵，阀门，扩增反应器，微液体通道和通孔的计划图。图11是图8所示的所述微液体装置俯视图的图解，显示出所述装置的功能性区域的计划图，并指出所述试剂在多个试剂贮存器内的位置(例如Cells，Ethanol, Mixer, Waste, Elution, NAl，NA2, Affl, AW2)。图12-16，本发明所述微液体装置(“芯片")的另一个实施例备有两个功能性区 域，一个样本预备区域和一个核酸扩增区域，但没有一个在芯片上的核酸分析区域。图12，俯视图显示出所述阀门和通道的编排，但没有显示所述贮存器。图13显示如图12所示的微液体装置的实施例的编排，描绘出三组双向泵作为样 本预备，核酸扩增试剂预备和装填之用。图14-16是图12所示的所述微液体装置的实施例的操作图解。箭嘴指示大肠杆 菌样本经处理后在所述装置上的进程。图17显示所述装置的一个间隔的底部的实施例，其中一块隔膜安排在一个所述 间隔的开口(管嘴)之上，可以用于产生一个混合喷射口以混合所述间隔内的对象。图18显示从所述发明中一个实施例的微液体装置和一个实验控制 (QiagenRNEasy Kit)所得出的比较结果。使用Qiagen RNEasy萃取/纯化方法从HEK293T 细胞分离出琼脂糖凝胶的RNA(第1-3，10行)和所述微液体装置(第4-9行)。分子 量标记在左方显示。图19显示第1行，DNA标准；第2行，在芯片上进行RT-PCR后的扩增子结果。第 3行，输入RNA (1 μ 1)。RNA是从ΗΕΚ293Τ细胞产生。使用可确认beta-肌动蛋白的引物以 产生所述cDNA结果并且通过PCR扩增肌动蛋白cDNA。图20显示八个以不同的热循环和运行时间的PCR运行的芯片可重复性。图 21 显示 PCR 对照比较。使用 BioRad MJ Mini Thermocycler (第 2 禾Π 3 行)或 所述微液体装置(第4行)通过30个PCR循环的所扩增的5X IO3质粒(prlpGL3)拷贝。 分子量标记在第1行显示。图22显示一个由在本实验中使用所述PCR热循环器联同所述微液体装置所得的 典型循环。下面的图表是在上面的图表内首四个循环的展开图。图23显示在所述微液体装置上运作的一个RT-PCR实验计划的结果。使用台顶式 (bt)和芯片实验计划所分离出的HIV RNA。图24显示在全血中检测β-地中海贫血基因。经过30个PCR循环之后，两个由 所述台顶式热循环器(第4-5行)或所述微液体装置(第2-3行)并行地PCR扩增的相同 样本在琼脂糖凝胶上分析。第1行代表分子量标准。图25显示使用台顶式PCR方法或所述微液体装置任何一个方法所得的HPV扩增结果。图26显示以逆向点杂交法(RDB)给HPV作血清型检测的芯片上探针排列。 HPV-52 (上面)和HVP-IK下面)皆正确地检测到。图27显示RDB实验计划的示意图。图28显示两块处理负载有1000个大肠杆菌的苹果汁的芯片之间的一个比较。先 预备已负载的苹果汁，然后抽取两个在芯片上纯化的DNA的1μ 1等份部份，并在台顶式仪 器扩增，而剩下的已纯化的DNA在芯片上扩增。将结果移除并如显示般在凝胶上分析。每 个芯片的结果的第1和第2行代表所述在台顶式仪器扩增的等份部份，而每个个案的第3 行代表所述芯片上扩增的结果。
图29显示将芯片上萃取的DNA使用台顶式和芯片上PCR的结果比较。大肠杆菌 负载范围由-5XIO3/μ 1-1XIO4/μ Io图30显示Α.负载500，000个大肠杆菌导入苹果酒后，比较〃台顶式〃 PCR分析 (第3行)和所述微液体装置分析(第4行)的分析。第1和第2行分别代表所述负和正 控制。B.分析负载100，000个大肠杆菌个大肠杆菌导入苹果酒后，比较"台顶式"PCR分 析(第3行)和所述微液体装置分析(第4行)的分析。第1和2行分别代表所述负和正 控制。图31显示分析负载500，000个大肠杆菌导入苹果酒后，比较"台顶式"PCR分析 (第2-3行)和所述微液体装置分析(第4-5行)的分析。第1行代表所述负控制。图32显示分析引入500，000个大肠杆菌导入磷酸盐缓冲盐水后，比较〃台顶 式"PCR分析(第2-3行)和所述微液体装置分析(第4-5行)的分析。第1行代表所述 负控制。图33显示分析引入10，000个大肠杆菌导入苹果汁后，比较〃台顶式〃 PCR分析 (第2-3行)和所述微液体装置分析(第4-5行)的分析。第1行代表所述负控制。图34显示分析引入1，000个大肠杆菌导入苹果汁后，比较"台顶式"PCR分析 (第2-3行)和所述微液体装置分析(第4-5行)的分析。第1行代表所述负控制。图35显示比较从两个部同的微液体装置运行后所得的扩增子。所述从每个微液 体装置的完全运行后所获得的结果(第3行，从每个微液体装置所产生的结果作出的凝胶 分析)与分别从所述相同的微液体装置中获得和扩增的台顶式PCR扩增DNA的结果(第1 和2行)并无区别。图36显示分析引入1，000，000个大肠杆菌导入脱脂奶后，比较〃台顶式〃 PCR分 析(第2-3行)和所述微液体装置分析(第4-5行)的分析。第1行代表所述负控制。图37显示从大肠杆菌中以台顶式和芯片上的Whatman FTA洗脱作纯化的DNA结 果。所有测试使用1百万(即Ι,οοοκ)大肠杆菌负载进行。图38显示可以与一个在微液体装置内所述核酸扩增区域内的一个封闭的核酸扩 增反应器，如PCR反应器，共同使用的压力减轻装置的示意图。图39显示一个可以粘合在一个核酸扩增反应器，如一个PCR反应器，的上面，以防 止所述反应器因为温度升高的热效应而弯曲的结构示意图。图40-41显示在一个小区域内的RDB流程设计，以供斑点排列之用。图40是RDB流程设计的侧视图。图41Α-Β是一个芯片上的RDB贮存器㈧和RDB贮存器凹槽间隔装置⑶的实施 例的透视图。
具体实施例方式本发明提供了一个微液体装置(“芯片")及其方法，基于所述装置和方法上可 以结合样本预备，扩增有生物活性的分子和可以提供一合适的生物学上的样本，在原先预 备的样本中可以分析和/或检测目标分子。与大规模设备比较，本发明提供的所述小规模 仪器和方法在预备和分析生物学上的样本是容易的，快捷的，较便宜的，和同样地有效的。所述微液体装置提供结构上和功能上的能力去自动处理一个包含核酸的原始样本，并使用衍生自所述样本的核酸模板对其进行核苷酸(如DNA或RNA)扩增，所述装置有 控制试剂，结果或样本在处理时免受污染，和低试剂消耗的优点。在所述装置上进行的分析是全自动的。本发明提供的所述微液体装置系统，在除 了要导入样本或标本外，可以在几乎不需要实际动手的情况下产生所述需要的结果，从而 提供一个在分析部份大量省时省力的方法。而且，不熟练的人士亦只需要简单地在所述微 液体装置上放置所述原始样本或标本，即可进行精密的分子诊断。所述微液体装置适合分析从任何生物来源获得的目标样本，例如病毒，细菌，真 菌，原核细胞，真核细胞，太古细胞等。这些可以用作生物学上的目标巨大分子的潜在来源， 包括但不限于多核苷酸(例如，DNA, RNA)蛋白，酶，或生物物料如全血，血清或血浆，尿，粪 便，黏液，唾液，阴道或标本收集棉棒，细胞培养，细胞悬液等。所述微液体装置，可以用于各 种各样的检测，诊断，监察和分析，牵涉到生物学的或从生物上衍生的物资或物料的检测， 例如医学和兽医的诊断，食品处理，工业处理，和环境监察。所述装置可以用作一诊断装置 以检测从一个体上得到的生物样本有否感染，疾病或失调。许多疾病或失调适合检测，包括 但不限于β-地中海贫血，UTIs (尿道炎)，STIs (性传播感染)如淋病双球菌，衣原体，梅 毒的成因梅毒螺旋体，和细菌有关细菌性阴道炎，HPVs如疱疹二型病毒，乳突淋瘤病毒，乙 型肝炎病毒和细胞巨化病毒，H1V，念珠菌如白假丝酵母，和原生动物如阴道滴虫。在一实施例中，所述用以分析目标样本的微液体装置可以包含一个微液体装置 体，其中所述微液体装置体包括i) 一个样本预备区域，ii) 一个核酸扩增区域，iii) 一个核酸分析区域，和iv) 一由多个液体通道互相连接而成的网络，而其中每一个所述样本预备区域，所述核酸扩增区域和所述核酸分析区域是流动 地以最少一个在所述网络的所述多个液体通道互相连接至最少一个所述其它的两个区域。 (图 1-11)。在另一实施例中，所述用以分析目标样本的微液体装置可以包含一个微液体装置 体，其中所述微液体装置体包括i) 一个样本预备区域，ii) 一个核酸扩增区域，和iii) 一由多个液体通道互相连接而成的网络，而其中每一个所述样本预备区域和所述核酸扩增区域是流动地以最少一个在所 述网络的所述多个液体通道互相连接至最少一个所述其它区域(图1-7)。在另一实施例中，所述微液体装置可以有两个功能性区域，一个样本预备区域和 一个核酸扩增区域，但可以缺少一个芯片上的核酸分析区域(图8-16)。为清晰而不是以限制来公开，发明详述会被分成以下的小部份。5.1微液体装置体所述分析装置包括一个微液体装置体。美国专利公开号US2006/0076068A1 (Young et al，4/13/2006)，US2007/0166200A1 (Zhou et al ·，7/19/2008)，禾口 US2007/0166199Al(Zhou et al. ,7/19/2008)有描写一个适用的微液体装置体，在此引入全部作参考。所述装置体可以包含一个备有上部和下部表面的第一坚固塑料底物，和一个与所 述第一底物的上部表面接触和联系的实质上坚固的塑料膜，其中所述塑料膜在放松状态实 质上靠着所述第一底物的上部表面平放，而所述塑料膜在一激活状态下是由所述第一底物 的上部表面移开。所述第一坚固塑料底物可以有微特征形成在其中，而所述塑料膜可以在 所述微特征上放置。所述膜有一个选择成可以在施加适当的机械性力量时会变形的厚度。 在不同的实施例中，所述膜可以有大约IOym至大约150 μ m和大约15 μ m和大约75 μ m之 间的厚度。所述机械性力量是以一正压力形式施加，以使所述膜向所述底物变形和可以少于 50psi。在一实施方案中，所述力量强度在3psi和大约25psi之间。所述机械性力量是以一负压力形式施加，以使所述膜远离所述底物变形和可以有 少于大约14psi。在一实施方案中，所述力量强度在3psi和大约14psi之间。所述膜和所述第一底物可以由实质上相同或不同的物料制造。适合制造所述装置 体的物料的例子包括有热塑性塑料物料或线性聚合物料。在一具体实施例中，所述物料是 聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，或丙烯酸树脂。所述实质上坚固塑料膜可以有一个未粘着区域，其没有固定在所述第一底物。所 述膜的未粘着区域可以最少部分平放在一个第一通道和从所述第一通道脱节出来的一个 第二通道，两个通道都是排列在所述第一底物内，而当在放松的状态下形成一个在所述第 一和第二通道之间的密封。所述膜的未粘着区域亦可以最少部分平放在一个在所述第一底物内，实质上在所 述第一和第二信道之间，并和两个信道分离的阀门座。所述阀门座可以包含一个实质上与所述第一和第二通道的纵轴成垂直的脊状突起。所述膜的未粘着区域可以最少部分平放在一个第一通道和一个从所述第一通道 脱节出来的第二信道，两个信道都是排列在所述第一底物内，而当在激活状态下可从所述 第一底物的上部表面中分离出来，以提供一个在所述第一和第二通道之间适合液体流动的 中空部分。所述第一底物亦可以包括一个由所述第一底物的上部表面伸延至所述第一底物 的下部表面的通孔。所述膜的未粘着区域实质上可以是圆形，椭圆形或有圆角的矩形。所述装置体可以进一步包含一个与所述膜的一个上部表面接触和连接的一个第 二坚固塑料底物。所述第一底物，所述第二底物，和所述膜可以用实质上相同的物料制造。所述第二底物可以包括一个实质上位置于所述膜的未粘着区域之上有一定尺寸 的一个间隔，从而使所述膜的未粘着区域可以从所述第一底物的上部表面移离，并保持被 所述间隔实质上的封闭。所述装置体可以进一步包含备有多个不相连的未粘着区域的泵，而每一个区域可 形成一个可独立地激活的阀门结构并且以微通道串联起来。所述微通道对液体流动有不同 的抵抗性。所述装置体可以进一步包含一个在所述膜上有一定尺寸，形状，和位置成当所述膜是在一个已激活的状态下可结构性的支撑所述膜的支撑结构。一个阻塞物可以放置在所述膜之上，所述阻塞物是有一定尺寸，形状，和位置成防 止所述膜从所述第一底物移动至超过一个预期的距离。所述装置体可以有多个备有共享阀门结构的泵。所述共享阀门结构可以包括一个 放置在三个或更多的微通道上的膜，以提供多个液体端口配对所述共享阀门。所述装置体包括最少一个可以贮存一种或多种液体物料，气体物料，实质上溶于 一流体物料的固体物料，浆状物料，乳胶物料，和有悬浮粒子的流体物料的贮存器。在具体 的实施例中，所述目标样本包括一个生物学物料，例如，一个有悬浮细胞的液体。所述贮存器可以实质上排列成垂直的。它可以配对液体抽取工具，以从所述贮存 器中的确定垂直水平面或确定垂直水平面附近抽取液体。所述贮存器可以包含一流体物料 和粒子，而所述泵可以与所述贮存器配对，以使液体循环通过所述装置而防止所述粒子在 所述贮存器的顶部或底部沈淀。所述贮存器可以与所述第一个和第二个可独立激活的阀门 结构的其中一个配对。在另一实施例中，所述装置体可以包含多个通过泵机制互相联系的贮存器。所述 泵机制可以包括一个共享阀门结构使液体通过所述多个贮存器。所述装置体亦可以包含最少一个微特征。所述微特征可以包含一个备有几何学上 对单方向流动有帮助的通道。所述装置体可以包含一个泵，所述泵备有未粘着区域而形成一个可在外部激活的 膜片结构，以微通道互相联系至两个未粘着区域，形成可以液体通过所述泵而被激活的被 动阀门结构。在另一实施例中，所述泵可以有多个不相连的未粘着区域，每一个区域形成一 个可独立激活的隔膜结构，而每个隔膜结构是与最少其中一个隔膜结构部分相互重迭的。在一实施例中，所述装置体可以包含最少一个放置在个别或预先选定的液体通道 之间，以转换一来自所述差压源的压力至所需开或关的位置的隔膜。在一具体实施例中，所述装置体可以包含一个备有上部和下部表面和微特征在内 形成的第一聚苯乙烯底物，和一个聚苯乙烯膜以溶剂粘合至所述第一底物的上部表面。所 述装置体可以有一个放松状态，其中所述聚苯乙烯膜实质上靠在所述第一底物的上部表 面，和一个激活状态，其中所述聚苯乙烯膜是从所述第一底物的上部表面移开。所述弱溶剂粘合可以由在室温和环境力量的情况下有少许或实质上没有粘合效 力，但在适当温度或力量的情况下可以在两个相配表面之间形成一个粘合接口的溶剂所形 成。在一具体实施例中，所述装置体可以包含一个在多个弱溶剂粘合聚苯乙烯层内制 造好的功能性流体网络。例如，美国专利申请号2006/0076470A1公开了一个可以经过弱溶 剂层压处理所制造的三层聚苯乙烯体(“芯片")，在此引入作参考。在一具体实施例中， 所述芯片可以是一个层压结构，包含一个拥有第一和第二表面的第一组件，其中最少一个 所述表面包含有一微结构，进一步其中所述第一组件是一聚合物料；和一个拥有第一和第 二表面的第二聚合组件，其中所述第二组件的第一和第二表面的其中一面，是固定地分别 以粘合剂固定在所述第一组件的第二和第一表面的其中一面，其中所述粘合剂是一相对于 所述聚合组件的弱溶剂，如在美国专利申请号2006/0078470A1中公开的。在一实施例中，所述装置体包括三个用以进行目标分析的区域(例如，一核酸检测分析)一个样本预备区域，一个核酸扩增区域和一个核酸分析区域。所有三个区域都 可以使用技术领域熟知的方法，与之流动地连接至泵和阀门(见，例如，美国专利申请号 2006/0076068A1，在此引入作参考)和连接至贮存器和通道(见，例如，美国专利申请号 2007/0166200A1，在此引入作参考)。所述贮存器和通道可以在所述芯片内，以例如弱溶剂 粘合处理建造(美国专利申请号2006/0078470A1)。在另一实施例中，所述装置体可以有一个实质上坚固的隔膜在所述隔膜靠着一 底物的表面的放松状态和所述隔膜在移离所述底物的激活状态之间，如美国专利申请号 2006/0076068A1所公开，在此引入作参考。所述由这个隔膜形成的微液体结构可以提供容 易制造和坚固耐用系统，以及容易制造的组件如阀门和泵。在一个个别实施例中，所述装置体是一聚合微液体结构，其中一个实质上坚固的 塑料膜以弱溶剂充当粘合剂固定地粘合或层压至一本质上平坦的坚固塑料底物。在一具体 方面，所述底物包括微特征，而所述装置体包括在所述可变形的膜和所述本质上平坦的底 物表面之间，以粘合区域围绕和定义的无粘合分段，形成阀门结构。在一些实施例中，一个 第二底物是粘合至所述膜的上部表面，并包括一个可以向所述膜的未粘着区域施加气动压 力的间隔。根据与本发明一致的使用方法，气动压力或力量是用于将所述膜变形，如此激活 所述阀门。在一些实施例中，一个泵包括多个以微通道互相联系的阀门结构。阀门，泵，反 应器和微液体贮存器可以以微通道互相联系而形成循环器，混合器，或其它拥有与微液体 处理和分析功能的结构。在另一实施例中，所述装置体可以有一个备有上部和下部表面的第一坚固塑料底 物，和一个与所述第一底物的上部表面接触和连接，在放松状态时其中所述塑料膜实质上 靠着所述第一底物的上部表面，而在激活状态时其中所述膜是由所述第一底物的上部表面 移离的实质上坚固的塑料膜。所述第一坚固塑料底物可备有在所述底物上形成的微特征， 和所述实质上坚固的塑料膜是经常放置于最少一个所述微特征之上。所述实质上坚固的塑 料膜可以有大约2GPa和大约4GPa之间的杨氏模量，和有一个预先选择的厚度或阔度以容 许施加适当力量时会变形。所述膜可以有大约IOym和大约150μπι之间的厚度，更具体地 是在大约15 μ m和大约75 μ m之间。令所述膜作出反应的机械性压力可以是施加于所述膜以令其向所述底物变形的 正压力，而所述压力可以少于大约50psi，和可以在3psi和大约25psi之间。可选择地，和 随意的，所述机械性压力可以是施加于所述膜以令其移离所述底物的负压力，而所述压力 有一少于大约14psi的强度，和可以在大约3psi和大约14psi之间的强度。所述膜和所述第一底物可以由实质上相同物料所制造。其中一块所述膜和所述 第一底物可以是一热塑性塑料物料，或线性聚合物料，和可以由聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙 烯，聚碳酸酯和丙烯酸树脂其中一种物料制造。所述实质上坚固塑料膜可以有一个与所述第一底物未连接的未粘着区域。所述膜 的所述未粘着区域最少可以部分的平放在从所述第一通道解体出来的一个第一通道和一 个第二通道上，两个通道都是排列所述第一底物内。在所述放松状态下，所述膜可以在所述 第一和第二通道之间形成一个密封。可选择地，所述膜的所述未粘着区域最少可以部分的 平放在所述第一底物内形成的一个阀门-座上，实质上是在所述第一和第二通道之间并与 之不相连。所述阀门座可以是包括一个实质上与所述第一和第二通道的纵轴成垂直的脊状突起。进一步，所述膜的所述未粘着区域最少可以部分的平放在从所述第一通道中解体出 来的一个第一通道和一个第二通道。这些通道可以排列在所述第一底物内，而在所述激活 状态下，所述膜从所述第一底物的上部表面分离出来，以提供一个在所述第一和第二通道 之间适合作为液体流动的中空部分。可选择地，这里亦可以有一个通孔由所述第一底物的 上部表面伸延至所述第一底物的下部表面。所述未粘着区域可以是任何适合的形状的，而 所选择的形状当然根据当时的应用而定。在某些实施例中，所述未粘着区域可以是圆形，实 质上椭圆形，实质上有圆角的矩形，或任何适合于当前应用的形状。在某些实施例中，所述装置体可以包括一个与所述膜的上部表面接触连接的第二 坚固塑料底物，而可选择地所述第一底物，所述第二底物，和所述膜是以实质上相同物料如 聚苯乙烯所制造的。所述第二底物可包括一个间隔实质上被平放在所述膜上未粘着区域的 上面，并且有一定大小，因此所述膜的未粘着区域可以从所述第一底物的上部表面中移除， 而实质上被所述间隔封闭。所述微液体装置体可以同时地包含一个包括一对或一组不相连的未粘着区域的 泵，每一个形成一可独立激活的阀门结构，而所述结构通常以微通道或一些流体通道串联 一起。所述微通道可能有不同的液体流动抗阻，亦可能有不同尺寸，形状和限制。进一步可 选择地，所述装置可以包括特征如一个令到液体流向一个别方向的形状的通道。在一实施例中，多个泵可以有一共享的阀门结构，而特别地，所述泵可以有一个共 享的阀门结构其包括一个在三个或以上微通道上放置的膜，以提供多个与所述共同阀门配 对的流体端口。如此，在一些实施例中，所述泵可以包含任何三个同轴的阀门结构。本发明 可提供一个可以贮存流体物料的贮存器，所述流体可以是一液体，一气体，实质上溶于一流 体物料中的固体，一浆状物料，一感光乳胶物料，或一包含悬浮粒子的流体物料。所述贮存 器可以实质上排列成垂直的，也可以与液体抽取工具配对以从所述贮存器中的确定垂直水 平面或确定垂直水平面附近抽取液体。所述贮存器可以包含一流体物料和粒子。所述贮存 器可以安排为实质上垂直和包含一流体物料和粒子。所述泵可以与所述贮存器配对，以使 液体循环通过所述装置而防止所述粒子在所述贮存器的顶部或底部沈淀。所述贮存器可以 与所述第一个和第二个可独立激活的阀门结构的其中一个配对。所述泵可以包括或连接一 个共享阀门结构使液体通过所述多个贮存器。在进一步实施例中，所述装置可以有一个备有一个可外部激活隔膜结构的不相连 的未粘着区域，以微通道互相联系两个未粘着区域，以形成可因流体流动通过所述泵而激 活的被动阀门结构。在另一个实施例中，所述泵可以有多个不相连的未粘着区域，每一个形 成一个可独立激活的隔膜结构，而每一个隔膜结构有部分与最少一个其它隔膜结构互相重 迭。所述装置可以包括一停止机制，例如一机械性阻塞物放置在所述膜之上，有一定 尺寸，和安置成防止所述膜从所述第一底物移动至超过一个距离。在另一方面，所述装置体可以有一个备有上部和下部表面和有微特征在内形成的 第一聚苯乙烯底物，和一个以溶剂粘合至所述第一底物的上部表面的聚苯乙烯膜，所述聚 苯乙烯膜在放松状态时实质上靠着所述第一底物的上部表面，而所述聚苯乙烯膜在激活状 态时从所述第一底物上部表面移离。所述微液体装置亦可以包含或配对至一差压传送源，例如一个或多个提供压力或真空的机械性气泵。在一实施例中，所述差压源是可以施加与周围压力相对的一正压力或一负压力至 一所述微液体装置体上预先选择的区域。所述微液体装置亦可以包含或配对至一差压传送系统，例如一个可以顺序地激活 所述阀门以操作在所述底物上形成的所述阀门和泵的控制器(见Zhou等，美国专利公开号 2007/0166199A1)。所述差压传送系统可以包含一个差压源(例如一个或多个的气泵)。所 述差压传送系统可操作地连接至所述差压源和所述微液体装置体。所述差压传送系统允许在所述装置内混合物料。例如，一个控制器可以操作一个 贮存器泵间隔和两个其它泵间隔，凭此一物料可以吸引进所述贮存器泵间隔，然后部分分 别吸引进所述两个泵间隔，而所述被部分吸引进的物料在所述两个泵间隔的其中一个内可 以顺序地退回至所述贮存器泵间隔。所述微液体装置亦可以包含一个计算器和/或计算器软件以控制所述控制器。5. 2样本预备区域和样本预备方法所述微液体装置可以包含一个样本预备区域。在一实施例中，所述样本预备区域 可以包含一个样本进口贮存器；一个样本预备试剂的贮存器；和样本纯化媒介；其中所述样本进口贮存器，所述样本预备试剂的贮存器，和所述样本纯化媒介是 流动地互相连接(图1-7)。所述样本预备区域可以包含，例如一个或多个洗脱作用或废物贮存器(图7)。所 述样本预备区域亦可以包含一个或多个贮存器以供细胞溶解和/或细胞溶解援冲剂，样本 清洗和/或清洗援冲剂，样本纯化和/或纯化媒介等之用途。(图7).所述样本纯化媒介可以放置在样本纯化媒介贮存器内。在一特别的实施例中，所 述样本纯化媒介是放置在所述样本纯化贮存器的底部。可选择地，所述样本纯化媒介可以放置在所述多个流体通道其中一个中。所述样本预备区域可以包含一个样本进口以将所述目标样本引入到所述样本进 口贮存器，其中所述样本进口是流动地连接至所述样本进口区域。所述样本预备区域亦可以包含一个样本混合隔膜，并流动地连接至所述样本进口 贮存器。所述样本预备区域可以额外地包含一个样本混合贮存器，流动地互相连接至最少 一个在所述装置体上的其它贮存器。在一实施例中，所述样本预备区域可以包含一个加热源以热激一个生物学上的样 本，例如一个细胞或生物样本。活标本可以暴露于一热激以产生例如一个别已知种类的 RNA。当稍后在所述微液体装置内对从所述标本内分离出的RNA作核酸扩增，就可以以分析 究竟所述个别已知种类的RNA是否从所述热激所产生而判定究竟其它所述原始标本当标 本引入所述微液体装置时是否活的。在一实施例中，在样本中的生物学上的物料，如细胞或组织，是溶解于所述样本预 备工序中。在另一实施例中，生物学上的物料是受萃取的。任何在技术领域中熟知的生物学上的萃取计划方案都可以使用本发明所述的微液体装置，包括但不限于化学的，机械性， 电的，音波的，热的等。任何在技术领域中熟知的核酸萃取和纯化媒介可以使用于分离一个目标核酸。在 一实施例中，一个无水硅酸膜可以放置在一个流体路径以分离核酸。所述可渗透的无水硅 酸膜可以由非常幼细，直径少于Iym的玻璃细丝所制造。使用这些媒介的核酸恢复产量是 与在所述流体路经中的玻璃细丝的定位有紧密关系。为避免任何缩短的流体路经的存在和 确保有足够所述核酸萃取和纯化的媒介，所述膜的大小可以制造成实质上大于所述流体通 道的横截面面积。在另一实施例中，可以使用Boom等人在美国专利号5，234，809所公开的固相萃取 方法。Boom等人公开了一个从一包含核酸的起始物料，其包含混合所述起始物料，一离液序 列高的物质和一核酸结合固相，从液体分隔所述固相和粘合在上的核酸，和清洗所述固相 核酸综合体的分离核酸的方法。任何在技术领域中所熟知的清洗核酸的有机溶剂，都可以使用于清洗所述吸收在 核酸纯化媒介上的核酸。核酸预备试剂可以是溶解试剂或蛋白水解酶试剂。细胞或目标样本组织的溶解可 以在一个或更多试剂贮存器通道或所述微液体装置的反应器内进行。在一实施例中，芯片 上混和一细胞溶解溶液(贮存于一试剂贮存器)和其各自有粘性的或非粘性的反应试剂 (贮存于不同的贮存器)，可以由一贮存器不断传送所述流体至另一个贮存器来实现。细胞溶解可以用技术领域所熟知的方法完成，如流体操控，例如温和地以机械性 搅伴或"抖松"，循环，化学溶解或一组合的细胞溶解方法。磁性珠子亦可以用于溶解中(见例如，Lee JG,Cheong KH, Huh N，Kim S，Choi Jff, Ko C :Microchip-based one step DNA extraction and real-time PCR in onechamber for rapid pathogen identifcation. Lab Chip 2006,6 (7)。磁性珠子可以，据技术领域熟知的标准方法，使用于增强根纯化计划方案或核酸 萃取计划方案。例如，它们可以在溶解前作一样本预备试剂般使用，例如作为初步浓缩或选 择一个别生物学上的物料，细胞，组织，或生物或前述的亚成份。在没有使用用作进行这些目的的典型实验室设备下，细胞溶解/均化可以在所述 微液体装置上实现。例如，所述细胞溶解溶液可以用不断激活一芯片上的泵，以透过一放置在所述试 剂贮存器底部的可渗透性圆盘来牵引所述贮存在一试剂贮存器中的粘性溶液的方法来均 化。在一实施方案中，细胞溶解可以在所述微液体装置上的一狭窄通道内(例如 0. 9mm)来回牵引一个包含一细胞样本的溶液的方法来完成。这样地，组织培养细胞可以使 用机械性溶解来均化。细胞溶解亦可以剪切细胞来完成。其它技术领域熟知达成细胞溶解的方法包括离液序列变性(参考Boom等人，美 国专利号5，234，809)，声波降解法，应用直流电压穿过一贮存器或通道(Wang HY, Bhunia AK,Lu C:A microfluidic flow—through device for high throughput electricallysis of bacterial cells based on continuous DC voltage. Biosens Bioelectron2006,22(5) :582-588)，基于微电动机械的压电微液体微声波降解法(Marentis TC, Kusler B， Yaralioglu GG, Liu S, Haeggstrom E0, Khuri-Yakub BT :Microfluidicsonicator for real-time disruption of eukaryotic cells and bacterial spores for DNAanalysis. Ultrasound Med Biol 2005，31 (9) : 1265-1277)渗透压溶解，以局部产生氢氧化物溶解， 以纳米规模倒钩作机械性分解(Di Carlo D, Jeong KH, Lee LP =Reagentlessmechanical cell lysis by nanoscale barbs in microchannels for sample preparation, LabChip 2003，3 (4) :287-291)，冻融裂解法，热变性，使用溶解酵素然后使用GuSCN, LIMBS (laser irradiated magnetic bead system ；Lee JG, Cheong KH, Huh N, Kim S, Choi Jff, Ko C Microchio-based one step DNA extraction and real-time PCR in onechamber for rapid pathogen identification. Lab Chip 20066(7) :886_895)，和同时应用激光与机械 性震动。在一实施例中，溶解可以在不断激活一位于一个贮存器之下芯片上的隔膜泵与所 述样本和所述溶解试剂的情况下进行，从而当所述隔膜在激活后使所述流体引入所述隔 膜，并当所述隔膜是逆转地激活后重新注入所述贮存器。许多生物样本的预备工序涉及到溶解所述样本。技术领域使用的溶解溶液通常是 粘性的溶液，虽然它们亦可以是非粘性的。当预备样本时，一个经处理后的(已溶解的)生 物样本通常地会流过一个膜，而所述溶解样本的核酸会结合在膜之上。然后，若干的清洗援 冲剂，通常是比所述溶解生物样本的粘度更低，会通过所述相同的膜。所述样本预备区域可以额外地包含一个清洗贮存器流动地与最少一个在所述装 置体上其它的所述贮存器互相连接。所述样本预备区域可以额外地包含一个废物贮存器流动地与所最少一个在所述 装置体上其它的贮存器互相连接。所述样本预备区域可以额外地包含一个洗脱作用贮存器流动地与最少一个所述 装置体上其它的贮存器互相连接。核酸可以使用技术领域熟知的方法如膜亲和透析从所述样本中萃取或纯化。在一 实施例中，可以使用一无水硅酸膜。所述样本的一个溶解产物可以通过所述膜(例如，使用 一处于所述膜下游的隔膜泵)推进，吸入或引入。流体优选地在一正常方向流动(垂直的) 通过所述无水硅酸膜。在一实施例中，洗脱援冲剂可以通过所述无水硅酸膜引入以萃取所 述核酸。在另一例方案中，技术领域熟知的核酸萃取方法可以使用如Boom等人在美国专利 号5，234，809所公开的。溶剂(例如乙醇)通常一定需要在所述核酸从所述无水硅酸膜或其它种类的核酸 纯化媒介中洗脱后从所述膜中移除。所述微液体装置体可以包含用以风干所述样本纯化媒 介的方法。在一实施例中，所述样本预备区域包括风干所述样本纯化媒介的方法。例如，所 述装置体可以配置一固定在所述控制器的一个气泵的端口。本发明提供一个在所述端口和 所述贮存器或所述当中放置有无水硅酸膜的流体网络的间隔之间的分离阀门。当所述样本 和试剂在所述流体网络中被操纵成流过或通过所述无水硅酸膜时，芯片上的所述分离阀门 可以关闭，以确保没有任何所述流体渗漏进所述气泵。当所述膜适当地准备好后，所述分离阀门可以被开启而所述真空泵可以被激活。 这使一气流通过所述膜，有效地风干所述膜。可选择地，所述膜可以以加热或加热气流来干燥O在另一实施例中，所述膜的干燥方法可以被调整成使用芯片上泵，简单使用泵气 或吹风通过所述膜来干燥。目标分子如核酸，可以从所述膜移除和引领到所述核酸扩增区域。所述样本预备区域可以额外地包含一个贮存器以供所述核酸萃取膜与所述装置 内其它贮存器流动地互相连接。一个核酸萃取膜或过滤器可以放置在所述贮存器内。所述核酸萃取膜可以放置在，例如所述贮存器的底部，而所述贮存器可供所述核 酸萃取膜之用。所述微液体装置可以额外地包含一个供干燥所述核酸萃取膜的区域(例如，以吹 风，加热或真空干燥)。所述微液体装置的所有区域可以包含贮存器以供贮存和分发样本处理试剂，所述 试剂可以包括但不限于酶，洗脱作用援冲剂，清洗援冲剂，废物贮存，核酸萃取和纯化媒介， 核苷酸，引物序列，清洁剂和酶的底物。包含这些试剂以及所述核酸扩增区域的贮存器可以 空间区域排列在所述微液体装置体的不同分段，和可以与其它的每一个以流体网络流动地 互相连接。5. 3核酸扩增区域和核酸扩增方法所述微液体装置体包括一个核酸扩增区域。所述核酸扩增区域可以包含一个核酸扩增反应器；一个核酸扩增试剂贮存器；和一个核酸扩增结果贮存器；其中所述核酸扩增反应器，所述核酸扩增试剂贮存器，和所述核酸扩增结果贮存 器是流动地互相连接。所述在贮存器内的核酸扩增试剂可以是如核酸引物或模板，核酸扩增混合物料， 核酸扩增酶，核苷酸，援冲剂或其它的核酸扩增试剂。这些核酸扩增试剂都是技术领域所熟 知的。所述试剂和结果贮存器是连接至所述核酸扩增反应器和可以有一个或多个由所 述核酸扩增反应器所出或接驳至所述核酸扩增反应器的进口。所述贮存器可以在所述进口 和出口中包含阀门，以有效地在例如热循环时密封所述核酸反应器。在某些实施例中，所述 芯片上的阀门可以在泵循环时产生气泡。如此，使用一组阀门以"推动"一核酸扩增试剂 进入所述核酸扩增贮存器可以引至气泡在所述核酸扩增反应器内产生，而且气泡是难以移 除。关闭所述进口阀门并使用所述在出口的泵产生一部份真空以填充所述核酸扩增间隔 (以引入代替推动所述试剂)，从而提供一机制以填充所述核酸扩增间隔而不产生任何气 泡。所述核酸扩增反应器亦可以只开所述进口阀门而填充和使用所述在出口的泵而不需要 首先在所述反应器内产生一部份真空来填充所述反应器而不产生任何气泡。因为微通道的制造方法，沿着一通道的角落或边沿的毛细流动可以出现。这些毛 细流动可以妨碍所述核酸扩增反应器的装填。使用一干燥的微液体装置，可避免流体优先 地湿润所述反应器的内部表面和在填充时被空气堵塞。在核扩增反应时产生的气泡，可以是微反应器的一个难题。一个倾则的核酸扩增 间隔可以使所型成的气泡在所述间隔的一边收集起来。所述聚苯乙烯的疏水性质和核酸扩增试剂混合物影响所述气泡在所述核酸扩增间隔的一边的收集能力。试剂混合物可以由多 种表面活性剂和添加剂组成，其可以辅助所述气泡的活动或形成。所述表面活性剂与所述 聚苯乙烯的疏水表面相互作用。在一实施例中，一个倾则的核酸扩增反应器结合一修改过的贮存器可用于排除所 述间隔与导管内的所有气泡。这种"循环"方法可以提供多种好处，包括增强混合(特别 是不同密度的试剂)，填充时减少气泡，在填充后有能力移除气泡，可以试剂填充所述阀门 和提供一个清晰的"窗口"给实时定量PCR(qPCR)。qPCR使用到敏感的光学检测器和光源，因此一个没有气泡干扰进入光线的核酸扩 增反应器是有利的。在一实施例中，所述光学检测设备可以放置于所述核酸扩增反应器的 下端，以确保气泡不会妨碍检测。从观察所得，当与没有液体(气体)的阀门比较，以液体 填充所述阀门可帮助所述阀门更好地密封。循环抽吸亦可以在升温时完成，以移除任何堵 塞在所述核酸扩增反应器内的气泡，因为所述液体的表面张力是与温度相反地有关。在另一实施例中，可以使用蜡或油去密封所述核酸扩增反应器。在所述芯片的 制造工序时覆盖所述间隔或将所述油/蜡引进到所述反应混合物(例如热会融化所述 蜡并容许其在重新固化时，在所述反应上形成一覆盖层；另外油会处于所述反应上，见 例如 Current Protocols in Molecular Biology, Unitl5.1, EnzymaticAmplification of DNA by PCR Standard Procedures and Optimization ；QuinChou, Marion Russell, David E.Birch,Jonathan Raymond and Will Bloch ；Prevention ofpre-PCR mis-priming and primer dimerization improves 1ow-copy-numberamplifications ；Nucleic Acids Research,1992，Vol. 20，No.71717-172)。在另一实施例中，从所述样本预备区域所萃取的核酸会引导(如推进，引入，吸 入或用泵抽吸)到所述核酸扩增区域。所述核酸是在一个混合贮存器内与一个或多个核 酸扩增试剂混和，然后所述混合物会引导进一核酸扩增反应器内，在其中任何技术领域熟 知的热介导核酸扩增可以进行，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应 (RT-) PCR, cDNA末端快速扩增(RACE)，滚环DNA扩增，核酸基础序列扩增(NASBA)，转录介 导的扩增(TMA)，和连接酶链反应。在一实施方例中，核酸扩增的热循环是通过所述膜进行，所述膜是用作造成所述 阀门和泵，而考虑到其细薄程度，所述膜并不存在明显的热障，而且亦为位于所述控制器多 方面的加热器和所述扩增反应器之间提供良好接触。在一具体实施例中，所述核酸扩增间隔是一个热循环反应器或间隔。所述热循环 间隔的底部可以是，例如一薄层的聚苯乙烯。所述热循环间隔的底部可以在热循环时以一 加热器加热，而所述加热器并不是放置在所述微液体装置体之内或之上(例如是外部的)。在另一实施例中，所述核酸扩增(例如PCR)反应器是以在所述微液体装置体的底 物内提供的通道结构(三墙)以一块聚苯乙烯薄膜用一弱溶剂粘合或层压方法围绕装配而 成的(US2006/0078470，在此全部引入作参考)。使用弱溶剂粘合的好处是能够在这些应用 当中使用聚苯乙烯，而亦可以保留所述放置在其中的微特征的完整性和可靠性。所述薄膜提供非常低的热抗阻，如此允许快速热循环。所述薄膜亦是灵活柔韧的， 可以与一加热器作出极好的接触。所述间隔是通过芯片上阀门和泵，流动地连接至一个或 多个的试剂进口贮存器和一个或多个出口贮存器。
在另一实施例中，所述核酸扩增反应器是用所述弱溶液层压方法去层压一聚苯乙 烯薄膜至圆形，矩形，正方形或其它在所述微液体装置体内形成的孔型的方法去制造。在已 围绕的底物孔和所述孔的底部毗连的一块薄膜之间形成一个扩增反应器，这可以使所述扩 增反应能够在环境压力的情况下升温时中进行。所述膜粘合在所述微液体装置上面，可以用于提供一个反应器以供核苷酸扩增， 例如快速PCR热循环。在所述核酸扩增反应器的底部有一块薄膜可以提供为减少所述系统 的隔热。核酸扩增需要一热循环。这个循环需要将热由所述反应器内的试剂转移出，或将 热能转移至所述反应器的试剂内。在一些实施例中，所述微液体装置体和核酸扩增是由有 较差导热率的聚苯乙烯(PS)所制造的。为要使在所述反应器内的流体温度急速改变，一薄 层的PS是优选的。在所述微液体装置的正规制造其间，一个25 μ m厚的薄膜会为所述热循 环反应器的底部密封。所述微液体装置亦可以有一个组合在所述装置上有电阻加热器，当其放置在所述 控制器上多个部份可接触电极，并可以对所述加热器供电以供所述热循环之用。至于核酸扩增，在所述控制器的多个部份上的加热器是放置成靠着所述膜，提供 一个低热抗阻路经来加热和冷却所述反应器。在另一实施例中，一个加热组成部份可以放置在所述扩增反应器之下，直接接触 被所述聚苯乙烯薄膜包围的分子扩增反应器。可选择地，一个热传导物料可以放置在所述 加热器和所述反应器底部的薄膜之间。根据核酸扩增反应器的不同方面，所述反应器可以 有利地备有一个范围在一微升的小部份到数十个微升容积的容量。在另一实施例中，所述核酸扩增反应器可以用夹子支撑，保证所述间隔底部和靠 着所述定义间隔底部的膜放置的所述加热器之间的接触。所述夹子作为所述反应器上部屏 障的支撑以减低变形机会。前述的加热器可能是不同类型的，例如传统表面安装电子电阻器，薄膜加热器，红 外线放射器，无线电频率或其它已知的微加热器。在一实施例中，所述加热器可以包含一个 或多个电阻温度检测器(RTDs)。根据一方面，两个RTDs可以使用于加热，而一个可以使用 于检测温度。可选择地，一个单一 RTD可以使用于加热和检测温度，如此提供一个较小的波 形因数。所述一个或多个RTDs可以整合在所述芯片内以形成所述反应器的基础。所述加 热器可以通过条件指令控制或以其它已知控制技术来控制。在一有益的方面，回馈控制是 与所述RTD —起使用，以确保所述核酸扩增能达到定点温度。在一实施力中，一个电阻温度检测器(RTD)可以使用为对所述核酸扩增反应器热 循环的一个温度感应器和一个电阻加热器。RTD是技术领域所熟知的和在市场上可以买到 (例如由Omega Engineering Inc.，Stamford，Cl)。RTD是一个高精度电阻，有一个已知的 电阻与温度之间的一阶导数关系。因此，温度的改变可由量度电阻改变来量度。这些感应 器是典型地由钼所做，如一绕线或者是镀在薄膜上，有一个标称电阻值为lOOOhms。因为所 述RTD的制造是本质上如制造电阻，因此亦可以如电阻般使用。当有适当的技术领域所熟 知的电路，任何人就能使用一个单一的RTD和在加热与检测模式之间转换。可选择地，可以 使用一组合的RTD令有些可以操作成专门的加热器，而其它则可操作成专门的感应器。这 些制造方法提供一紧密的加热和温度检测解决方案。
任何技术领域熟知的核酸扩增计划方案可以与本发明所述微液体装置使用。技术领域熟知的核酸扩增计划方案可以使适合于本发明所述微液体装置使用， 包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-)PCR，cDNA末端快速扩增 (RACE)，滚环DNA扩增，核酸基础序列扩增(NASBA)，转录介导的扩增(TMA)，和连接酶链反应。计划方案包含的几个不同的反应可以组合和在所述微液体装置上进行。例如，一芯片上DNA萃取/PCR计划方案可以如图8_11和12_16所示般在所述装 置上进行，其中所述装置有两个功能性区域，即一个样本预备区域和一个核酸扩增区域。 图11显示一个示例性的多个试剂贮存器的编排(计划图)，在所述微液体装置以Cells， Ethanol, Mixer, Waste, Elution, ΝΑΙ, ΝΑ2, AffI, AW2 作指示如图 10 所示。根据这个实施 例，Cells会盛载悬浮细胞和蛋白酶K;Mixer会盛载援冲剂AL ；Ethanol会盛载乙醇；AWl 会盛载清洗援冲剂AWl ；AW2会盛载清洗援冲剂AW2 ；Elution会盛载洗脱援冲剂AE ；NAl 是核酸贮存器1 ；NA2是核酸贮存器2 ；Amplification master mix是所述主扩增混合物 贮存器；Ampliconoutlet是一扩增出口贮存器1 ；AmpIicon outler2是一扩增出口贮存器 2 ;Waste是一废物贮存器。所述扩增反应器亦有显示，以及出口〃 Amplicon 1 outlet" 和"Amplicon 2 outlet"指向不在芯片上的分析地带。在一实施例中，一芯片上DNA萃取 /PCR计划方案可以如下进行1.加入所有溶液至其相应的贮存器；2.在Cells与Mixer之间循环细胞几次(例如，10分钟内5次)以裂解细胞，和 与Mixer内的最后阶段控制混合；3. 乙醇由 Ethanol 泵进 Mixer ；4.在Mixer内混和乙醇/细胞溶液；5.将裂解细胞溶液泵过纯化媒介再进入Waste (根据一示范例，纯化媒介包括一 无水硅酸膜)； 6.将清洗援冲剂AWl泵过纯化媒介再进入Waste ；7.将清洗援冲剂AW2泵过纯化媒介再进入Waste ；8.移除吸收在纯化媒介上的酒精(这可以经由装有控制器的泵吸入空气通过所 述纯化媒介来完成)；9.关闭干燥泵；
10将洗脱援冲剂AE从Elution泵过纯化媒介(膜)进入NAl ；
11将洗脱援冲剂AE从Elution泵过纯化媒介(膜)进入NA2 ；
12将扩增试剂从Amplification master mix贮存器泵进NA2 ；
13将扩增混合物从NA2通过核酸扩增反应器泵进Amplicon Outlet 1 ；
14在所述核酸扩增反应器内热循环所述剩余的扩增混合物；
15将扩增结果从所述扩增反应器泵进Amplicon Outlet 2 ；
16从Amplicon Outlet 2，所述扩增结果会被泵到所述核酸分析区域以供检测。
5.1核酸分析区域和分析方法
所述微液体装置可以包含一个核酸分析区域。从所述核酸扩增反应所得的扩增子
可以在所述核酸分析区域中检测。任何技术领域熟知的扩增子检测分析也可毫无困难地适用于所述核酸分析区域。在每一个所述核酸纯化区域中，所述核酸扩增区域和所述核酸分 析区域可以用最少一个流体通道，流动地互相连接至最少一个所述其它的两个区域。在另一实施例中，所述微液体装置可以包含一个样本预备区域和一个核酸扩增区 域，但没有一个位于装置上的核酸分析区域。所述核酸检测反而可以在一与所述微液体装 置(图8-16)中分离出的一个区域(或与一个检测器)进行。在所述微液体装置的实施例中包含一个核酸分析区域，所述核酸分析区域可以包 含一个反应器(贮存器)或反应区域在其中可以进行所述检测分析，和一个或多个贮存器 以供述贮存以下其中之一混合化援冲剂，高转渍膜清洗援冲剂，低转渍膜清洗援冲剂，或 接合底物。在一实施例中，所述核酸分析区域包括一个供检测一个目标核酸和一个所述目标 核酸的探针之间的互相作用的区域。本发明提供一个检测目标核酸的方法。在一实施例中，获得一个怀疑含有目标核 酸的样本。将所述样本导入所述微液体装置的样本预备区域中，并预备供核酸扩增之用。将 所述已预备的样本导入所述核酸扩增反应器，而在所述核酸扩增区域进行核酸扩增反应， 以扩增所述目标核酸。然后将所述扩增核酸目标导入所述核酸分析区域，而所述已扩增的 目标核酸就可以检测得到。所述检测步骤可以包含进行一终点检测分析，如检测所述已扩 增的目标核酸和所述目标核酸的探针之间的互相作用，例如使用技术领域熟知的标准方法 检测核酸杂交。在一实施例中，所述检测步骤可以包含观察颜色强度数值，荧光强度数值，电讯号 强度数值或化学发光强度。在另一实施例中，所述检测步骤可以包含产生最少一个与在所述样本中的目标分 子对应的强度数值。在另一实施例中，所述强度数值可以选自以下任一种，包括颜色强度数值，荧光强 度数值和化学发光强度数值，电流或电压。在另一实施例中，产生所述颜色强度数值可以包含分析或数码化一对应于所述样 本的影像以产生多个像素；为所述多个像素各自提供一个数字的数值；和为所述颜色强度 数值产生数字的数值。在另一实施例中，一个阀值可以计算出来，与所述颜色强度数值比较以检测所述 目标分子。在另一实施例中，最少一个所述颜色强度数值和所述阀值可以储存于数据库中。 所述阀值可以使用最少一个负控制样本来计算。本发明亦提供判断在目标对象中，患有或倾向患有一种目标疾病或失调的方法。 在一实施例中，所述方法可以包含a)从所述对象中获得一个样本，其中所述样本是怀疑含有一与所述目标疾病或失 调有关的核酸；b)检测所述样本中与所述疾病或失调有关的核酸，其中所述检测包括以下步骤获得一个怀疑含有所述目标核酸的样本；提供一个本发明所述的微液体装置；将所述样本导入所述样本预备区域；
预备所述样本以供核酸扩增；将所述已预备的样本导入所述核酸扩增区域；在所述核酸扩增区域内进行一核酸扩增反应，以扩增所述目标核酸；将所述已扩增的目标核酸导入所述核酸分析区域；和检测所述已扩增的目标核酸，其中检测所述已扩增的目标核酸是与患有或倾向患有所述疾病或失调有关。所述检测步骤包括判断一个数量(或水平)的所述扩增目标核酸，而其中所述方 法进一步包括所述数量(或水平)与所述目标核酸的一个预先选定的数量(或水平)作比 较。在一实施例中，所述数量(或水平)与所述预先选定的数量(或水平)之间的差别表 示患有或倾向患有所述目标疾病或失调。核酸检测的方法可以在所述核酸分析区域内进行，所述方法可以包括但不限于技 术领域熟知的方法方法如凝胶电泳，毛细管电泳，在原位观察结果，电化学检测法等。在一具体实施例中，所述核酸分析区域可以包含一个反应间隔或区域，以进行一 个反向点杂交分析来检测一个扩增子。这些分析都是在技术领域内熟知的。所述核酸分析 区域亦可以包含一个区域供检测在所述反向点杂交分析内的互相作用，例如检测在一反向 点杂交分析底物或插入物上。可选择地，所述底物或插入物可以由所述微液体装置和插入 一分离的阅读器或检测器中移除。在一实施例中，所述核酸分析区域可以包含一个RDB过滤器装置在一贮存器中， 并有一个玻璃原料的混合物在所述过滤器之下。所述贮存器可以装置或不装置一个加热 器，并可以被有较大块的隔膜供强力的用泵抽吸。扩增子可以直接由所述核酸扩增反应器 与所述杂交援冲剂混合，并通过所述RDB过滤器在一个正常方向泵至所述过滤器。一个玻璃原料的混合物可以用于保持所述混合物均勻地通过所述RDB过滤器。这 种配对可以稍后粘合至所述已杂交的扩增子和激活，以供检测或使用市场上可以买到的自 动阅读器阅读。一块大隔膜可以用于"抖松"(即以温和机械性搅动)所述混合物和在所述核酸 分析区域内促进一个更速率更快的核酸杂交。标准台顶式程序使用的斑点膜是放置于塑料袋或管内，然后再放置于一有温度控 制的水浴内。有些装置是制备成补充所述台顶式程序的；这些装置使用大型金属，塑料，和 /或玻璃集合管伴和橡胶衬垫，以供流过所述膜。这些例使用一包括密封垫子或垫圈的坚固 支撑。有孔的金属版也可以使用作支撑结构，并允许流体自由地通过所述吸水膜。The Immunetics MiniSlot & Miniblotter System 是市场上买得到的系统，其使 用一"密封垫子"来将所述膜夹在平行微通道和一支撑底版之间。在一具体实施例中，两 个技术领域熟知的系统如所述Immimetics系统可以用于造成两个与对方垂直的流向，如 此创造一个网状式样。所述RDB流动设计可以设计成在一小区域(图40-14)排列斑点。一多孔渗水的固 体支撑可以使用于所述膜之下。所述膜只固定在所述贮存器的周界；这可避免妨碍流体流 动通过所述膜，亦可预防流体导流所述膜的周界。所述阀门用于由所述RDB贮存器抽吸流 体或抽吸流体至所述RDB贮存器的有大体积的和能承受突然的压力改变。所述大的流体导 流是被所述倒角的层平均地分配和以所述渗透性坚固支撑所介导的。所述渗透性的坚固支撑不单止令流体导流慢慢地通过所述膜，而且更可以分配所述流动均勻地通过所述膜(图 40)。所述膜是固定在所述贮存器的周界(图41)。所述倒角的层可以被较小的孔取代，但 这种替代需要基于所述所述较小的孔的尺寸和位置作优化。一个倒角的通孔在所述膜上平 均分配压力，并需要很小甚至不需优化。所述渗透性的坚固支撑亦可在抽吸和"抖松"时 防止所述膜的大幅度偏斜。5. 5附加组件和所述微液体装置的编排所述微液体装置可以同时地包含一个差压传送系统，例如一个位于所述微液体装 置上或外部的，而又可以有效地连接至所述微液体装置或所述微液体装置上的特定区域的 控制器。在一实施例中，可以使用在美国专利申请号US2007/0166199A1所公开的控制器 (Zhou等，2008年7月19日，在此引入作参考)。所述控制器可以提供两个压力源，一个是 正压力和另一个是负压力。所述正压力可以用于密封阀门，而所述负压力是用于开启所述 隔膜。这些安排规定所述流体压力在所述泵内是永远不能高过所述阀门的，以防止所述阀 门渗漏。在一方面，在所述控制器内的螺线形电导管可以包含三个压力容器。这些安排可 防止所述螺线形电导管之间的"串音"和不管最接近控制的螺线形电导管的改变，规定供 应压力至所述阀门继续不变。所述控制器可以包含，例如一个备有一多个缝隙的气动集合管，和一个备有通道 在内的芯片集合管以供在所述微液体装置(“芯片")中从每一个所述缝隙导流气动讯号 至多个压力激活的膜(隔膜)(见，美国专利申请号2007/0166199Al，Zhou等，2008年7月 19日)。在所述芯片驱动集合管内的通道可以导流所述气动讯号与在所述微液体芯片内的 多个压力激活膜的配置一致。所述气动讯号可以导流至在所述微液体芯片内的最少一个讯 号列，供激活最少一个连接至所述讯号列的感应器。所述芯片驱动集合管可以包含最少一 个通道或一组信道，供从一所述气动集合管的单一缝隙至一在所述微液体芯片内的多个所 述压力激活膜导流一气动讯号。所述通道从所述缝隙至从所述单一通道分支出来的通道网 络导流所述气动讯号。所述从单一通道分支出来的通道网络导流所述气动讯号至每一个所 述多个压力激活膜。在其它实施例中，所述微液体装置可以在所述控制器的集合管上包含真空，压力， 电的，和光学的输入/输出的连接方法。这些连接方法是技术领域熟知的。在一实施例中，一个有通风孔的覆盖板可以固定地放置在所述试剂贮存器之上， 以防止可能的环境污染。根据在本发明说明书内的实施例，结构和自动样本预备/纯化和扩增工序是综合 在一单一微液体装置平台之上。人力辅助是不需要的。5. 6差压传送源和在所述微液体装置上抽吸液体所述微液体装置可以包含或与一差压传送源例如一机械性气泵或一组气泵配对。为克服抽吸大不相同的溶液(即粘性的或非粘性的溶液)的难题，在一实施例中， 泵可以放置在一个个别微液体组成部分如一无水硅酸膜的"上游"或"下游"而任何一 个泵也可以激活以更佳的抽吸流体通过这些微液体组成部分。每一个这样的泵都可以综 合在所述微液体装置上，以提供所述不同的压力来抽吸粘性的和非粘性的流体通过相同的 膜。一个个别的气泵亦可以在洗脱所述核酸至所述核酸扩增区域之前提供足够的气流来干 燥所述膜。
所述芯片上的泵可以造成一个两步泵。在一实施例中，高粘度流体可以用所述膜 下游的一个泵来抽吸过所述膜，低粘度流体可以用另一组在所述膜上游的泵推过所述膜， 而干燥工序可以使用另一个气泵通过打开的阀门来不断地抽取空气并通过所述膜。所述芯 片上的泵亦可以使用来抽吸生物样本和清洗援冲剂/试剂至另一个位置(例如，一个所述 微液体装置上的废物贮存器)，而所述阀门可以关闭，从而使所述气泵当风干所述膜时不会 抽取任何样本或试剂，对生物学上敏感的样本来说这是一个重要的考虑。5. 7芯片上的流体混合快速混和两个或多个不同流体的能力是流体系统的一个共同特征。在一实施例 中，所述微液体装置可以包含一个在一贮存器之下装配好的小管嘴结构，其可以用于产生 一个从所述试剂贮存器的底部出来的脉冲喷射，以在所述贮存器内混合液体，其中所述在 贮存器下面的隔膜通过所述管嘴将液体抽下并且再推上。这可以用于"抖松"所述反应混 和物。所述抖松作用可以用于例如在所述试剂贮存器内混和大容积和不同粘度的溶液。在一实施例中，抖松作用可以用一块在所述微液体装置上的贮存器之下的大隔 膜，以可逆向地抽吸液体通过所述贮存器底部的管嘴来提供独特的混合流动模式。在一实 施例中，一个由管嘴创造的流动路线和一个贮存器可以用作混合器(图17)。在所述装置上 提供一隔膜。固定在所述隔膜上的是一个流动通道和一个通过端口。上述提供的通孔是一 贮存器。当所述隔膜激活后，和所述贮存器是足够地填满后，一液体喷射会穿透包含在所述 贮存器内的流体。当所述隔膜撤回后，液体会从所述贮存器通过所述端口拉下。然后，当所 述隔膜是逆向时，所述液体喷射会明显地进入所述贮存器，但随后的回流会将液体从所述 贮存器的底部拉出。这样可以提供一个有效率的混合方法。5. 8多重加热器有条件地同步为了可以使用一仪器运行多个共享组件子系统的微液体装置，可以使用多重加热 器。当运行全部共享组件子系统的多个微液体装置时，最好是所有装置在相同时间完成循 环。为了达成这个目的，热循环一定要同步。在一实施例中，这可以用条件逻辑指令来达成。 在控制软件中，与一从感应器所得的温度与温度定点作比较。每一个加热器可以调较至一特定温度，而所述温度与其它加热器的温度可以相同 或不相同。然后，使用者可以轻易地创造一个条件指令，令所述控制软件循环运行直至所需 的情况达到。这个循环当所述加热器温度向所述定点移动时可以包含一简单时间延迟，或 其它指令来运行。当所需的条件达到后，所述程序继续并运行下一个指令。 5. 9对流热转移至所述微液体装置在本发明的微液体系统的某些实施例中，所述装置是可移除和可丢弃的。在这些 实施例中，可以使用一个加热系统，而其中所述加热组合部份不是直接接触所述装置。这样 可以简化所述装置/集合管界面。如所述加热组合部份从所述装置中移除，热力仍然必须 是转移到所述需要热力的区域。使用强制对流，热力可以从一芯片外加热器，通过以机器制 造的通道或管道转移至一所述装置的指定区域。所述加热器和所述界面两者的设计限制简 化了。流体可以用放置在一管道内的电阻组成部份，然后使流体通过所述管道来加热。 温度检测组成部份放置在所述液体流内以量度温度和回馈这个数值至一控制系统。然后， 所述加热流体可以通过通道和端口导流至所述装置需要加热的区域。
5. 10诱导加热在本发明的另一实施例中，一个诱导加热器可以用于所述装置上的加热操作(例 如，PCR热循环或RDB)。在本发明申请中的诱导加热器的主要好处是加热局部化，有效率的 热转移和不需要与所述微液体装置有任何直接连接(如，所述微液体装置没有电的接触是 需要的)。5. 11气动冷却当核酸扩增反应时，所述用于热循环的加热器必须要快速冷却。可以使用任何技 术领域熟知的对流或气动冷却组合部份来达成冷却。例如，一个小气泵输出口的一个管道 可以用于冷却所述加热器。气动冷却在室温，25°C，是可行的，因为操作PCR的温度是在 50-100°C之间。所述加热组成部份和与所述加热器接触之间的空气的温差越大，冷却就越 快。这个效果可以使用一个散热器或一个热力电力冷却器与所述系统配对来增加。5. 12 核酸在某些实施例中，本发明提供一个扩增和/或分离目标核酸分子(在这里亦指" 目标核酸"，“靶核酸"，“靶多核苷酸")的方法。分离的核酸分子(或"分离的核 酸")是一核酸分子(或"核酸")，是从在所述核酸分子的天然源头的其它核酸分子中分 离出来的。优选地，一个"分离的"核酸是没有核酸序列(如蛋白编码序列)的，自然地在 一生物的染色体组DNA内的核酸侧面的(如位置于所述核酸的5'和3'端的序列)，而所 述生物是所述核酸的起源。在其它实施例中，所述分离的核酸是没有基因内区序列的。“目标核酸〃，“靶核酸〃或〃靶多核苷酸〃是指个别多核苷酸序列目标的分 子。可以用本发明所述方法分析的目标核酸，包括但不限于DNA分子如染色体组DNA分子， cDNA分子和其片段，包括寡核苷酸，表达序列标签(“ESTs")，序列标签位点(“STSs") 等。可以用本发明所述方法分析的目标核酸亦包括RNA分子但不限于信使核醣核酸(mRNA) 分子，核糖体RNA(rRNA)分子，cRNA(如由体内转录的cDNA分子所预备的RNA分子)及其 片段。在各实施例中，所述分离的核酸分子可以包含少于大约5kb，4kb，3kb，2kb，Ikb，0. 5kb 或0. Ikb自然地在一细胞染色体组DNA内的核酸分子侧面的核苷酸序列，其中所述核酸是 得自所述细胞。此外，一个分离的核酸分子如一 cDNA分子，可以实质上没有其它细胞的物 料，当产生自重组技术时的培养基，或当产生自化学合成时的化学前导或其它化学物。所述目标核酸可以是DNA或RNA或崁合混合物或衍生物或其改良后的版本。所述 核酸可以改良其碱基部分，醣部分，或磷酸骨干，和可以包括其它附加的基团或标签。例如，在一些实施例中，所述核酸可以包含最少一个改良后的碱基部分，其选自以 下群组包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌 呤，4乙酰胞嘧啶，5-(羧羟基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷，5-羧甲基氨甲 基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-半乳糖基Q核苷，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤， 1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞 嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶， beta-D-甘露糖基Q核苷，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异 戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，Q嘧啶，2-硫胞嘧啶，5-甲 基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧 啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3_胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)W，和2，6-二氨基嘌呤。在另一实施例中，所述核酸可以包含最少一个改良后的醣部分，其选自一下群组 包括但不限于树胶醛醣，2-氟树胶醛醣，木酮糖，和己醣。在另一个实施例中，所述核酸可以包含最少一个改良后的磷酸骨干，其选自一下 群组包括但不限于一个磷硫酰，一个二硫代磷酸酯，一个硫代磷酰胺酯，一个氨基磷酸酯， 一个磷二酰胺，一个膦酸甲酯，一个烷基磷酸三酯，和一个甲酸缩醛或其类似物。用作引物，探针，或模板使用的核酸可以从市面买到或用技术领域内的标准方法 获得，例如使用一个自动化DNA合成器(那些市面上买到的如BiosearchTechnologies， Inc.，Novato, CA ；Applied Biosystems, Foster City, CA 等)和标准亚磷酰胺化学；或以 非特异性核酸裂开化学物或酶或位点特异性限制性内切核酸酶裂开一大型核酸片段。如所述从一个物种所得的目标核酸的序列是已知的，和想得到从其它物种得到的 对应基因，技术领域的常规是基于所述已知序列设计探针。探针与在想得到所述序列的物 种中得到的核酸杂交，例如，与目标物种中得到的染色体组或DNA库中所得的核酸杂交。在一实施例中，一个用作探针的核酸分子与所述已扩增的分离的目标核酸是互补 的，或在适度严格的情况下杂交。在另一实施例中，一个用作一个探针的核酸分子在适度严格的情况下，与一个已 扩增的最少95 %互补的目标核酸杂交。在其它实施例中，一个用作探针的核酸分子是最少45% (或55%，65%，75%， 85%，95%，98%，或99% )与一目标核苷酸序列或其互补的相同。在另一实施例中，一个用作探针的核酸分子包括一段最少有25 (50，75，100，125， 150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，500，550，600，650，700，800， 900，1000，1200，1400，1600，1800，2000，2400，2600，2800，3000，3200，3400，3600，3800，或 4000)个目标核酸或其互补的核苷酸。在另一实施例中，一个用作探针的核酸分子在适度严格的情况下与一已扩增的， 备有一个目标核苷酸序列或其互补的核酸分子杂交。在其它实施例中，一个用作探针的核 酸分子可以长度最少是 25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375， 400,425,450,500,550,600,650,700,800,900,1000，1200，1400，1600，1800，2000，2200， 2400，2600，2800，3000，3200，3400，3600，3800，或4000个核苷酸，和在适度严格的情况下 与一已扩增的目标核酸分子或其互补杂交。用作检测一个已扩增的目标核酸的探针(或模板)的核酸，可以用任何技术领域 熟知的方法例如，从一质粒，使用合成引物以聚合酶链反应(PCR)与所述目标核苷酸序列 的3'和5'末端杂交，和/或从一个cDNA或染色体组库用对所述核苷酸序列有特异性的 寡核苷酸探针来克隆来获得的。染色体组的克隆可以在适当的杂交情况下，例如，高紧密度 情况，低紧密度情况或适度紧密度情况，再基于探针对被探针鉴别的染色体组DNA的关联 性，以探针鉴别一染色体组DNA库来鉴定的。例如，当所述目标核苷酸序列的探针和所述染 色体组DNA是从相同物种而来，这样就需要使用高紧密度杂交情况；然而，如果所述探针和 所述染色体组DNA是从不同物种而来，这样就需要使用低紧密度杂交情况。高，低和适度紧 密情况是技术领域所熟知的。已扩增的目标核酸可以用技术领域熟知的标准方法来对其作可检测的标签。
所述可检测的标签可以是一荧光的标签，例如结合核苷酸类似物。其它适合用于 本发明的标签包括但不限于，生物素，免疫生物素，抗原，辅因子，二硝基酚，硫辛酸，烯烃族 的化合物，可检测的多肽，富有电子的分子，凭在一底物上的作用可以产生一个可检测的讯 号的酶，和辐射同位素。优选的辐射同位素包括几个例子如32P，. 35S，14C，15N和125L适合用于 本发明的荧光分子包括但不限于，荧光黄及其衍生物，若丹明及其衍生物，德州红，5'-羧 基荧光黄(“FMA" )，2'，7' -二甲氧基-4'，5' -二氯_6_羧基荧光黄(“JOE")， N,N,N' ,N'-四甲基-6-羧基若丹明(“TAMRA “ ),6'-羧基_X_若丹明<〃 R0X")， HEX, ΤΕΤ, IRD40和IRD41。适合用于本发明的荧光分子进一步包括氰染料，包括但不限 于 Cy2, Cy3, Cy3. 5，Cy5, Cy5. 5，Cy7 和 FluorX ；BODIPY 染料，包括但不限于 B0DIPY-FL， BODIPY-TR, BODIPY-TMR, B0DIPY-630/650，和 B0DIPY-650/670 ；和 ALEXA 染料，包括但不限 于 ALEXA-488，ALEXA-532，ALEXA-546，ALEXA-568，和 ALEXA-594 ；以及其它本发明所属领域 的技术人员所熟知的荧光染料。适合用于本发明的富有电子的指示剂分子包括但不限于， aferritin，血蓝蛋白，和金溶胶。可选择地，一个已扩增的目标核酸(靶多核苷酸)可以特 别地配合一个第一基团来标签。一个第二基团共价地与一个指示剂分子连系，而所述第二 基团对所述第一基团有亲和力，可以用于间接地检测所述靶多核苷酸。在这样的一个实施 例，适合作为一个第一基团的化合物包括但不限于，生物素和免疫生物素。使用本发明的方法来扩增和分析(例如检测)的所述目标核酸，可以在多核苷酸 分子备有与其杂交的所述探针的互补序列的情况下与一探针或多个探针接触。如这里使 用，“探针"是指一个别序列的多核苷酸分子，其中目标核酸分子拥有一个个别序列(通 常是一个与所述探针序列互补的序列)是可以杂交的，从而使所述靶多核苷酸分子与所述 探针的杂交可以被检测。所述探针的多核苷酸序列可以是例如，DNA序列，RNA序列或一个 DNA和RNA共聚物的序列。例如，所述探针的多核苷酸序列可以是萃取自细胞的染色体组 DNA的全部或部份序列，cDNA，mRNA或cRNA序列。所述探针多核苷酸序列亦可以是合成的， 例如，由本发明所属领域的技术人员所熟知的寡核苷酸合成技术。所述探针序列亦可以是 在体内酶催合成，体外酶催合成(例如PCR)或非体外酶催合成。优选地，本发明所述方法使用的探针是固定在一坚固支撑或表面，从而使那些没 有与所述一个探针或多个探针杂交或粘合的多核苷酸序列可以被清洗掉，并且在不会移除 所述一个探针或多个探针和任何粘合或杂交在上的多核苷酸序列的情况下移除。在坚固支 架或表面上固定探针的方法在技术领域内是熟知的。在一个别实施例中，所述探针会包含 一数组粘合至一坚固(或半固体)支架或表面，如一玻璃表面或尼龙或硝化纤维膜上的独 特多核苷酸序列。更优选地，所述数组是一可编址的数组，其中每个不同的探针是在所述支 架或表面位置上的一个特别知道的地位，从而使一个个别探针可以根据它在所述支架或表 面上的地址来鉴别其身份。在一特别的实施例中，在章节6. 10中描述的方法可以用于固定 核酸探针在一坚固支架或表面上。虽然本发明使用的探针可以包含任何类型的多核苷酸，在优选实施例中所述探针 包含寡核苷酸序列(如长度在大约4和大约200个碱基之间的多核苷酸序列，而更优选是 长度在大约15和大约150个碱基之间)。在一实施例中，所使用较短的寡核苷酸序列的长 度在大约4和大约40个碱基之间，而更优选的长度是大约在15和大约30个碱基之间。然 而，本发明的一个更优选的实施例是使用较长的寡核苷酸探针，其长度是在大约40和大约80个碱基之间，而长度在大约50和70个碱基之间的寡核苷酸序列(例如，长度是大约60 个碱基的寡核苷酸序列)是特别的优选的。5. 13成套工具在一附加的方面，本发明提供一套在一个或多个容器内的成套工具，其包含一个 本发明的微液体装置，一个或多个下列的部件一个控制器，形象化或检测器具，一个或多 个核酸引物，样本预备，核酸扩增和/或核酸检测或分析试剂，援冲剂，和清洗剂，或所述装 置的使用说明书。所述容器内的试剂可以在任何型态例如，冻干，或在溶液内(例如蒸馏水 或援冲剂溶液)等。根据本发明的方法，所述成套工具可以用于检测或量度一目标分子。所 述成套工具亦可以用于生产或合成目标分子。一个控制器亦可以提供为所述成套工具的一部份或者是所述成套工具的附属品。 所述控制器通常是由用户一次付款购买(预付的)以供一个或多个成套工具所使用，而这 些成套工具都是根据每一个分析来购买的。以下的例子是提供作说明之用，并不是对本发明有所限制。6.例子6. 1例子1 备有三个功能性区域的微液体装置实施例这个例子描述所述微液体装置(〃芯片")的实施例，这实施例有三个功能性区 域，一个样本预备区域，一个核酸扩增区域，而一个核酸分析区域是一个可以进行扩增结果 分析的区域(图1-7)和一个使用所述装置的示范方法。图2是图1中所显示的实施例中的所述微液体装置的等大分解图，，显示了所述阀 门计划图。图3A是图1所显示的实施例中的所述微液体装置的顶视图，显示所述样本预备区 域(“核酸(NA)萃取区域")，所述核酸扩增区域(在这实施例中是一个"PCR区域") 和所述核酸分析区域(“RDB区域")。亦显示了所述阀门，微液体通道，通孔，和一低密度 DNA过滤器在所述装置上的编排。在这实施例中，一个逆向点杂交法(ROB)终点检测分析可 以在所述核酸分析区域内进行。废物；废物贮存器。图3B是图1所显示的实施例中的所述微液体装置的顶视图，显示所述样本预备区 域101，所述核酸扩增区域102 (包含一个核酸扩增反应器112)和所述核酸分析区域103， 和所述装置上阀门，微液体通道和通孔的编排。分析区域的贮存器113。图4是图1所显示的实施例中的所述微液体装置的功能性计划图，1，显示与不同 贮存器有关的功能和贮存器(例如试剂)。W1，清洗援冲剂1，W2，清洗援冲剂2，HB，杂交援 冲剂，CB，接合援冲剂，Sub，底物援冲剂。图5-7是显示图1所显示的所述微液体装置的渐进操作的图表。虚线指出样本通 过所述装置的处理时的流向。图5中，细胞是与援冲剂AL和蛋白酶K在室温下从Rl到R2 之间来回抽吸几次作混合5-10分钟。R2的内容在从R2到R3之间来回抽吸几次与乙醇混 合，混合后的样本从R3通过所述核酸萃取媒介以抽吸方式转移至所述废物贮存器。AWl和 AW2通过所述核酸萃取媒介以抽吸方式转移至所述废物贮存器。所述核酸萃取媒介的风干 是以打开气泵5-10分钟并吹气或吸气穿过所述核酸萃取媒介来达成的。图6中，核酸(例如DNA或RNA)是以抽吸洗脱援冲剂通过所述核酸萃取媒介至贮 存器NAl来洗脱至贮存器NAl。扩增混合是从R8和R7至R9之间交替抽吸来与洗脱的核酸混合。扩增混合物与所述核酸一起抽吸至所述热循环反应器中，在其中进行核酸扩增反应。在图7中，150μ 1杂交援冲剂抽吸进所述核酸分析(例如反向点杂交或RDB)贮 存器。培育5分钟。将大约8-10 μ 1的所述扩增结果以95°C热变性5分钟。所述扩增结 果抽吸进所述核酸分析(RDB)贮存器。溶液以重复开/合操阀门32作"抖松"方式混合。 培养所述溶液5分钟而其内容倒空至WASTE。抽吸150 μ 1援冲剂W2进所述贮存器以清洗 所述膜两次，培养1. 5分钟，和移除至WASTE。抽吸150 μ 1结合作用援冲剂进所述核酸分 析(RDB)贮存器。以重复开/合操作阀门32来混和所述溶液。培养所述溶液3分钟并将 所述贮存器的内容倒空至所述废物贮存器。以抽吸150μ 1援冲剂Wl进所述贮存器来清洗 所述膜，培养1分钟，并移除援冲剂至WASTE。将100 μ 1所述底物抽吸进所述贮存器，培养 5-10分钟，和将所述贮存器的内容移除至所述废物贮存器。以抽吸150 μ 1援冲剂W2进所 述贮存器来清洗所述膜，培养1. 5分钟，和移除所述援冲剂至所述废物贮存器。6. 2例子2 备有两个功能性区域的微液体装置实施例本实施例描述其它备有两个功能性区域的微液体装置实施例(图8-11)和使用方法。图8显示其它备有两个功能性区域的微液体装置的实施例，所述区域是样本预备 区域和核酸扩增区域。如箭嘴所指，所述样本预备区域包括贮存器供样本输入和预备，样本 纯化和核酸萃取。所述核酸扩增区域包括一个核酸扩增反应器(“扩增间隔")。所述装 置的实施例亦包括一个核酸扩增结果萃取区域(“扩增结果萃取区域")，所述区域中的 扩增子是在核酸扩增结束后从所述微液体装置中萃取。所述装置的这个个别实施例尺寸是 50mmX 38mm0图9是图8所示的微液体装置的分解图，显示其三层(为清晰起见，这里显示的所 述装置并没有所述膜)。图10是图8所示的微液体装置的顶视图，显示所述装置上的贮存器，通道，阀门和 泵的计划图。图11是图8所示的微液体装置的另一个顶视图，显示所述装置上的泵，阀门和通 道的计划图。在这个微液体装置的实施例中，所述贮存器是如下(图11):Cells-悬浮细胞和蛋白酶KMixer-援冲剂 ALEthanol-乙醇Affl-清洗援冲剂AWlAW2-清洗援冲剂AW2Elution-洗脱援冲剂 AENAl-核酸贮存器1NA2-核酸贮存器2Amplification master mix-扩增试剂C存器Amplicon outlet 1_ 扩增出口C存器 1Amplicon outlet 2_ 扩增出口C存器 2扩增反应器
以下是一个图11显示所述微液体装置的实施例在操作时的样本预备进程的例 子1.循环细胞裂解，10-15分钟2.与乙醇混合3.传输细胞裂解溶液至Si膜/废物4.传输AWl和AW2至Si膜/废物5.真空5-10分钟作风干6.洗脱作用1和27.与主PCR混合8.装载PCR反应器9. PCR 反应10.释放PCR结果6. 3例子3 备有两个功能性区域的微液体装置实施例这个例子描述另一个备有两个功能性区域的微液体装置(“芯片")实施例，其 中所述区域是一个样本预备区域和一个核酸扩增区域，但没有一个芯片上的核酸分析区域 (图 12-16)。所述装置有50mmX38mm的装置体尺寸和包括以美国专利申请号2006/0078470A1 所示的弱溶剂粘合法来粘合的三个夹心层。所述装置进一步包括一放置在所述装置的顶部 表面的多个贮存器和流动地与不同的阀门和流体通道网络连接。所述装置亦包括一个成为 所述功能性流体网络一部分的核酸扩增反应器。图13显示图12所示的微液体装置的实施例的编排。备有三组双向泵作为样本 预备，PCR试剂预备和装载之用。流体可以在共享所述相同泵隔膜的贮存器之间转移。所述 毗邻着所述核酸扩增区域，用圆圈标示为"2"和"3"的贮存器群组是流动地与所述扩 增区域互相连接。所述用圆圈标示为"1"的贮存器群组是在所述样本预备区域内的贮存 器群组。根据这个实施例，这里有三组泵。流体可以在所述共享相同泵隔膜的贮存器之间 转移。这个实施例会使用到七个在群组1的泵，三个在群组2的泵，和两个在群组3的泵。 在这个实施例中，所述泵是双向的。多重源头贮存器可以综合成一个目标贮存器以同时地 创造更佳地混合效果。在一个基于这个实施例的方法的例子(图14)，细胞与细胞裂解援冲剂和蛋白酶K 在室温之下在贮存器Rl中培养5-10分钟。所述细胞裂解混合物与从贮存器R2中的乙醇 /DNA结合援冲剂，以交替地从Rl和R2抽吸至R3来混和。所述混合后的样本从贮存器R3 转移至所述过滤器贮存器，和所述溶液是通过一个位置在所述贮存器底部的纯化膜(例如 一个无水硅酸膜)来牵引的。所述与过滤器粘合了的DNA是以清洗援冲剂1来清洗，而废物则转移至所述废物 贮存器(图15)。所述粘合了的DNA然后是用清洗援冲剂2来清洗，而废物则转移至所述废 物贮存器。打开所述气泵数分钟以风干所述膜。将洗脱作用援冲剂抽吸至所述过滤器贮存 器，培养并清洗至核酸贮存器NAl。在这个阶段，一些DNA可以分成等份部份供台顶式运作 之用，而余下的可以用于芯片上的运作。DNA 模板从 NAl 转移至 Nucleic Acid Amplification Mix 并混合(图 16)。将Nucleic Acid Amplification master mix与DNA模板牵引至所述反应器，在其中一个热循 环计划方案是在进行中。将核酸扩增结果抽吸进所述结果贮存器。在这阶段，一些DNA可 以分成等份部份供台顶式运作之用，而余下的可以用于芯片上的运作。6. 4例子4 使用微液体装置扩增总RNA这个例子描述使用图8-11所示的微液体装置的实施例来扩增从HEK 293T细胞产 生的总RNA的结果。在芯片上预备总RNA和使用下列计划方案以凝胶电泳分析将0. IN氢氧化钠运行过芯片的所有间隔并重复多次。抽吸水通过所有间隔将所述芯片广泛地清洗，风干，和组装透析柱。解冻两管HEK 293T细胞并使用常规方法离心沉淀，并清除上清液。将600 μ 1的RLT/Bme (用20 μ 1 Bme预备2. Oml RLT)加入每一个的沉淀物，重新 悬浮所述沉淀物并将之结合。使用标准方法，将所述再悬浮的沉淀物通过一 Qiashredder柱(两个连续运行) 来均勻化。用RLT-Bme将容量加至1. 5ml并转移至一 5ml的培养管。将1. 5ml的70 %乙醇加进所述管并倒转所述管以混和。将3Χ200μ 1等份部份移出并分配到不同的管。将500μ1的1 IRLT-Bme 70%乙醇加进这些管并混合。这些管对应图13的 样本1-3 (Qiagen控制)。对样本1-3和10使用一个标准不在芯片上的透析柱计划方案(Qiagen RNeasyMini Kit, Cat No. 74107)。将 RNA 洗脱进 30 μ 1 水(没有预热)。将200 μ 1没有在样本1-3中使用的余下原始样本，用吸液方法直接装载入芯片上 的个别样本进口柱，和使用泵将其牵引通过所述柱至废物。所述余下样本的容量与样本1-3 和标示为样本10 (Qiagen控制)的，在芯片以外一同处理。所述芯片上的柱是以2X22 μ 1的RWl清洗。所述芯片上的柱是以4X22 μ 1的RPE清洗。容许所述柱风干大概20分钟。风干透析柱之后，将30 μ 1室温水加进芯片样本4-6 (直接用吸液方法移液在柱 上)并培养所述样本10分钟。使用芯片上抽吸收集所述纯RNA。将30 μ 1的暖水加入芯片样本7-9 (直接用吸液方法移液在柱上)并培养所述样 本10分钟。使用芯片上抽吸收集所述纯RNA。当抽吸时，将另一个10 μ 1的室温水加入每一透析柱。将纯RNA转移到一 1. 5ml管中，再将另外20 μ 1的水加进所述管以弥补从所述芯
片失去的容量。在260和280nm读取吸光率；5 μ 1在总共200 μ 1的水里(40倍稀释)。从每一个样本中抽取5μ 1使用标准琼脂糖凝胶电泳作分析；琼脂糖/TAE凝 胶；100伏特，30分钟。如图18 所见，与一标准 Qiagen 方法(RNeasy Mini Kit, Cat No. 74107)比较，所 述芯片上RNA预备产生相似数量/质量的RNA。这个实验亦证实，当芯片上核酸预备时，所 述芯片上的隔膜泵可以畅顺地处理高粘度物料进行。
图19显示图8-11所显示在所述微液体装置(〃芯片“)上进行RT-PCR的结果。 所述核酸扩增区域内的一个PCR是使用Invitrogen Superscript One-Step RT-PCR备有 Platinum Taq System进行的。从HEK 293T细胞产生的总RNA如上述般在芯片上预备，并 作为模板RNA。使用引物识别β-肌动蛋白产生所述cDNA，并通过PCR(RT-PCR)作扩增肌 动蛋白 cDNAo 正向引物是:ACG TTG CTA TCC AGGCTG TGC TAT[SEQ ID NO 1](存在于外显 子 3 内)。反向引物是:ACT CCT GCTTGC TGA TCC ACA TCT[SEQ ID NO 2](存在于外显子 5内)。获得预期的结果，如一 687的cDNA扩增子。RNA从HEK 293T细胞中产生。使用引物识别β -肌动蛋白产生所述cDNA，并通过 PCR(图19)作扩增肌动蛋白cDNA。第1行，DNA标准；第2行，从在芯片上进行RT-PCR所 获得的扩增子结果；第3行，输入RNA(1 μ 1)图20显示八个在不同热循环和运行时间底下的PCR运行在芯片上的可重复性。图21显示所述微液体装置和一个传统的台顶式PCR平台之间的比较结果。相比 起所述台顶式运作，所述芯片上在30个热循环下产生5000个质粒拷贝的结果需要一小时， 而台顶式需要1.75小时。图22显示在这实验中从与所述微液体装置联合使用的所述PCR热循环器的一个 典型循环。下图是几个首四个循环如上图显示的展开图。图23显示一个在所述微液体装置上运行的一个RT-PCR计划方案的结果。简要 地，HIV RNA如下所示是使用台顶式(bt)和芯片上的计划方案来分离的。20，OOO(Btl)和 2，500 (Bt2)个披甲RNA拷贝是使用台顶式和芯片上的RNA分离。台顶式洗脱容量是50μ 1 ； 理论上100%生产量是400个RNA拷贝/ μ 1。芯片上的洗脱容量是20 μ 1 ；理论上100%生 产量是125个RNA拷贝/ μ 1。RT-PCR使用一个Iml的洗脱容量。一个技术领域熟知的标准RT-PCR计划方案是使用在50°C下反转录作用30分钟， 接着是95°C下进行15分钟中运行，然后是使用40秒在95°C，45秒在58°C，和60秒在72°C 下运行40个循环的PCR计划方案。RT-PCR之后从凝胶影像中估计分离生产量。如图23所显示，从芯片上运行所得的RNA产生最少一个如在相同的实验情况下， 使用所述Qiagen RNAEasy kit用相同计划方案在所述台顶式运行的可比较的数量的RNA。 第1行分子量标准；第2行Btl-RNA ；第3行Bt2_RNA ；第4行芯片-RNA。6. 5例子5 使用一微液体装置检测PCR结果的方法以下的数据示范了一个用家可以在实质上没有干预的情况下，使用所述微液体装 置来快速和容易地进行PCR。所有必须步骤，包括细胞裂解，萃取和纯化DNA或RNA，和将所 述核酸PCR或RT-PCR，都可以在一单一的微液体装置系统上完成。此外，设计一个通过在一 排列的寡核苷酸探针以反向打点杂交技术(RDB)分析的杂交，可以变性所述PCR扩增子和 检测所述PCR结果的一个系统。在本例子内使用的微液体装置的实施例有两个功能性区域。图8-11所示的实施 例是实制上使用的，但在图12-16所示的所述微液体装置也可以使用。所述微液体装置有 一个便宜的三层聚苯乙烯基础的层压系统，当其以专利的处理方法组合和层压后创造了 泵，阀门，微液体通道，试剂贮存器，DNA/RNA萃取/纯化组件，和有热循环的能力。此外，所 述系统的设计容许一个双向的流体流动，这是对某些分析步骤很有用的例如细胞裂解。最 后，在所述微液体装置和所述控制器之间没有液体接触，如此可以减轻污染的可能性。
所述不同的微通道，泵和阀门的配置是可以很容易地改变的，而所述微液体装置 的格式是足够通用于分析一广泛系列的标本。简单地，以图12-16所显示的实施例为参考， (虽然可以使用图8-11内所述的实施例)，一个样本通过以下步骤在所述微液体装置系统 (图14-16)受到核酸扩增分析。11.将原始的临床样本引入贮存器Rl内，其中包含细胞裂解援冲剂和蛋白酶K。12. Rl的内容与乙醇和包含在贮存器R3内的核酸粘合援冲剂以在Rl和R3交替地 抽吸至贮存器R2的方法来混合。13.所述已混合的样本(现在在R2内)是转移至所述过滤贮存器(Filter Res) 并且牵引通过一个在所述贮存器底部的无水硅酸膜来粘合所述已萃取的核酸至无水硅酸。14.所述无水硅酸粘合的核酸以包含在Wl内的援冲剂来清洗，废物则转移往所述 废物贮存器。15.所述无水硅酸粘合的核酸以包含在W2内的援冲剂来清洗，废物则转移往所述 废物贮存器。16.所述气泵是开上以供风干所述无水硅酸膜。17.洗脱作用援冲剂(从贮存器E = Iu)抽吸到所述过滤器贮存器并培养，跟随着 是洗脱25 μ L的纯化核酸进贮存器NAl。18.所述在NAl内的纯化核酸是转移到所述核酸扩增Mix贮存器而所述模板与所 述核酸扩增试剂以1 9比例混合(即，引物对和所有其它核酸扩增反应成分)。19.将所述核酸扩增主混合物和核酸模板牵引进核酸扩增反应器。20.核酸扩增热循环在核酸扩增反应器内进行。21.所述最后的核酸扩增结果抽吸进所述结果贮存器(PCR Prod)。RNA的分离和纯化为了测定所述微液体装置是否可以如"台顶式"方法般可有效地萃取和净化 RNA,以同样使用所述Qiagen RNeasy计划方案的所述微液体装置和所述台顶式来萃取相 同数量的细胞(500，000细胞)，将RNA从人胚胎肾细胞(HEK 293-T)中分离。在上述两个 计划方案，每个方案中的多重复制琼脂糖凝胶电泳标示着所述微液体装置是与所述"台顶 式"的方法是对等地进行的(图18)。使用一台顶式热循环器和所述微液体流体装置系统的PCR对照为了测定所述微液体装置可以有效地完成热循环，可选择Bio-Rad MJ Mini热 循环器或建立在所述控制器上的微液体装置内的热循环器任一个，通过30个循环来扩增 5X103个拷贝的质粒(prlpGL3)。如在琼脂糖凝胶电泳中检查到，在两个情况中可获得适 当的扩增子是表示所述微液体装置系统在实质上没有需要到人手努力的情况下是有能力 产生正确的扩增子的(图21)。应用所述微液体装置系统在检测β -地中海贫血和HPV当核酸萃取和纯化的普通情况与所述微液体装置的热循环一起建立后，就可以实 现当导入原始样本时可检测特殊基因靶。为示范一个别微液体装置原型能在多快的情况下 配置成作检测所述目标靶之用，微液体装置是发展成可以进行学术化验室已经发展出的通 过PCR分析检测个别目标靶的台顶式计划方案。所述微液体装置没有任何显着优化，因此 所述系统进行所有必需的预备和分析步骤时(即细胞裂解，核酸萃取/纯化和PCR扩增)会使用技术领域熟知的标准分析情况和计划方案。各种各样不同的临床标本使用这种手法分析。例子如利用所述样本贮存器和所述 裂解援冲剂贮存器之间的双向流向将全血(50 μ L)引进所述微液体装置，然后细胞裂解。 核酸流过所述微液体装置上的无水硅酸膜组件。最后，在30个循环的PCR后，两个使用一台顶式热循环器(第4_5行)或所述微 液体装置系统(第2-3行)任何一个方式作平行PCR扩增的相同样本在琼脂糖凝胶上分析 (图 24)。此外，当从一个标本中获得第2和第4行的时候，从第二个标本中获得第3和第5 行。就通过所述台顶式PCR反应所获得的较强讯号而论，讯号强度的明显差别是非常有可 能地因为在所述微液体装置中使用不同容量的起始物料。当所述台顶式PCR分析的起始容 量是200 μ L时，所述微液体装置只使用50 μ L。更重要的是，两组PCR扩增子的电泳迁移率 是实质上相同的。在类似的方式下，使用Ll基因降解引物ΜΥ09/ΜΥ11以PCR分析阴道抹棒有否存 在着人乳突淋瘤病毒(HPV) (Gravitt PE, Peyton CL, Apple RJ, WheelerCM =Genotyping of 27 human papillomavirus types by using Ll consensus PCRproducts by a single-hybridization, reverse line blot detection method. J Clin Microbioll998, 36(10) :3020-3027)。将阴道抹棒放在磷酸盐缓冲盐水援冲剂内，在搅动后将上清液使用台顶式PCR或 所述微液体装置系统其中任何一种来分析有否存在HPV。如图25所示，所述微液体装置系 统提供的结果如使用台顶式方法的本质上相同。将三个独立阴道抹棒悬浮在磷酸盐缓冲盐水中，并使之以"台顶式"(右)裂解， DNA萃取/纯化和PCR或简单地引进一微液体装置中(右)而所有功能是自动的进行。样 本1，2和3代表三个独立样本，其分成两个等份部份并如上述描写分析。在所述台顶式方法下，病毒的DNA首先分离和纯化，然后使用一台顶式热循环器 来作PCR扩增。在所述微液体装置系统下，简单地将所述磷酸盐缓冲盐水上清液加进所述 样本坑，而所有功能是自动进行的(包括病毒的裂解，核酸萃取/纯化，和PCR)。检测人乳突淋瘤病毒(HPV)时使用到一个合并有反向打点杂交技术(RDB)(即一 核酸分析区域)模块的微液体装置。使用可以扩增多种HPV血清型的引物对将从阴道抹棒 获得的HPV作PCR扩增。在所述微液体装置上，将生物素化的扩增子变性，并将之流向所述 4x4排列的抗血清型HPV-11，HPV-16，HPV-31，和HPV-52的探针，跟随图27的图表式地描述 的计划方案进行。在所述综合微液体装置系统内正确地检测HPV-52(顶部)和HVP-Il (底 部)(图26)。为试验其实用性，我们用MY09/MY11降解引物扩增了阴道抹棒样本(PeytonCL， Wheeler CM !Identification of five novel human papillomavirus sequences in theNew Mexico triethnic population. J Infect Dis 1994，170(5) : 1089-092)，其可以扩 增一多种不同的HPV血清型(HPV11，16，31和52)。两个引物都是在其5'末端生物素化以 产生双链生物素化的扩增子。所述RDB模块是配置为变性所述PCR扩增子和将其流向所述 打点杂交排列的表面(Immunodyne C, Pall Life Sciences, Ann Arbor MI)其中所述扩增 子与其各自的俘获探针杂交。
在上述研究之外，我们成功地使用所述微液体装置系统去检测在血浆和唾液两者 内的HIV-I，达到与使用〃台顶式〃 RT-PCR方法获得的同等结果。总的来说，这些初步的数据显示出所述微液体装置可以用于达成在易于使用的形 式下，对临床样本作全自动PCR或RT-PCR分析。6. 6例子6 芯片上处理大肠杆菌样本的步骤在本例子中使用的所述微液体装置实施例有两个功能性区域(图12-16)。DH5a， 一个所述非致病原K12品种的大肠杆菌衍生物，用作为芯片上处理的样本源头。所述引物是 从所述基因组DHlOb中产生的。16S核糖体RNA以rrs基因编码。“肠杆细菌共同抗原(ECA) ” 是以wzyE基因编码。所使用的引物是16S_367 (7X/基因组)和ECA_178 (IX/基因组)(见 Bayardelle P,and Zafarullah Μ. (2002)Development of oligonucleotide primers for the specific PCR—based detection of themost frequent Enterobacteriaceae species DNA using wee geentemplates. Can. J. Microbiol. 48 :113-122)。图14-16是本实验所用的微液体装置的实施例的操作示意图。箭嘴所示是大肠杆 菌样本如经所述装置上的处理。在图14 1.大肠杆菌是与细胞裂解援冲剂和蛋白酶K在室 温下在贮存器Rl内培养5-10分钟。2.所述样本然后与乙醇/DNA结合援冲剂，从R2以交 替方式在Rl和R2抽吸至R3来混合。3.混合后的样本从R3转移到所述过滤器贮存器，而 所述溶液则牵引通过一在所述贮存器底部的无水硅酸膜。在图15 4.所述粘合了的DNA以清洗援冲剂1清洗，并将废物转移至废物贮存器。 5.所述粘合了的DNA以清洗援冲剂2清洗，并将废物转移至所述废物贮存器。6.然后打开 所述气泵数分钟以吸引空气通过所述无水硅酸膜来风干所述无水硅酸膜。7.洗脱援冲剂抽 吸至所述过滤器贮存器，培养并且洗脱至NAl。在这阶段，一些DNA可以分成等份部份以供 台顶式运作，而余下的可以用于进行芯片上的运行。在图16 8. DNA模板从NAl转移至PCRMix并混合。9. PCR主混合物与DNA模板一 起牵引进所述PCR反应器。10.进行PCR热循环。11. PCR结果抽吸进所述结果贮存器。在 这阶段，一些DNA可以分成等份部份以供台顶式运作，而余下的可以用于进行芯片上的运 行。当自动运作是与一个"合理的"大肠杆菌装载(IO3水平)时，全自动可靠性和 效率的成功率可以使用PCR灵敏度分析和吸光率研究来评估。使用两个设计可以获得 80-90%的成功率。大多数市面上买到的PCR结果，其普遍成功率在 90%。全自动效率是比较从所述微液体装置获得的核酸萃取和PCR结果与所述台顶式 的结果来评估。这里有两个连续的芯片上操作核酸(NA)萃取和PCR扩增。在低大肠杆菌装载下 直接比较核酸萃取是很困难的，因为从20 μ 1的1000大肠杆菌/μ 1的样本取得的DNA得 出传统UV光谱仪不能检测的UV吸光率。图28显示将载有1，000大肠杆菌的苹果汁装载在两个芯片上处理之间的比较。先 预备所述已装载的果汁，然后再将两个1 μ 1等份部份的在芯片上纯化的DNA移除并在所述 台顶式中扩增，而余下的纯化DNA在芯片上扩增。将所述结果移除并在凝胶上如图显示般 分析。至于PCR，芯片上萃取的DNA是用作模板，以供台顶式和芯片上的PCR运行来确定所术芯片上的PCR效率。图29显示使用芯片上萃取的DNA在台顶式和芯片上PCR的结果 比较。大肠杆菌装载范围从5 X IO3/ μ 1-1 X IO4/ μ 1。当所述装载是足够时，芯片上和台顶式的结果是非常可比较的。6. 7例子7 使用所述微液体装置检测在食物基质内的大肠杆菌本研究主要目的是示范一个所述微液体装置的实施例可以使用PCR作基底的分 析，有效地进行所有预备和分析步骤以检测在食物基质如苹果汁，苹果西打和奶内的大肠 杆菌。大肠杆菌品种DH5CI是在培养基中生长并引入进不同的基质使用。这个研究中使 用到两个不同的基因靶。将一个16s核糖体RNA基因(由rrs基因编码)，一个维持在跨细 菌科和种的高度保存基因，和在肠杆细菌科普遍存在的肠杆细菌共享抗原ECA(由wyzE基 因编码)以PCR扩增。所述PCR引物用于检测所述核糖体RNA和ECA基因是预期会产生分 别是367bp和178bp的扩增子。评估了两个所述微液体装置的不同实施例和评估三个已引入范围从1000到 500，000个微生物的不同装载浓度大肠杆菌的不同样本(苹果汁，苹果西打和奶)。最后， 总共大概有100次微液体装置在这初步研究中运行。结果虽然在这个研究中评估了两个不同的设计，这个例子焦点只是评估其中一个的所 述设计(图18-21)。这个微液体装置利用到在一个单一微液体装置上的两个功能性区域。 所述第一个区域并合了所有样本预备(即细胞裂解，DNA萃取/纯化)，和所述第二个区域 是供PCR扩增。这些区域之内有三组泵/阀门供完成不同的功能。流体可以在共享所述相 同泵隔膜的不同贮存器之间转移。此外，多个源贮存器可以结合成一个单一目标贮存器，供 实行有效的混合，亦可以利用所述泵的双向本质来增强混合。简单地描述如下的步骤22.在室温下将20 μ 1大肠杆菌样本与细胞裂解援冲剂和蛋白酶K培养5-10分 钟。23.将Rl与从R3的乙醇/DNA结合援冲剂由Rl和R3以交替方式抽吸进R2来混
口 O24.从R2转移已混合的样本至所述过滤器贮存器，并牵引所述溶液通过一位置在 所述贮存器底部的无水硅酸膜，将所述已萃取的DNA结合至无水硅酸。25.以在Wl内的清洗援冲剂1清洗所述与无水硅酸粘合的DNA，转移废物至废物 贮存器。26.以在W2内的清洗援冲剂2清洗所述与无水硅酸粘合的DNA，转移废物至废物
贮存器。27.将所述气泵打开数分钟以牵引空气通过所述无水硅酸膜并风干所述无水硅酸膜。28.抽吸洗脱援冲剂(由贮存器Elu)至过滤器贮存器，培养并洗脱25 μ 1纯化的 DNA至贮存器NAl。29.从NAl转移DNA模板至所述PCR混合贮存器并将模板与所述PCR试剂在1 9 比例下混合(即引物对和所有其它PCR反应成分)。30.将PCR主混合物与DNA模板牵引进所述PCR反应器。
31.在PCR反应器内进行PCR热循环。32.抽吸PCR结果进入所述结果贮存器(PCR Prod)。在这初步努力的时候虽然大概进行了 100次不同的分析，但这例子描述的代表性 数据在每一次的运行是非常有再生性的。图28-37呈现的数据代表从导入一已知数量的大 肠杆菌进入磷酸盐缓冲盐水援冲剂，苹果西打，苹果汁和奶所获得的结果。我们发现，当使用Qiagen DNAEasy kit萃取DNA时，所述样本容量的变化可以由 10-30 μ 1到效果不明显的。当所述样本与细胞裂解援冲剂ATL和蛋白酶K放置在Rl后会如上述描写般自动 处理，而所述最后从无水硅酸膜上洗脱的DNA容量是25 μ L0为进行PCR，所述DNA模板在 引进所述热循环间隔之前与PCR主物以1 9的比例混合。所以，即使在一个不太可能的 情况下DNA的恢复是假定为100 %，最终会被PCR扩增的总DNA量将会理论上代表DNA从不 多于所述总起始微生物数量的25份之1中获得(例如，若所述起始微生物数量是1000，所 述最终引进所述PCR间隔的DNA将会是不多于40个微生物)。悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的大肠杆菌为帮助确立实验情况，最初的努力是集中在一已引入磷酸盐缓冲盐水中已知数量 (或数目)的大肠杆菌。将500，000个生物引进磷酸盐缓冲盐水并在所述微液体装置上分 离/纯化DNA。从所述25 μ L分离的DNA模板中移除的一个1 μ L等份部份并将之在台顶式 方法作PCR扩增，而另一个从所述25 μ L分离的DNA模板中移除的1 μ L等份部份与PCR主 混合物在1 9比例下混合，并进一步在所述微液体装置上扩增。在图32中，在所述"台 顶式"从完全综合DNA分离/纯化中获得的PCR样本(第3行)的凝胶分布图与在所述相 同微液体装置进行的PCR(第4行)比较下显示出不能区别的结果。在所述相同凝胶上的 第1和2行分别代表负(水)和正(从基于UV吸光率量度的1000个微生物中得到的DNA) 控制。重复分析相同类型的样本得出本质上可再生的结果，这表示了所述微液体装置可以 用于可靠地检测目标微生物，并获得PCR结果，而且是几乎不能从"台顶式"PCR分析结果 中区别。只是将10，000个微生物引进所述起始20 μ L样本，然后如上述的方法通过三个不 同微液体装置处理，就可以得到本质上相同的结果。微液体装置上的DNA分离和纯化以下分析计划方案是进行几个与上述相似的附加实验来建立的试剂是从Qiagen DNEasy kit 禾口 Promaga PCR kit 中得到的。
PCR计划方案起初的2分钟在95 °C下培养。每个循环有25-35循环在95°C下进行5-15秒。在60 "C 下进行 20-30 秒。在72C下进行20-25秒。最后在72°C中培养3分钟。在将大肠杆菌引进苹果西打与报告将微生物引进磷酸盐缓冲盐水的相似方式下，不同浓度的大肠杆菌引进从 市面获得的苹果西打，并在所述微液体装置系统中分析。分析已引进500，000个微生物的 苹果西打(图30A)产生出"台顶式"PCR分析(第3行)和完全综合微液体装置分析(第 4行)之间本质上不能区别的结果。第1和2行分别代表所述的负和正控制。在所述负控 制行出现的微小的带可能是因为实验室内的交叉污染。减低引进苹果西打的微生物数量至 100，000再次显示出靶序列的好的扩增(图30B)。第1-2行显示所述产生自一完全综合微 液体装置运行的扩增子，而第4-5行显示出所述相同DNA经由一"台顶式"PCR扩增所产 生的扩增子。第3行代表所述负控制。最后，减低引进苹果西打的微生物数量至2500(图31)，再次获得"台顶式"PCR 分析(第2-3行)和完全综合微液体装置分析(第4-5行)之间极优良的关系。第1行负 控制。如上述，基于所述微液体装置(亦包括台顶式系统)所使用的DNA萃取，纯化和扩 增方法的方式，下列图表代表装载入所述微液体装置内的微生物数量和实制上在所述PCR 间隔内已扩增的微生物数量。(假设一个从所述微液体装置纯化区域的100% DNA恢复) 以下表1阐明所述样本内和所述PCR间隔内装载的微生物数量表 1 引进大肠杆菌的苹果汁
在一相似的方式中，不同浓度的微生物被引进市面上买到的苹果汁。当10，000个 微生物被引进所述苹果汁(图33)，从一完全综合微液体装置运行(第4-5行)中获得的 结果与从所述相同微液体装置上分离出来的DNA以"台顶式"PCR分析的结果是不能区别 的。第1行代表负控制。当只有1000个微生物引进所述苹果汁(图34)时，再次显示出从所述完全综合微 液体装置(第4-5行)和从所述相同微液体装置上分离出来的DNA经台顶式PCR(第2_3 行)所得的扩增子结果是不能区别的。如上述，第1行代表负控制。最后，比较自两个不同 的微液体装置运行所得扩增子(图35)，所述完全综合的结果(每一个微液体装置的第3 行)与从所述相同微液体装置获得的DNA经"台顶式"PCR扩增所获得的扩增子结果是不 能区别的。如上描述，因为当通过所述微液体装置处理后的DNA被稀释，从分离/纯化和微生 物最初引进所述微液体装置后PCR扩增得到的扩增子代表不大于所述最初输入浓度的25 份之1。因此，当10，000个微生物引进时，从不大于400个微生物的DNA实制上是已扩增 的。同样地，当只有1000个微生物引进时，从最多40个微生物的DNA实制上是已扩增的。引进大肠杆菌的奶当1，000, 000个大肠杆菌引进牛奶中，并以如上述已建立的计划方案来测试，其 局面比苹果汁或苹果西打的更复杂。以脱脂奶来说，蛋白干扰测试是非常有限的，可以获得 预期的结果(图36)。然而，当全奶是以1 1容量比例与所述细胞裂解援冲剂测试时没有 DNA被分离出来，这可能表示所述全奶内的脂肪抑制所述分离程序。在这个别计划方案中，使用了为临床诊断贮藏和运输血液的目的而发展出来的 Whatman FTA过滤纸。Whatman FTA过滤纸最受人注目的特征是，在它之上有包括足够裂解 细胞和纯化的试剂。在这情况下，除了水，在所述微液体装置上没有贮藏其它试剂的需要。 然而，所述Whatman FTA过滤纸在处理时需要承受相当严厉的情况。测试台顶式和在所述 微液体装置上用FTA洗脱作用纯化从大肠杆菌中获得的DNA的结果在表2和图37中总结。 所有测试是用1百万个大肠杆菌装载进行的。表2 总结这个研究示范了所述微液体装置系统可以用于检测在食物基质如苹果汁，苹果西 打和奶内的大肠杆菌。这些结果清楚示范了所有预备和分析的功能可以在一单一的微液体 装置上进行。6. 8例子8 封闭核酸扩增反应器的压力减轻装置这个例子描述一个压力减轻装置，其可以与一个在微液体装置上核酸扩增区域内 的封闭核酸扩增反应器使用，如与一个PCR反应器。一个压力减轻(缓冲器)装置，可以安装在一密封的微液体装置内。所述压力减轻装置是与一个阀门相似，但备有一个管道穿过 其直径(见图38)流体可以正常地在所述隔膜上流过所述管道；当所述系统压力增加时， 所述流体会挤着所述气动地控制的缓冲器装置隔膜或视乎设计与系统压力打开至大气压 力；所述隔膜的偏向提供附加空间以减轻压力，与此同时保持所述封闭系统内的质量。所述压力减轻装置，可以防止密封的微型化反应器如微液体装置在热循环时因明 显的温度改变而受到破坏或渗漏。在一固定容量中，液体受热膨胀时的压力是极端的高。如 温度是由25°C增加至95°C，所述水的容量会增加4%。在一传统反应器设计中，所述压力可 以用反应器墙壁变形，压缩被困气体，进口 /出口管道扩充，渗漏等来释放。有所述缓冲器装置在所述系统内协调，当温度在所述反应器区域内增加，所述反 应器内的液体会膨胀而压力会增加，使所述缓冲器隔膜偏斜。结果，系统压力变会释放。当 温度在所述反应器减低时，液体会收缩，引致液体倒流而所述隔膜的偏斜会减少。此外，所 述压力缓冲器亦设计成可促进使用阀门来密封所述系统，否则将需要使用一高压力阀门。6. 9例子9 防止PCR反应器在温度提高的时候变形这例子描述一坚固的结构，其在某些实施例中，可以粘合在一核酸扩增反应器，如 一个PCR反应器的顶部，以防止所述反应器因温度提高的热效应而弯曲(见图39)。当使用 聚苯乙烯作为所述微液体装置物料时，所述反应器的顶部可以在温度提高，例如95°C，时抵 受"弯曲"变形。当冷却时，因为所述变形和/或液体渗漏损失，在所述间隔内的压力可以 是负数的，这样会引致底部薄膜弯曲和失去与加热器的等角接触。结果，这样会很难达到可 再生性和高质量的核酸扩增。由于使用一坚固结构在所述反应器之上，如此热膨胀会从所 述反应器的顶部引导离开至挤压在所述加热器上的膜。6. 10例子10 固定核酸探针供反向打点杂交之用的方法(RDB)这例子描述一种可以用于固定核酸探针以供反向打点杂交(RDB)检测的方法。预备一个Biodyne C膜如下。剪裁过滤纸至适合浸泡在一个IOcm培养皿的尺寸。 将所述膜以0. IN盐酸在所述培养皿内冲洗。所述膜浸泡在10% N-乙基-N' -(3-二甲氨 基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)在水的水溶液15分钟(使用前立刻制作好EDC)，使用大 约5ml的EDC并搅动。将所述膜用无菌水冲洗并风干过夜。产生20 μ M氨基终止探针溶液如下33.从一(0. 5Μ碳酸氢钠)原液，混合50 μ 1的200 μ M探针溶液34.进445 μ 1的0. 5Μ碳酸氢钠溶液35.然后在那里加入5 μ 1食用染料(yeIlow-For 1 ；red-Gb)至一 500 μ 1的总容
量36.把一支别针浸泡在上述已预备的溶液内，然后从所述别针将一滴所述溶液滴 在先前预备的Biodyne C膜上，方法是将所述别针接触所述Biodyne C膜1秒，然后重复两 次使用上述相同的计划方案但用不同的探针来预备另一溶液。当一排列的探针完成 后；5.将所述有有探针排列的Biodyne C膜在0. IN氢氧化钠内清洗。6.然后用无菌水清洗5秒作第二次清洗。7.然后以对流热干燥方法干燥35秒。
8.完全地风干9.在0. IN的氢氧化钠内清洗1分钟。10.在无菌水内清洗。11.完全风干本发明不应被解释为局限于这里所描述的实施例。事实上，除了这里描述的实施 方式之外，任何对本发明所作的不同的修改，对本发明所属领域的技术人员从前面的介绍 中不难理解。这些修改都是预期地落入本发明权利要求范围内。这里引用的所有文献都在此整体引入作参考，而所有目的在相同程度上就如每一 个别文献，专利或专利申请都是特别地和个别地在此整体引入作参考。任何文献的引证都是为了证明其公开是在申请日期之前，但不应该被认为是本发 明因为在先的发明，而承认本发明没有权利去宣告其发明是比这些文献居先的。
权利要求
一个分析目标样本的微液体装置，所述装置包括a)一个微液体装置体，其中所述微液体装置体包括i)一个样本预备区域，ii)一个核酸扩增区域，iii)一个核酸分析区域，和iv)多个液体通道互相连接在一个网络中，而其中每一个所述样本预备区域，所述核酸扩增区域和所述核酸分析区域是流动地以最少一个在所述网络的所述多个液体通道互相连接至最少一个所述其它的两个区域。
2.一个分析目标样本的微液体装置，所述装置包括 a) 一个微液体装置体，其中所述微液体装置体包括 i) 一个样本预备区域， ) 一个核酸扩增区域，和iii)多个液体通道互相连接在一个网络中，而其中每一个所述样本预备区域，所述核酸扩增区域和所述核酸分析区域是流动地以 最少一个在所述网络的所述多个液体通道互相连接至最少一个所述其它的两个区域。
3.权利要求1或2的微液体装置，其包括一个可以因应所述微液体装置体的一个预先 选择的区域的周围压力来施加一个正压力或负压力的差压源。
4.权利要求1或2的微液体装置，其包括一个可操作地连接至所述差压源和所述微液 体装置体的差压传送系统。
5.权利要求1或2的微液体装置，其包括最少一个放置在最少两个所述多个液体通道 内的隔膜，以供转换一从差压源来的压力至一所需的开或关位置。
6.权利要求1或2的微液体装置，其中所述样本预备区域包括 一个样本进口贮存器；一个样本预备试剂贮存器；和 样本纯化媒介；其中所述样本进口贮存器，所述样本预备试剂贮存器，和所述样本纯化媒介是流动地 互相连接的。
7.权利要求6的微液体装置，其包括一个样本纯化媒介贮存器，其中所述样本纯化媒 介是放置在所述样本纯化媒介贮存器内。
8.权利要求7的微液体装置，其中所述样本纯化媒介是放置在所述样本纯化媒介贮存 器的底部内。
9.权利要求6的微液体装置，其中所述样本纯化媒介是放置在所述多个流体通道的其 中一个中。
10.权利要求1或2的微液体装置，其中所述核酸扩增区域包括 一个核酸扩增反应器，一个核酸扩增试剂贮存器；和 一个核酸扩增结果贮存器；其中所述核酸扩增反应器，所述核酸扩增试剂贮存器，和所述核酸扩增结果贮存器是 流动地互相连接的。
11.权利要求2的微液体装置，其包括一个核酸扩增结果萃取区域。
12.权利要求10的微液体装置，其中所述核酸扩增结果萃取区域包括一个核酸萃取贮存器。
13.权利要求6的微液体装置，其中所述样本纯化媒介是一个无水硅酸膜。
14.权利要求1或2的微液体装置，其中所述目标样本是一流体物料，一气体物料，一 固体物料实质上溶于一液体物料，一乳状物料，一浆状物料，或一有粒子悬浮在内的流体物 料。
15.权利要求1或2的微液体装置，其中所述目标样本包括一生物学上的物料。
16.权利要求1或2的微液体装置，其中所述目标样本包括一有细胞悬浮在内的液体。
17.权利要求1或2的微液体装置，其中所述微液体装置体包括一多个弱溶液粘合聚苯 乙烯层。
18.权利要求1或2的微液体装置，其包括一个样本进口贮存器。
19.权利要求18的微液体装置，其中所述样本预备区域包括一个样本混合隔膜流动地 连接至所述样本进口贮存器。
20.权利要求1或2的微液体装置，其中所述微液体装置体包括一个风干所述样本纯化 媒介的手段。
21.权利要求1或2的微液体装置，其中所述样本预备区域包括一个废物贮存器。
22.权利要求1或2的微液体装置，其中所述样本预备区域包括一个洗脱试剂贮存器。
23.权利要求6的微液体装置，其中所述样本预备试剂包括磁性珠子。
24.权利要求6的微液体装置，其中所述样本预备试剂包括一裂解试剂。
25.权利要求1或2的微液体装置，其中所述核酸扩增反应器是一个热循环反应器。
26.权利要求25的微液体装置，其中所述热循环反应器的底部是一薄层的聚苯乙烯。
27.权利要求25的微液体装置，其中所述热循环反应器的底部在热循环时是被一加热 器加热，所述加热器并不是放置在所述微液体装置体之上或之内。
28.权利要求1或2的微液体装置，其中所述核酸扩增选择自以下群组包括聚合酶链 反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，cDNA末端快速扩增(RACE)，滚环扩增(rolling circle amplication)，核酸基础序列扩增(NASDA)，转录介导的扩增(TMA)，和连接酶链反 应。
29.权利要求1的微液体装置，其中所述核酸分析区域包括一个检测所述目标核酸和 所述目标核酸的一个探针之间的相互作用的区域。
30.一种检测一目标核酸的方法，所述方法的步骤包括 获得一个怀疑含有所述目标核酸的样本；提供权利要求1所述的微液体装置；将所述样本导入所述样本预备区域；预备所述样本供核酸扩增；将所述已预备的样本导入所述核酸扩增区域；在所述核酸扩增区域内进行一核酸扩增反应以扩增所述目标核酸；将所述已扩增的目标核酸导入所述核酸分析区域；和检测所述已扩增的目标核酸。
31.一种检测一目标核酸的方法，所述方法的步骤包括 获得怀疑含有所述目标核酸的样本；提供权利要求2所述的微液体装置；将所述样本导入所述样本预备区域；预备所述样本供核酸扩增；将所述已预备的样本导入所述核酸扩增区域；在所述核酸扩增区域内进行一核酸扩增反应以扩增所述目标核酸；和检测所述已扩增的目标核酸。
32.权利要求30或31的方法，其中所述目标核酸是与一目标疾病或失调有关联的。
33.权利要求30或31的方法，其中所述检测步骤包括检测所述目标核酸和所述目标 核酸的一个探针之间的相互作用。
34.权利要求30或31的方法，其中所述检测步骤包括观察颜色强度，荧光强度，电力 讯号强度或化学发光强度。
35.权利要求30或31的方法，其中所述检测步骤包括产生最少一个与在所述样本中 的目标分子对应的强度数值。
36.权利要求35的方法，其中所述强度数值是选自以下群组包括颜色强度数值，荧光 强度数值和化学发光强度数值，电流或电压。
37.权利要求36的方法，其中产生所述颜色强度数值包括 数码化一个与所述样本对应的影像以产生多个像素； 为所述多个像素各自提供一个数字的数值；和为所述颜色强度数值产生数字的数值。
38.权利要求36的方法，进一步包括计算一阀值和与所述阀值比较所述颜色强度数值 以检测所述目标分子。
39.权利要求38的方法，进一步包括在一个数据库中储存最少一个所述颜色强度数值 和所述阀值。
40.权利要求38的方法，其中所述阀值是使用最少一个负控制样本来计算的。
41.一种在一对象中判断其患有或倾向患有一种目标疾病或失调的方法，所述方法包括a)从所述对象中获得一个样本，其中所述样本是怀疑包含一个与所述目标疾病或失调 有关的核酸；和b)检测在所述样本中与所述目标疾病或失调有关的核酸，其中所述检测的步骤包括 提供权利要求1所述的微液体装置，将所述样本导入所述样本预备区域， 预备所述样本供核酸扩增， 将所述已预备的样本导入所述核酸扩增区域， 在所述核酸扩增区域内进行一核酸扩增反应， 扩增所述目标核酸，将所述已扩增的目标核酸导入所述核酸分析区域，和 检测所述已扩增的目标核酸；其中检测所述已扩增的目标核酸是与患有或倾向患有一种目标疾病或失调有关的。
42.一种在一对象中判断其患有或倾向患有一种目标疾病或失调的方法，所述方法包括a)从所述对象中获得一个样本，其中所述样本是怀疑包含一个与所述目标疾病或失调 有关的核酸；和b)检测在所述样本中与所述目标疾病或失调有关的核酸，其中所述检测的步骤包括 提供权利要求2所述的微液体装置，将所述样本导入所述样本预备区域，预备所述样本供核酸扩增，将所述已预备的样本导入所述核酸扩增区域，在所述核酸扩增区域内进行一核酸扩增反应以扩增所述目标核酸，和检测所述已扩增的目标核酸；其中检测所述已扩增的目标核酸是与患有或倾向患有一种目标疾病或失调有关的。
43.权利要求41或42的方法，其中所述检测步骤包括判断所述已扩增的目标核酸的一 个数量(或水平)，而其中所述方法进一步包括将所述目标核酸的数量(或水平)与一个预 先选定的数量(或水平)作比较。
44.权利要求43的方法，其中所述数量(或水平)与一个预先选定的数量(或水平) 之间的一个差别是表示患有或倾向患有一种目标疾病或失调。
全文摘要
本发明提供一个微液体装置以分析一个目标样本。所述微液体装置可包括一个微液体装置体，其中所述微液体装置体包括一个样本预备区域(101)，一个核酸扩增区域(102)，一个核酸分析区域(103)，和一个流体通道网络。每一个样本预备区域(101)，核酸扩增区域(102)和核酸分析区域(103)是流动地互相连接于最少一个所述其它的两个区域。使用所述微液体装置，样本的预备可以和一个生物学上有活性的分子的扩增结合，和一个合适的生物样本可以提供作分析/或检测一个目标分子。本发明提供的小型仪器和方法，比较起与使用大型器材来预备和分析生物样本是容易，快捷，便宜，和同样地有效的。
文档编号B01L3/00GK101903104SQ200880120488
公开日2010年12月1日 申请日期2008年10月10日 优先权日2007年10月12日
发明者B·W·托马斯, G·斯皮茨, L·C·扬, T·李, T·罗斯韦克, 周朋, 陈宗院 申请人:瑞奥尼克斯公司