用于生物反应的系统和方法
【专利摘要】提供了用于进行生物反应的系统。该系统包括芯片，其包含基底和多个反应位点。所述多个反应位点中的每个反应位点经配置用于容纳最多1钠升的液体样品。此外，该系统包括控制系统，其经配置用于启动液体样品中的生物反应。该系统还包括检测系统，其经配置用于检测芯片上的生物反应。根据不同的实施方案，所述芯片包含至少20000个反应位点。在其他实施方案中，所述芯片包含至少30000个反应位点。
【专利说明】用于生物反应的系统和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求如下申请的优先权权益:2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612，005号、2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612，087号、2012年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723,759号、2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612，008号、2012年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723，658号、2012年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723，738号、2012年6月13日递交的美国临时专利申请第61/659,029号、2012年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723，710号和2013年3月7日递交的美国临时申请第61/774,499号，所有这些均通过引用整体并入本文。
[0003]发明背景
[0004]用于生物和生化反应的系统被用于实时监测、测量和/或分析此类反应。此类系统通常被用于测序、基因分型、聚合酶链式反应(PCR)和其他生化反应来监测进程和提供定量数据。
[0005]聚合酶链式反应(PCR)是一种扩增靶标DNA序列的方法。以前，通常在96孔或384孔微板中进行PCR。如果需要更高的通量，微板中的常规PCR方法则不具成本效益或效用性。另一方面，减少PCR反应体积能降低试剂消耗，并可从热质量减少的反应体积来减少扩增的时间。该策略可以阵列形式(m X η)实施，产生大量较小的反应体积。此外，使用阵列允许可扩展的高通量分析，并具有增加的定量灵敏度、动态范围和特异性。
[0006]阵列形式也被用于进行数字聚合酶链式反应(dPCR)。来自dPCR的结果可用于检测和定量稀有等位基因的浓度，以提供核酸样品的绝对定量并测量核酸浓度的低倍数变化。通常，增加复制数目能增加dPCR结果的精确性和可重复性。
[0007]大多数定量聚合酶链式反应(qPCR)平台中的阵列形式被设计为用于基于样品的分析(sample-by-assay)实验,其中PCR结果需要为可寻址的以用于运行后分析。然而,对于dPCR，每个PCR结果的具体位置或小井(well)可能是不重要的，并且仅可分析每个样品的阳性和阴性复制数。
[0008]在dPCR中，可将包含相对较少数目的靶标多核苷酸或核苷酸序列的溶液再分为大量的小份测试样品，使得每个样品通常包含一个分子的靶标核苷酸序列或没有靶标核苷酸序列。当随后在PCR方案、程序或实验中对样品进行热循环反应时，包含靶标核苷酸序列的样品得到扩增并产生阳性检测信号，而不含靶标核苷酸序列的样品则未被扩增且不产生检测信号。
[0009]因此，对提供每个测试或实验的更大数目的反应的需求增加已使得产生了能够同时进行更高数目的反应的仪器。
[0010]测试或实验中样品位点数目的增加已使得产生了提供更小样品体积的微量滴定板和其他样品形式。另外，诸如数字PCR(dPCR)的技术增加了对在所有或大多数的大量测试样品中不含有或含有一个靶标核苷酸序列的更小样品体积的需求。存在对能提供高密度样品形式中的可靠数据的系统和样品形式的需求。
[0011]发明概述
[0012]提供了用于进行生物反应的系统。该系统包括芯片，其包含基底和多个反应位点。所述多个反应位点中的每个反应位点被配置为容纳最多I钠升的液体样品。此外，该系统包含控制系统，其被配置为能在液体样品中启动生物反应。该系统还包含检测系统，其被配置为能监测芯片上的生物反应。根据不同的实施方案，该芯片包含至少20000个反应位点。在其他实施方案中，该芯片包含至少30000个反应位点。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1所示为根据本文描述的各种实施方案，包含多个反应位点的芯片；
[0014]图2所示为根据本文描述的各种实施方案，图1的示例性芯片的侧视图；
[0015]图3所示为根据本文描述的各种实施方案，进行生物反应的示例性方法；
[0016]图4所示为根据本文描述的各种实施方案，进行生物反应的示例性方法；
[0017]图5的方块图说明了可基于其实施本教导的实施方案的聚合酶链式反应(PCR)仪；
[0018]图6所示为根据本教导的实施方案，可用于成像的芯片的示例性光学系统；
[0019]图7所示为根据本文描述的各种实施方案，基底中的阵列的剖视图；
[0020]图8所示为根据本文描述的各种实施方案，芯片的横截面视图；
[0021]图9所示为根据本文描述的不同实施方案的疏水表面和通孔；
[0022]图10所示为根据本文描述的不同实施方案的不同间距(pitch distance)；
[0023]图11所示为根据本文描述的实施方案的通孔的示例性阵列；
[0024]图12所示为根据本文描述的各种实施方案的通孔的六边形形状；
[0025]图13所示为根据不同实施方案，包含具有示例性形状的多个通孔的基底的横截面；
[0026]图14所示为根据本文描述的各种实施方案，制造芯片的示例性方法；
[0027]图15所示为根据本文描述的各种实施方案的芯片的示例性横截面；
[0028]图16所示为根据本文描述的各种实施方案的示例性芯片；
[0029]图17所示为根据本文描述的各种实施方案，加载芯片中的多个反应位点的示例性方法的流程图；
[0030]图20所示为根据本文描述的各种实施方案的样品加载器；
[0031]图19A所示为根据本教导的各种实施方案的样品加载器的侧视图；
[0032]图19B所示为根据本教导的各种实施方案的样品加载器的放大侧视图；
[0033]图20所示为根据本教导的各种实施方案的加载装置；
[0034]图21所示为根据本教导的各种实施方案的后退和前进接触角。
[0035]图22所示为根据本教导的各种实施方案，通过样品加载器加载反应位点；
[0036]图23所示为根据本教导的实施方案的载体的透视图；
[0037]图24所示为根据本教导的各种实施方案的载体的透视图；
[0038]图25所示为根据本教导的不同实施方案的芯片和相关盒子(case)或固定器；
[0039]图26的方块图说明了可基于其实施本教导的实施方案的计算机系统。
[0040]图27所示为根据本文描述的不同实施方案，加载的样品的生物反应结果。
[0041]发明详述
[0042]为提供对本发明的更完整的理解，以下描述阐述了众多具体细节，如具体配置、参数、实例等。然而应当理解，此类描述并非旨在限制本发明的范围，而是旨在提供对示例性实施方案进行更好的描述。
[0043]在各种实施方案中，本文描述的装置、仪器、系统和方法可用于检测原始样品或溶液中含有的一类或多类生物组分或靶标。这些生物组分或靶标可为任何合适的生物靶标，包括但不限于，DNA序列(包括无细胞的DNA)、RNA序列、基因、寡核苷酸、分子、蛋白、生物标记物、细胞(例如，循环的肿瘤细胞)或任何其他合适的靶标生物分子。在各种实施方案中，此类生物组分可在诸如胎儿诊断、多重dPCR、病毒检测、定量标准、基因分型、测序分析、实验或方案、测序验证、突变检测、基因改良生物体的检测、稀有等位基因检测和/或拷贝数变异的应用中，结合一种或多种PCR方法和系统使用。
[0044]在各种实施方案中，此类生物组分可在诸如胎儿诊断、多重dPCR、病毒检测和定量标准、基因分型、测序验证、突变检测、基因改良生物体的检测、稀有等位基因检测和拷贝数变异的应用中，结合各种PCR、qPCR和/或dPCR方法和系统使用。本公开的实施方案通常涉及用于监测或测量大量小体积样品的生物反应的装置、仪器、系统和方法。如本文所用，样品可被称为例如样品体积或反应体积。
[0045]尽管处理大量样品时通常应用定量聚合酶链式反应(qPCR)，应当理解，根据本文描述的不同实施方案可采用任何合适的PCR方法。合适的PCR方法包括但不限于，例如数字PCR、等位基因特异性PCR、不对称PCR、连接介导的PCR、多重PCR、巢式PCR、Cast PCR、qPCR、基因组步移和桥式PCR。
[0046]如以下所述，根据本文描述的不同实施方案，反应位点可包括但不限于，例如通孔、小井、凹陷、斑点、腔、样品保留区和反应室。
[0047]此外，如本文所用，热循环可包括，例如使用热循环仪、恒温扩增技术、热转换、红外介导的热循环或依赖解链酶的扩增。在一些实施方案中，可将芯片与内置的加热元件整合。在各种实施方案中，可将芯片与半导体整合。
[0048]根据不同的实施方案，靶标检测可为但不限于，例如单独或组合的荧光检测、阳离子或阴离子检测、pH检测、电压检测或电流检测。
[0049]本文描述的各种实施方案特别适用于数字PCR (dPCR)。在数字PCR中，可将含有相对较少数目的靶标多核苷酸或核苷酸序列的溶液再分为大量小测试样品，使得每个样品通常含有一个分子的靶标核苷酸序列或没有靶标核苷酸序列。当随后在PCR方案、程序或实验中对样品进行热循环时，含有靶标核苷酸序列的样品得到扩增并产生阳性检测信号，而不含靶标核苷酸序列的样品则不被扩增且不产生检测信号。使用泊松统计分析法，可将原始溶液中靶标核苷酸序列的数目与产生阳性检测信号的样品数相关联。
[0050]在一些实施方案中，可将所检测的信号用于确定单个样品或体积中包含的靶标分子的数目或数目范围。例如，可将检测系统配置为用于区分含有一个靶标分子的样品和含有两个或至少两个靶标分子的样品。另外或可选地，可将检测系统配置为用于区分含有等于或低于预定量的多个靶标分子的样品和含有多于预定量的样品。在某些实施方案中，使用单个装置、仪器或系统实施qPCR和dPCR过程、分析或方案。
[0051]根据本文描述的实施方案的芯片上的示例性dPCR结果显示在图27中。
[0052]在某些实施方案中，dPCR方案、分析、过程或实验包括将原始样品或溶液分配或分开到至少I万个反应位点、至少10万个反应位点、至少100万个反应位点或至少1000万个反应位点。每个反应位点可具有几个钠升、约I钠升的体积，或少于或等于I钠升(例如，少于或等于100皮升，少于或等于10皮升，和/或少于或等于I皮升)的体积。当原始样品或溶液中含有的靶标核苷酸序列的数目非常少时(例如，少于1000个靶标分子、少于100个靶标、少于10个靶标分子或仅I个或2个靶标分子)，在某些情况下将原始溶液的全部物质或近乎全部物质包含于或接收于接受处理样品的体积或反应位点也是重要的。例如，当原始溶液中仅存在少数靶标核苷酸时，这些靶标核苷酸中的一些或所有可能会潜在地包含于不处在任何反应位点的小残留液体体积中，因而不会被检测、测量或计数。因此，原始溶液的高效转移可有助于减少稀有等位基因或靶标核苷酸的计数误算或根本不能检测到等位基因或靶标核苷酸的存在(如果没有靶标分子被成功放置于一个指定反应位点)的几率或可能性。因此，本发明的实施方案可用于提供高加载效率，其中加载效率定义为反应位点接收的原始样品或溶液的体积或质量除以原始样品或溶液的总体积或质量。
[0053]本文所述的实施方案通过以针对所有的或实质上所有的样品溶液的方式将原始样品溶液分配至多个反应位点，解决了这些和其他的dPCR设计限制。
[0054]在各种实施方案中，本文描述的装置、仪器、系统和方法可用于检测一类或多类目标生物组分。这些目标生物组分可包括但不限于，DNA序列、RNA序列、基因、寡核苷酸或细胞(例如，循环的肿瘤细胞)。在不同的实施方案中，此类生物组分可在诸如胎儿诊断、多重dPCR、病毒检测和定量标准、基因分型、测序验证、突变检测、基因改良生物体的检测、稀有等位基因的检测和拷贝数变异的应用中与各种PCR、qPCR和/或dPCR方法和系统联合使用。
[0055]参照图1-2和8，在本发明的某些实施方案中，物件、芯片、装置、基底、滑板或板100包括基底102，其含有多个位于基底102中的通孔、反应区或反应位点104。在某些实施方案中，芯片100可包含物件。另外或可选地，芯片100可包含微流体装置，例如其可进一步包含用于将试剂和/或测试溶液转移至反应位点104的多个通道或通路。在其他实施方案中，反应位点104包含多个小滴(droplet)或珠子，并且芯片100可包含一个或多个室和/或通道，其容纳一些或所有的小滴或珠子104。在此类实施方案中，小滴或珠子104可形成乳剂，其中一些或所有的小滴或珠子104均含有至少I个多核苷酸或核苷酸序列的一个或多个靶标。当反应位点104为珠子时，所述珠子可任选地包含附着的光学信号或标记。例如可使用根据本发明的实施方案的成像系统，每次一个或在包含一个或多个小滴或珠子104的组中检测、监测或测量小滴或珠子104。
[0056]在所不实施方案中，芯片100包括第一表面110和相对的第二表面112。在所不实施方案中，每个反应位点104从第一表面110中的开口 114延伸至第二表面112中的开口116。虽然图8中显示的所示实施方案显示了包含通孔104的基底，基底102可另外或可选地包含其他类型的反应位点。例如，反应位点104可包含位于基底102中形成的小井或凹陷中的反应体积、分布于表面110或112上的溶液斑点或其他类型的反应室或形式，如位于微流体系统的测试位点或体积中的或者位于小的珠子或球体内的或其上的样品或溶液。
[0057]可将反应位点104配置为通过毛细管作用提供足够的表面张力，以吸入各自量的包含目标生物组分的液体或样品。芯片100可具有美国专利第6，306，578、7，332，271、7，604，983,7, 6825，65,6, 387，331或6，893，877号中任一个所公开的通用形式或构造，这些专利通过引用整体并入本文，如同在本文中被完整阐述。基底102可为平板或包含适于特定应用、分析或实验的任何形式。基底102可包含制造领域中已知的各种材料中的任何一种，包括但不限于金属、玻璃、陶瓷、硅等。另外或可选地，基底102可包含聚合物材料如丙烯酸、苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯材料。基底102和反应位点104可通过机械加工、注射制模、热模压、激光钻孔、光蚀刻等中的一种或多种方法形成。
[0058]在某些实施方案中，表面110、112可包含疏水材料，例如，如美国专利申请公布第2006/0057209或2006/0105453号中所述的，其通过引用整体并入本文，如同在本文中被完整阐述。在此类实施方案中，反应位点104可包含吸引水或其他液体溶液的亲水材料。此类亲水区域的阵列可包含位于疏水表面上的亲水岛状凸起(island)，且可使用包括但不限于沉积法、等离子体、掩蔽法、转印法、丝网印刷、合模法(spotting)等的各种微加工技术中的任何一种在基底102上或在其内形成。
[0059]已发现可配置高的反应位点密度来减少加载过程中表面110、112上残留的溶液的量，从而引起初始溶液更高的加载效率或转移。例如，通过减小相邻小井间的间隔值与小井直径值的比率，板表面上残留溶液的量可被明显减少，使得所有的或近乎所有的包含目标生物组分的起始溶液或样品位于反应位点104内部。以这种方式,丢失稀有等位基因或其他靶标分子的可能性得到降低，因为一个或多个靶标分子不大可能会留在基底表面上，而是被接收于所指定的反应位点104中的一个中。
[0060]在图7中，每个反应位点104从第一表面110中的开口 114延伸至第二表面112中的开口 116。图7的该实例中所示的反应位点104为通孔。反应位点104被配置为通过毛细管作用来提供表面张力，以容纳各自的包含待处理或检测的生物样品的液体样品。芯片100可具有美国专利第 6，306，578,7, 332，271,7, 604，983,7, 682，565,6, 387，331 或 6，893，877号中的任何一个所公开的通用形式或构造，这些专利通过引用整体并入本文，如同在本文中被完整阐述。
[0061]基底102可为平板或包含适于具体应用或设计的任何形式。基底可包含整体的或部分的制造领域已知的各种材料中任何一种，包括但不限于金属、玻璃、陶瓷、硅材料等。另外或可选地，基底102可包含聚合物材料如丙烯酸、苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯材料。基底102和反应位点104可通过机械加工、注射制模、热模压、激光钻孔、光蚀刻等中的一种或多种方法形成。
[0062]在某些实施方案中，表面110、112可包含疏水材料，例如，美国专利申请公开第2006/0057209或2006/0105453号中描述的，其通过引用整体并入本文，如同在本文中被完整阐述。在此类实施方案中，反应位点104包含吸引水或其他液体溶液的亲水材料。此类亲水区域的阵列可包含位于疏水表面上的亲水性岛状凸起，且可使用包括但不限于沉积法、等离子体、掩蔽法、转印法、丝网印刷、合模法(spotting)等的大量微加工技术中在基底102上形成。用于芯片100的涂层实施方案的包被方法还描述于2012年11月7日递交的美国临时申请第61/723，738号中，为所有目的将其并入本文中。
[0063]图3描述了使用根据本公开的各种实施方案的系统的流程图。图4显示了根据各种实施方案的示例性流程图的流程图。根据本文描述的各种实施方案，在系统上进行生物反应的流程很简单，且不需要大量的用户执行的步骤。参照图1和4，在步骤402中，多个反应位点104的阵列120加载有液体样品。在一些实施方案中，用户使用样品加载器来加载反应位点104。通过样品加载器加载在下文有更详细的描述。在一些实施方案中，用于芯片的盒子可有助于液体样品的加载。根据本教导加载样品在下文有更详细的描述。接着，在步骤404中，将盒子密封，芯片位于其内部。在步骤406中，可将芯片加载至进行生物反应过程的仪器中。然后在步骤408中，通过光学系统(如图6中所示的光学系统)检测生物反应的结果。如上文提及的，对于dPCR应用，确定阵列120中存在多少个阴性相对阳性反应，以确定量。
[0064]如上文提及的，可使用的根据各种实施方案的仪器为，但不限于聚合酶链式反应(PCR)仪。图5是显示PCR仪500的方块图，可根据该仪器实施本教导的实施方案。PCR仪500可包含加热盖510，其置于包含于样品支承装置(未显示)中的多个样品512上。在各种实施方案中，样品支承装置可为具有多个反应位点的芯片或玻璃或塑料滑板，所述反应位点具有位于反应位点和加热盖510之间的盖。样品支承装置的一些实例可包括但不限于，根据本教导的实施方案的芯片、多孔板如标准微量滴定96孔、384孔板，或微卡，或基本上平的支承物如玻璃或塑料滑板。各种实施方案中的反应位点可包括基底表面上形成的规则的或不规则的阵列形式的下陷、凹陷、脊及其组合。
[0065]PCR仪的不同实施方案包括样品区块514、加热和冷却兀件516、热交换器518、控制系统520和用户界面522。根据本教导的热块组件的各种实施方案包括图5所示PCR仪500 的元件 514-518。
[0066]根据本教导的其他实施方案，热块组件包括热电装置，使得在整个热块组件中提供基本一致的热传递。该配置的实施方案在美国专利申请12/874，112中有进一步的描述，其通过引用整体并入本文，如同在本文中被完整阐述。
[0067]在经配置用于某些样品支承的仪器中，可提供适配器使得PCR仪1000可使用根据各种实施方案的芯片100。适配器被配置为允许在芯片100中有效地将热传递至样品。
[0068]在其他实施方案中，芯片可包括整合的加热元件。
[0069]对于图5中PCR仪500的实施方案，控制系统520可用于控制检测系统、加热盖和热块组件的运行。控制系统520可通过图5中的PCR仪500的用户界面522成为终端用户可接近的。同样，图26中所示的计算系统2600可用于提供对图5中的PCR仪500以及用户界面功能的控制。另外，图26的计算系统300可提供数据处理、显示和报告制作功能。所有此类仪器控制功能均可局部地专用于PCR仪，或者图26的计算机系统2600可提供控制、分析和报告功能中的部分或所有的远程控制，其在随后有更详细的论述。可在仪器上提供可通过图形用户界面(GUI)获取的仪器控制功能。此外，在各种实施方案中，可在仪器上提供可通过GUI获取的数据分析控制。在各种实施方案中，可在与仪器相连的局部计算机系统上进行系统结果的数据分析。在其他实施方案中，可由用户在网络上获取数据分析功能。来自根据各种实施方案的系统进行生物反应的数据可存储于服务器系统以可被用户在网络上获取。
[0070]如上文所提及，靶标的检测可包括例如荧光检测、阳离子或阴离子的检测、pH检测、电压检测或电流检测。同样地，根据本文描述的不同实施方案的检测系统可包括例如光学系统、电检测系统、离子检测系统或PH检测系统。根据不同的实施方案，检测系统可整合在芯片中。
[0071]参照图6，如上文所提及，系统600可用于光学观察、检查、探测或测量芯片100的反应位点中包含的一个或多个靶标，其可包含在载体如参照图23的载体2150a中。系统600包含光学头或系统602。系统600还可包含控制器、计算机或处理器604，其配置为例如操作光学系统602的各个元件或获得和/或处理系统600提供的数据。例如，处理器604可用于获取和/或处理光学系统602的一个或多个光电探测器提供的光学数据。在其他实施方案中，处理器604可将数据传输到一个或多个计算系统以用于进一步处理。在一些实施方案中，可通过网络从处理器604传输数据至计算系统。
[0072]在某些实施方案中，系统600还包括热控制系统606，其包含例如被配置为针对芯片100中包含的至少一些样品实施PCR程序或方案的热循环仪。系统602、606可一起组合或结合至单个单元中，例如，以便针对芯片100中包含的至少一些样品实施qPCR和/或dPCR程序或方案。在此类实施方案中，计算机604可用于控制系统602、606和/或采集或处理系统602、606中的一个或二者提供或获得的数据。在其他实施方案中，系统602和系统606可为独立单元。
[0073]在某些实施方案中，光学系统602包含光源610和相关的激发光学系统612,其配置为用于照射芯片100的反应位点中包含的至少一些样品。激发光学系统612可包含一个或多个透镜614和/或一个或多个滤镜616以调节指向样品的光。光学系统602还可包含光检测器620和相关的发射光学系统622，其配置为用于接受芯片100的反应位点中包含的至少一些样品发出的光学数据。例如，当系统600配置为进行qPCR和/或dPCR程序时，样品可包含荧光染料，其提供根据芯片100的各个通孔中包含的靶标核苷酸序列的量而变化的突光信号。发射光学系统622可包含一个或多个镜头624和/或一个或多个滤镜626,用于调节指向样品的光。
[0074]根据不同的实施方案，光学系统602可具有15mm的焦距和60mm的工作距离,其中工作距离为芯片至相机镜头的距离。此外，在各种实施方案中，整个系统的焦距比数小于或等于3。
[0075]在图6所不的实施方案中,激发/发射光学系统612、622均包含一个或多个常见光学元件。例如，激发/发射光学系统612、622均包含分束器630，其反射激发光并将发射光从样品传递至光探测器620。在某些实施方案中，激发/发射光学系统612、622均包含物镜(未显示)，其置于分束器630和芯片100之间，可用于改善光学性能，例如，提供更均匀的照射到和来自芯片100中包含的样品的光的读数。在某些实施方案中，例如在均匀的照射较不重要时(例如，一些dPCR应用)，可省略掉常见的物镜，如图6所示的实施方案中所述。物镜的省略可有助于减少光学系统602的大小和复杂性。
[0076]有利地，参照图1，活性区域120中的所有反应位点104均可被同时成像，并可通过如图6所示的光学系统进行分析。在图1所示的实施方案中，活性区域120包含超过12，000个反应位点104。在其他实施方案中，活性区域120包含至少25，000个反应位点104、至少30，000个反应位点104、至少100，000个反应位点104，或至少1，000, 000个反应位点104。
[0077]图7显示了根据不同的实施方案所示的通孔104的阵列的横截面视图。图8所示为芯片100的另一横截面视图。芯片100具有第一表面110和第二表面112。每个反应位点104从第一表面110中的开口延伸至第二表面112中的开口。反应位点104被配置为通过毛细管作用提供足够的表面张力，来容纳各自的包含待处理或待检测的生物样品的液体样品。在图8的实例中，反应位点为通孔。
[0078]在所示的实施方案中，芯片100具有的第一表面110与第二表面112之间的厚度为300微米，使得每个反应位点104具有约1.3钠升的容积。可选地，每个反应位点的容积可小于1.3钠升。例如，这可通过减小反应位点104的直径和/或基底102的厚度来实现。例如，每个反应位点104可具有小于或等于I钠升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升或小于或等于10皮升的容积。在其他实施方案中，一些或所有反应位点104的容积为1-20钠升。
[0079]在一些实施方案中，所述反应位点为通孔。在这些实施方案中，每个通孔具有约
1.3钠升的容积。可选地，每个通孔的容积可小于1.3钠升。例如，这可通过减小通孔直径和/或基底102的厚度来实现。例如，每个通孔可具有小于或等于I钠升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升或小于或等于10皮升的容积。在其他实施方案中，一些或所有反应位点104的容积为1-20钠升。
[0080]在各种实施方案中，反应位点104的密度可为每平方毫米至少100个反应位点。在其他实施方案中，可为更高的反应位点密度。例如，芯片100中反应位点104的密度可大于或等于每平方毫米150个反应位点、大于或等于每平方毫米200个反应位点、大于或等于每平方毫米500个反应位点、大于或等于每平方毫米1，000个反应位点、大于或等于每平方毫米10，000个反应位点。
[0081]在一些实施方案中，所述反应位点为通孔。因此，芯片100中的通孔密度可大于或等于每平方毫米150个通孔、每平方毫米大于或等于200个通孔、每平方毫米大于或等于500个通孔、每平方毫米大于或等于1，000个通孔、每平方毫米大于或等于10，000个通孔。
[0082]芯片100的其他实施方案在2012年3月16日递交的临时申请61/612，087 (案卷号LT00655PR0)和2012年11月7日递交的61/723，759 (案卷号LT00655PR02)中有进一步的描述，为所有目的将其并入本文中。
[0083]在某些实施方案中，增加的反应位点密度增加了每单位面积的反应位点总数，以及有利地，增加了给定尺寸的基底中可含有的样品总数。另外，芯片100被配置为减少加载过程中表面110、112上残留的溶解的量，使得所有的或几乎所有的溶液被包含在反应位点104 中。
[0084]参照图9，以包含多个亲水反应位点的疏水表面的计算机模型证明了加载效率的增加。该模型被用于分析样品在所述多个反应位点中的分配，其为具有75微米直径的通孔的反应位点间距(或密度)的函数。图10证明当反应位点间的间隔减小(密度增加)时，反应位点捕获较大百分比的初始液体样品，且在加载过程后更少量的残留液体遗留在疏水表面上。因此，更高密度的给定横截面尺寸的反应位点104提供了给定大小基底102中的测试样品数的增加，并减少或消除了表面110、112上留有的残留液(其可含有稀有等位基因或其他靶标分子)。
[0085]所述结果的一个试样显示在图10中，证明当反应位点间的间隔减小时，通孔捕获更大百分比的液体样品，并且在该模式化加载过程后更少量的残留液体留在疏水表面上。因此，更高密度的给定横截面尺寸的反应位点104通常提供了给定大小基底102中可处理的样品数的增加和表面110、112上留下不需要的残留液体的减少。
[0086]在某些实施方案中，当反应位点104通过光学系统成像时，例如由于光学限制，相邻反应位点间的间隔可能存在下限。例如，由于光学系统对相邻反应位点清晰成像的能力的限制，相邻反应位点间的间隔可能存在下限。为了增加基底102中反应位点104的密度，可使用密排六方矩阵模式，例如，如图11和12中所示。
[0087]已发现具有非圆截面的反应位点可有利地减小相邻反应位点104之间的平均距离或间隔，使得在加载测试溶液或样品后表面110、112上留下的残留液体或溶液的量减少。参照图11和12，具有顶点至顶点直径D的六边形反应位点104的阵列以六边形模式布置，其中相邻反应位点之间的间隔或间距为P。在某些实施方案中，用于测量来自反应位点104的荧光信号的光学系统中，相邻反应位点间的串扰(cross-talk)是相邻反应位点间最小边距S的函数。因此，图12中所示的几何学代表了可使用的且仍然将相邻反应位点间的串扰保持在或低于预定值的反应位点间最小间距P。图12中还显示了每个六边形内部的虚线圆。这代表了与六边形反应位点具有相同的间距P值和相同的边缘间隔S值的圆形反应位点的直径D’。图12中的灰色部分显示了圆形和六边形反应位点某个宽度W上的相邻反应位点间的区域。如图12中可清楚见到的，当间距P和边缘距离S相同时，相比六边形反应位点，在宽度W上圆形反应位点之间的相邻反应位点间的区域更大。相邻反应位点之间更小的面积产生更高的加载效率。因此，基于图12中所示的结果，在相同的间隔条件(P和S)下，六边形形状的反应位点提供了比圆形反应位点更高的加载效率。
[0088]该结果还为配置用于检查反应位点的光学系统提供了意料不到的优势。因为图12中的圆形和六边形反应位点的最小边缘间隔S相同，对于每种类型的反应位点，相邻反应位点间的串扰是相同或相似的。然而，对于相同的间距P和边缘间隔S，六边形反应位点的横截面积比圆形反应位点的横截面积大。因而，六边形反应位点比圆形反应位点具有更大的光学系统产生的图像。因此，六边形反应位点产生的更大图像可能跨越更大数目的像素。每个反应位点的更大数目的像素有助于对反应位点产生的信号进行更精确的计算。因而，除了提供较高的加载效率，如图11和12中所示的六边形反应位点的使用，还可产生对每个反应位点104产生的光学信号或输出更精确的测量或计算(例如，对产生的与靶标或染料分子的量成比例的荧光信号的测量或计算)。
[0089]在图1中所示的实施方案中，芯片100具有方形形状和15毫米X 15毫米的总尺寸。芯片100还具有活性区域(active area/reg1n/zone) 120,其具有13毫米X 13毫米的尺寸。如本文所用，术语“活性区域(active area/reg1n/zone) ”是指芯片如芯片100的表面区域，反应位点或溶液体积包含在或分布于其上。在某些实施方案中，芯片100的活性区域可增加至14毫米X 14毫米或更大，例如15毫米X 15毫米基底尺寸，以增加基底102上包含的反应位点的总数。芯片100可具有其他的形状和直径。例如，表面110、112可为矩形的、三角形的、圆形的或一些其他的几何形状。芯片100和活性区域120的总尺寸可小于或大于图1中所示实施方案的总尺寸，这取决于给定系统、分析或实验的具体设计参数。
[0090]在图1所示的实施方案中，反应位点104可具有75微米的特征性直径，且分布于活性区域120上，其相邻反应位点间的间距为125微米。在其他实施方案中，反应位点104具有小于或等于75微米的特征性直径，例如，小于或等于60微米，或者小于或等于50微米的特征性直径。在其他实施方案中，反应位点104具有的特征性直径小于或等于20微米、小于或等于10微米、小于或等于I微米或小于或等于100纳米。反应位点间的间距可小于125微米，例如小于或等于100微米、小于或等于30微米、小于或等于10微米或小于或等于I微米。
[0091]在某些实施方案中，基底102具有的表面110与表面112之间的厚度等于或为约300微米，使得每个反应位点104具有约1.3钠升的容积。可选地，例如，通过减小反应位点104的直径和/或基底102的厚度，每个反应位点104的容积可小于1.3钠升。例如，每个反应位点104可具有小于或等于I钠升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升，或者小于或等于10皮升的容积。在其他实施方案中，一些或所有的反应位点104的容积为1-20钠升。
[0092]在某些实施方案中，表面110、112上反应位点104的密度为每平方毫米至少100个反应位点。还可以预期更高的密度。例如，表面110、112上反应位点104的密度可大于或等于每平方毫米150个反应位点、大于或等于每平方毫米200个反应位点、大于或等于每平方毫米500个反应位点、大于或等于每平方毫米1，000个反应位点、大于或等于每平方毫米10，000个反应位点,或大于或等于每平方毫米1，000，000个反应位点。
[0093]有利地，活性区域120中所有反应位点104均可通过光学系统同时成像和分析。在某些实施方案中，通过光学系统成像和分析的活性区域120包含至少12，000个反应位点104。在其他实施方案中，通过光学系统成像和分析的活性区域120包含至少25，000个、至少30，000个、至少100，000个、至少1，000, 000个反应位点，或至少10，000, 000个反应位点。
[0094]在某些实施方案中，反应位点104包括具有第一特征性直径、厚度和/或容积特征的第一组多个反应位点，以及具有不同于相应第一特征性直径、厚度和/或容积的第二特征性直径、厚度和/或容积特征的第二组多个反应位点。反应位点大小或尺寸的此类变化可用于，例如同时分析两个或更多个不同的核苷酸序列，它们可具有不同的浓度。另外或可选地，单个基底102上反应位点104大小的变化可用于增加dPCR过程、分析或实验的动态范围。例如，芯片100可包含反应位点104的两个或更多个亚阵列，其中每个组特征为具有与其他或剩余组的反应位点104的直径或厚度不同的直径或厚度。可调整每个组的大小来提供靶标多核苷酸计数的不同动态范围。亚阵列可位于基底102的不同部分上或可散布于其上，使得两个或更多个亚阵列延伸于芯片100的整个活性区域或芯片100的活性区域的共同部分上。
[0095]在某些实施方案中，至少一些反应位点104在它们的壁的所有或一部分上为锥形的。例如，参照图13，至少一些反应位点104可在表面110上包含凹槽130。另外或可选地，至少一些反应位点104可在表面112上包含凹槽130 (未显示)。已发现，使用凹槽式的和/或锥形反应位点可减少相邻反应位点104之间的平均距离或总面积，而不超过对溶液位点或测试样品之间最小距离的光学限制。如上文有关图10的描述所述，相邻反应位点104之间面积的减小可使得加载过程中表面110、112残留的液体溶液的量减少。因此，可获得更高的样品加载效率，同时仍然保持光学系统的相邻溶液位点或测试样品之间的较大有效间隔。
[0096]在某些实施方案中，基底102包含光结构(photostructurable)材料，如某些玻璃或陶瓷材料。在此类实施方案中，图14中所示方法140可用于制造基底102。有利地，图11中所示方法140的最后可选的元件可用于提供不透明的或近乎不透明的基底102，使得从一个反应位点104发出的光不进入邻近的反应位点104。
[0097]方法140可用于提供基底102，其具有的不透明度足以阻止照进一个反应位点104的任何或近乎任何光传送至邻近的反应位点104。方法140可进一步包括从基底102去除足以减少表面110、112之间厚度的量的材料，例如，从基底104去除的材料量，足以使表面110、112之间的厚度相比起始厚度减少至少20 %，或相比起始厚度减少至少30 %或40 %。方法140还可包括在制造期间加热基底102到至少500°C的温度。在某些实施方案中，方法140中使用的图案掩膜包含具有铬层图案的石英板。掩膜可在将至少部分的基底暴露于腐蚀剂前去除。方法140中使用的腐蚀材料可为氢氟酸。
[0098]参照图15和16，在某些实施方案中，芯片100被封装在盒子150中，其包含含有底面154的第一封盖152和含有上表面158的第二封盖156。盒子150还可包含一个或多个侧壁159，其配置为可保持封盖152、154之间的间隔。封盖152、154和壁159 —起形成腔160，其大小可容纳芯片100。在使用期间，芯片100置于表面154、158之间形成的腔160中。腔160的厚度可大于芯片100的厚度，使得芯片100与底面154之间和/或芯片100与上表面158之间存在空隙。如图15中的实施方案所示，一个或多个侧壁159之间也可存在空隙。另外或可选地，芯片100的一部分与封盖152、156中的一个或多个和侧壁159中的一个或多个相连。
[0099]盒子150可由金属材料制造或形成，如不锈钢、铝、铜、银或金，或者半金属如石墨。另外或可选地，盒子150的所有或部分可由非金属材料制造，包括但不限于，玻璃、丙烯酸、苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯。此外，盒子150可由与生物反应如PCR兼容的一系列材料制造。例如，与PCR兼容时，盒子可具有低的自发荧光、对PCR反应为非抑制性的、对PCR的激发和检测波长为光学通透的，以及在PCR温度下为热稳定的。
[0100]在某些实施方案中，封盖152、156中的至少一个包含窗口，其配置为可提供对反应位点104的光学接近。另外或可选地，整个盒子150可由一种或多种透明的或近乎透明的材料制造。与加载液体样品至芯片相关的盒子在下文有描述。
[0101]根据本教导的不同实施方案，加载芯片中反应位点的方法如图17中所示。在步骤1702中，将液体样品放入样品加载器中。在各种实施方案中，样品加载器可具有放入液体样品的入口，以便将液体样品装入样品加载器中的储库。在其他实施方案中，将液体样品直接放入含有反应位点阵列的芯片上。在步骤1704，样品加载器与芯片接触。在步骤1706中，将样品加载器沿芯片表面横向移动，使得液体样品以足够的压力与反应位点接触，从而允许反应位点的毛细管作用将液体样品加载至反应位点。可任选进行步骤1708。在步骤1708中，可通过进行加热来促进将由样品加载器放置于芯片表面但未加载至反应位点中的任何过量液体样品去除。可通过加热表面来加热芯片。过量液体样品的去除可有助于降低例如扩增液体样品中生物分子期间可能发生的误差。还可调节其他环境因子如相对湿度来进行更有效的加载。
[0102]图18所示为根据本文所述的不同实施方案的另一样品加载器1800。样品加载器1800可包含第一刮片(blade) 1802和第二刮片1804。样品加载器1800还可包含入口 1806，其中可放入待加载至基底如芯片中所包含的反应位点阵列中的液体样品。放至入口 1806的液体样品可存留于第一刮片1802与第二刮片1804之间的储库1808中，直到将样品加载至反应位点。液体样品可在流体通道1810中流动以分布于流体通道的末端，即样品加载器1800的尖端。
[0103]如上文所提及的，根据一些实施方案，样品加载器1800可由用户手握以手动加载反应位点。在其他实施方案中，样品加载器1800可安装于加载装置中，并用于加载反应位点。
[0104]第一刮片1802和第二刮片1804配置为相对于彼此成锥形，以便液体样品沿第一刮片1802和第二刮片1804的宽度边缘润湿。以这种方式，液体样品可在芯片表面上均匀分布，使得当样品加载器1800在芯片上涂抹时液体样品被有效地加载至反应位点中。
[0105]图19A所示为样品加载器1800的侧视图。在该视图中，显示了储库1808。当液体样品被放入样品加载器1800中时，如上文所述，液体可存留于储库1808中，直到将液体样品加载至反应位点。可放入储库1808的液体样品的量可为10-20 μ L。在其他实施方案中，加载至反应位点的液体样品的体积可为0.5 μ L-100 μ L。在其他实施方案中，加载至反应位点的液体样品的量可大于100 μ L0加载至反应位点的液体样品的体积,可取决于例如样品加载器的材料特质、液体样品的特性和样品加载器与液体样品之间的关联性，如上文所述。
[0106]图19Β所示为样品加载器1800的第一刮片1802和第二刮片1804的放大图。显示了第一刮片1802和第二刮片1804间的锥度。在各种实施方案中，锥角可为0.1-15°。在一些实施方案中，锥角可为1.5-2°。在各种实施方案中，锥度可为使得第一刮片1802与第二刮片1804尖端之间距离为0.5μηι-100μη?ο在一些实施方案中,第一刮片1802与第二刮片1804之间的距离可为100ym-2mm。
[0107]此外，根据不同的实施方案，样品加载器1800的尖端可以65+/-3°的角度与芯片接触。根据不同的实施方案，样品加载器1800的尖端在接触芯片时可偏移O-.004英寸。另夕卜，样品加载器1800在芯片上的涂抹移动可为线性的。换句话说，存在最小限度的倾斜、转动或偏转。涂布器1800可以例如2-3mm/sec的速度跨芯片移动。
[0108]示例性的加载装置2000如图20所示。加载装置2000包含安装于样品加载器固定器2006上的样品加载器2004。样品加载器固定器2006和样品加载器2004组件被配置为将液体样品加载至包含反应位点阵列的芯片2002。在各种实施方案中，样品加载器固定器2006可手动移动，以便样品加载器2004能在芯片2002上横向移动来在芯片2002上涂布液体样品，从而加载在芯片2002中的反应位点。在其他实施方案中，样品加载器固定器可由控制系统机械控制来在芯片2002上移动样品加载器2004。
[0109]如参照图17所描述的，在一些实施方案中，可加热芯片来促进过量液体样品的去除。过量液体样品的去除可有助于减少反应位点间的交叉污染或桥连。在各种实施方案中，可调节其他环境因子如相对湿度来促进将液体样品加载至反应位点。
[0110]在各种实施方案中，用户可将液体样品放置于芯片上。然后，用户可握住样品加载器，并在芯片上横向移动样品加载器来将液体样品加载至反应位点中。对于手动和自动化加载方法，可将样品加载器以与芯片成0-90°的角度放置，同时在芯片上横向移动来加载反应位点。
[0111]应当理解，根据本文描述的不同实施方案的样品加载器可由不同的材料组成。例如，样品加载器可由聚烯烃、聚氨酯、硅氧烷等组成。在一些实施方案中，样品加载器可由Dow722组成，其为一种低密度的聚乙烯。然而，应当理解，能够在样品加载器材料和液体样品间产生5-179°的水接触角的任何材料均为样品加载可接受的材料。
[0112]样品加载器的液体样品性能、样品加载器材料性能和物理几何，以及反应位点的物理特性与反应位点表面的疏水/亲水特性和芯片是相互作用的，并且都必须被考虑在根据本教导的不同实施方案的用于加载样品的装置的完整系统中。
[0113]样品加载器以这样的方式接纳液体样品，以便能够将在样品加载器中的液体样品体积沿根据不同实施方案的芯片中所包含的反应位点阵列的宽度进行分配。来自样品加载器的液体样品的分布取决于液体样品的水接触角。水接触角源于样品加载器的材料特性与液体样品性能之间的关联。当水接触角小于90°时，液体样品与基底表面之间的关联为亲水性的，且样品展现与基底表面的结合性相互作用，这为将样品拖拽至通孔中的毛细管作用所必需。太过亲水如水接触角小于50°的基底，可引起例如样品基底表面上过量液体的聚集增加或反应位点的加载不足。此外，低接触角可造成液体样品太快地移向一些反应位点，引起液体样品在多个反应位点中的不均匀分配。
[0114]相反地，当水接触角大于90°时，基底表面与液体样品之间的关联为疏水性的，且由于毛细管力为负的，液体样品不会移入反应位点中。这种情形还可引起基底表面上液体样品的聚集，并阻止一些反应位点加载液体样品。因此，基底和反应位点表面被设计为在基底和反应位点表面针对液体样品的疏水性和亲水性之间达成平衡。
[0115]为了调整表面特性，可根据2013年3月15日递交的LT00668PCT中描述的实施方案，包被基底和反应位点表面。
[0116]考虑到这些特性，根据不同的实施方案，可通过配置样品加载器使得与液体样品的前进接触角类似于与液体样品的后退接触角来实现有效加载。参照图21，示出了前进和后退接触角。在基底2100上显示了水滴2102。如果基底为倾斜的，水滴2102将具有前进接触角2106和后退接触角2104。
[0117]根据不同的实施方案，前进接触角为85+/-15°，且后退接触角为85+/-15°。根据不同的实施方案，具有这些接触角的液体样品可通过毛细管作用容易地加载至反应位点。毛细管作用还足以接纳反应位点中的液体样品体积。
[0118]参照图22，根据本文描述的各种实施方案，示出了通过样品加载器来加载反应位点。待加载至反应位点104中的液体样品2204位于样品加载器2202中。样品加载器2202在表面106上横向移动。在其移动时，液体样品2204通过毛细管作用被加载至反应位点104 中。
[0119]样品加载器朝向芯片的向下力可取决于材料类型、样品加载器厚度和芯片厚度和材料。然而，向下力范围可为接触芯片的力至破坏芯片所需的力(硅的厚度应当被考虑为一个因素)。此外，在各种实施方案中，样品加载器在芯片上的涂抹速率可为2.0sec/mm至高达 0.2sec/mm。
[0120]根据本文描述的加载芯片的各种实施方案,至少75%的施加于芯片用于加载的液体样品体积被加载至多个反应位点。在一些实施方案中，将至少90%的施加于芯片用于加载的液体样品体积加载至多个反应位点。在各种实施方案中，施加于待加载的芯片的液体样品体积等于芯片上多个反应位点的总体积的体积。在一些实施方案中，施加于芯片的液体样品的体积为芯片上多个反应位点总体积的体积减去一个反应位点的体积。
[0121]参照图23，在某些实施方案中，载体2150a包含孔、端口(port)或开口 2162，其可被配置为通常垂直于封盖或光进入窗口 2152a，且大小允许芯片100通过而进入载体2150a。载体2150a还可包含刮涂器或刮片2164，其沿开口 2162的至少一个长边布置。刮片2164可被配置为在将芯片100装载至载体2150a时，与芯片100的表面110、112中的至少一个接触或结合。载体2150a还可包含置于开口 2162的所有或一部分上的薄膜或膜(未显示)，其有助于密封腔2160a，且在将芯片100装载至载体2150a中时被穿透。在某些实施方案中，膜和刮片2164形成单个的块。
[0122]在某些实施方案中，刮片2164被配置为有助于在通过开口 2162将芯片100插入载体2150a中后将样品液体分配到一些或所有的反应位点104。例如，刮片2164可被配置为在加载芯片100期间与110、112表面中的一个或二者接触，使得在表面110、112通过刮片2164时，液体不通过刮片2164，而是通过毛细管作用被推送和/或拖拽到反应位点104中。另外或可选地，刮片2164可被配置为以液体、凝胶等覆盖芯片100的表面110、112中的一个或二者，例如用于减少或消除反应位点104内所包含样品液体的污染和/或蒸发。
[0123]参照图24，在某些实施方案中，载体2150b包含主体2170，其可包含载体2150a的一些或所有结构和特征。载体2150b还包含用于固定芯片100的装载器或嵌入工具2172，以有助于将芯片100装载到主体2170中，和/或用于将测试溶液加载到反应位点104中。工具2172可具有U型主体，其中芯片100在装置至主体2170中前被装在“U”型主体内。工具2172可包含位于相对的臂2175上的袢扣(tab) 2174，其被配置为结合至或压入至主体2170的对应袢扣或类似结构2176中。
[0124]芯片100与载体2150b的表面之间的腔2160a部分可填充有不混溶的液体(例如，液体或凝胶物质)，其不与反应位点104中包含的测试溶液混合，且被配置为防止或减少包含的来自反应位点104的测试溶液的蒸发。一些应用的一种合适的液体为Fluorinert,其由3M公司出售。然而，在一些实施方案中，Fluorinert可能对于某些PCR应用存在问题，因为Fluorinert倾向于容易地摄取空气，其随后可能在PCR循环期间释放出来，导致形成不需要的气泡。
[0125]可选地，在某些实施方案中，已发现如果聚二甲硅乙烷(PDMS)未完全交联，其可用于腔160。在此类实施方案中，已发现PDMS具有几种使得其适用于PCR的特征，包括低自发荧光、PCR温度下的热稳定性和对于聚合过程的非抑制性。另外，PDMS可含有含水样品，但对水蒸气为气体可通过的。用于本发明的实施方案之外的一般应用，典型的硅氧烷与交联剂的重量比为10:1 (10%的交联剂)。
[0126]已发现，通过交联TOMS材料，所产生的材料可用作减少蒸发的合适密封剂，并且还保留了上述有利的且与完全交联材料相关的特性。更具体而言，通过使用少于10%重量的交联剂可形成经交联的PDMS材料。例如，已表明小于或等于I %重量的交联水平符合某些PCR应用如某些dPCR应用的设计需求。使用以小于或等于0.8%重量的交联剂用量来密封的平板100已证明了多重dPCR的响应。另外，由于经交联的PDMS材料具有较高的粘性，相比Fluorinert，PDMS密封剂还可为自身提供包装要求并向用户提供工作流程解决方案。
[0127]在某些实施方案中，芯片100可被配置用于美国临时申请第61/723，710中公开的任何密闭物(enclosure)、外壳(housing)或盒子(case),其通过引用整体并入本文。例如，如图25中所示，芯片100可布置于根据本发明和临时申请第61/723，710号的实施方案的密闭物、外壳或盒子2300中。盒子2300可包含基体2302和封盖或盖子2304，其配置为可密封地结合基体2302。基体2302和封盖2304可结合在一起形成腔或腔室2308，其可接收或容纳芯片500。芯片100可为基体2302的一部分，或可为单独的和/或与基体2302不同的，且被配置为通过基体2302安装或固定。
[0128]基体2302可包含多个支柱(boss)、袢扣、铆固位点或支承垫2320(例如，所示实施方案中的袢扣2320a和2320b)，其被配置为将芯片100固定和/或定位于基体2302和腔2308中。可铆固一个或多个袢扣2382，使得来自袢扣的材料变形或移动，以将芯片500牢固地固定于基体2302中。另外或可选地，可使用粘合剂、环氧树脂或胶水将芯片100与一个或多个袢扣182胶粘。在某些实施方案中，将胶粘结合玻璃或硅质芯片100使用，以避免对此类固定物质可能的破裂或破坏，其可能由于使用袢扣2320产生的束缚(crimping)力或固定力引起。在所示的实施方案中，袢扣2320a与芯片100的空白区域106匹配。在某些实施方案中，袢扣620a和空白区域106足够大，以提供对芯片100的恰当支承，但足够小而使得对应的芯片100的活性区域可提供含有预定数目反应位点104的所需要的预定活性区域。
[0129]如上文所提及的，计算系统可用于控制进行生物反应的仪器和检测生物反应结果的仪器。另外，可通过计算系统控制自动化的加载装置。可将计算系统安装在仪器中，或进行外部连接。此外，还可将计算系统通过网络与仪器连接。示例性的计算系统如图26所示。
[0130]本领域技术人员应理解,视情况而定使用硬件、软件、固件(firmware)或其组合可进行各种实施方案的操作。例如，可在软件、固件或硬连线逻辑的控制下使用处理器或其他数字电路实施一些方法。(本文的术语“逻辑”是指本领域技术人员认可的实施所述功能的固定硬件、可编程的逻辑和/或其合适的组合)。软件和固件可储存在计算机可读介质中。可使用本领域技术人员熟知的类似电路实施一些其他的方法。另外，存储器或其他存储以及通讯元件可用于本发明的实施方案。
[0131]图26的方块图显示了根据不同实施方案，可用于实施处理功能的计算机系统2600，基于该系统可使用图5的热循环仪系统500的实施方案。计算系统2600可包含一个或多个处理器如处理器2604。可使用通用或专用目的的处理引擎如微处理器、控制器或其他控制逻辑来操作处理器2604。在本实例中，处理器2604与总线2602或其他通信介质相连。
[0132]此外应当理解，图26的计算系统2600可以多种形式中的任一种来实现，如机架式计算机、大型机、超级计算机、服务器、客户端、台式电脑、手提式电脑、平板电脑、手提式计算装置(例如，PDA、手机、智能手机、掌上电脑等)、集群网络、上网本、嵌入式系统或任何其他类型的专用或通用目的的计算装置，其可能为给定应用或环境所需要或适于给定应用或环境。另外，计算系统2600可包括常规的网络系统，其包括客户端/服务器环境和一种或多种数据库服务器，或与LIS/LIMS基础结构的整合。多种常规的网络系统包括局域网(LAN)或广域网(WAN)且包括无线和/或有线元件，为本领域所知。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器和网络在本领域有充分的描述。
[0133]计算系统2600可包含用于通信的总线2602或其他通信机制，以及与总线2602连接的用于处理信息的处理器2604。
[0134]计算系统2600还包含与总线2602相连的用于储存将由处理器2604执行的指令的存储器2606，其可为随机存取存储器(RAM)或其他动态存储器。存储器2606还可用于储存在执行由处理器2604执行的指令期间的临时变量或其他中间信息。计算系统2600还包含与总线2602连接的用于储存处理器2604的静态信息和指令的只读存储器(ROM) 2608或其他静态存储装置。
[0135]计算系统2600还可包含存储装置2610，提供了如磁盘、光盘或固态硬盘(SSD)，并与总线2602连接用于储存信息和指令。存储装置2610可包含介质驱动器和可移动存储接口。介质驱动器可包含驱动器或其他机制来支承固定的或可移动存储介质，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、⑶或DVD驱动器(R或RW)、闪盘驱动器或其他可移动或固定的介质驱动器。如这些实例所描述，存储介质可包括其中已储存了特定计算机软件、指令或数据的计算机可读的存储介质。
[0136]在可选的实施方案中，存储装置2610可包括其他类似的工具以允许计算机程序或其他指令或数据加载至计算系统2600中。此类工具可包括，例如移动存储单元和接口，如程序盒和盒式接口、移动式存储器(例如，闪存或其他移动式存储器模块)和存储器插槽，以及其他允许软件和数据从存储装置2610转移至计算系统2600的可移动存储单元和接口。
[0137]计算系统2600还可包含通信接口 2618。通信接口 2618可用于允许软件和数据在计算系统2600和外部装置之间转移。通信接口 2618的实例可包括调制解调器、网络接口(如以太网或其他NIC卡)、通信端口(如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA槽和卡、蓝牙等。通过通信接口 2618传输的软件和数据为信号形式，其可为能够被通信接口 2618接收的电子、电磁、光或其他信号。这些信号可通过诸如无线介质、线或电缆、光纤或其他通信介质的通道被通信接口 2618传输和接收。通道的一些实例包括电话线、手机连接、RF连接、网络接口、局域网或广域网以及其他的通信渠道。
[0138]计算系统2600可通过总线2602与显示器2612如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)相连，用于为计算机用户显示信息。输入装置2614(包括字母数字和其他键)与总线2602相连，用于例如与处理器2604交流信息和指令选择。输入装置也可为显示器，如IXD显示器，其配置有触摸屏输入能力。另一种类型的用户输入装置为光标控制2616如鼠标、轨迹球或光标方向键，用于与处理器2604交流指示信息和指令选择，以及控制显示器2612上的光标移动。该输入装置通常具有两个轴上的两个自由度，即第一轴(例如，x)和第二轴(例如，y)，其允许装置指定平面上的位置。计算系统2600提供数据处理，并提供此类数据的置信水平。与本教导的实施方案的某些操作一致，通过计算系统2600响应处理器2604而执行存储器2606中包含的一个或多个指令的一个或多个指令串(sequences)提供数据处理和置信度值。此类指令可从另一计算机可读介质如存储装置2610读取至存储器2606中。存储器2606中包含的指令串的执行使得处理器2604执行本文描述的进程状态。可选地，硬连线的电路可用于代替或组合软件指令来实施本教导的实施方案。因此，本教导的实施方案的实施不限于任何具体的硬件电路和软件的组合。
[0139]如本文所述，术语“计算机可读介质”和“计算机程序产品”通常是指涉及为处理器2604提供一个或多个指令的一个或多个指令串以用于执行的任何介质。此类指令通常被称为“计算机程序代码”(其可以计算机程序或其他分组形式进行分类)，在执行时，使得计算系统2600能执行本发明实施方案的特征或功能。这些和其他形式的计算机可读介质可采取许多形式，包括但不限于，非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括，例如固态盘、光盘或磁盘，如存储装置2610。易失性介质包括动态存储器，如存储器2606。传输介质包括同轴电缆、铜线和光线，包括线，包括总线2602。
[0140]计算机可读介质的常见形式包括,例如软盘(floppy disk/flexible disk)、硬盘、磁带或任何其他磁性介质、CD-ROM、任何其他的光学介质、穿孔卡、纸带、具有孔状图案的任何其他的物理介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPR0M、任何其他的存储器芯片或卡盘、下文描述的载波或计算机可从中读取的任何其他介质。
[0141]计算机可读介质的各种形式可参与传输一个或多个指令的一串或多串至处理器2604用于执行。例如，最初可在远程计算机的磁盘上执行指令。远程计算机可将指令加载至其动态存储器中，并使用调制解调器将该指令发送到电话线上。计算系统2600本地的调制解调器可接收电话线上的数据，并使用红外线传送器将数据转换为红外线信号。与总线2602结合的红外线探测器可接收红外线信号中携带的数据，并将数据放到总线2602上。总线2602将数据传送至存储器2606，处理器2604从存储器取回并执行指令。在处理器2604执行之前或之后，存储器2606接收的指令可任选地储存在存储装置2610上。
[0142]应当理解，为了清楚目的，以上描述针对不同的功能单元和处理器描述了本发明的实施方案。然而，显而易见的是，在不偏离本发明下可采用不同功能单元、处理器或域之间任何合适的功能分配。例如，阐述为由单独的处理器或控制器执行的功能可由相同的处理器或控制器执行。因此，提及具体功能单元仅被看做是提及用于提供所描述的功能的合适方式，而非指示严格的逻辑或物理结构或机构。
[0143]用于与本文件中描述的各种实施方案相关的方法的示例性系统，包括以下美国临时专利申请中公开的那些:
[0144].2012年3月16日递交的美国临时申请第61/612，087号；和
[0145].2012年11月7日递交的美国临时申请第61/723，759 ;和
[0146].2012年3月16日递交的美国临时申请第61/612，005 ;和
[0147].2012年3月16日递交的美国临时申请第61/612，008 ;和
[0148].2012年11月7日递交的美国临时申请第61/723，658 ;和
[0149].2012年11月7日递交的美国临时申请第61/723，738 ;和
[0150].2012年6月13日递交的美国临时申请第61/659，029 ;和
[0151].2012年11月7日递交的美国临时申请第61/723，710 ;和
[0152].2013年3月7日递交的美国临时申请第61/774，499 ;和
[0153].2013年3月15日递交的生命技术公司(Life Technologies)案卷号LT00655PCT ;和
[0154].2013年3月15日递交的生命技术公司案卷号LT00656PCT ;和
[0155].2013年3月15日递交的生命技术公司案卷号LT00657PCT ;和
[0156].2013年3月15日递交的生命技术公司案卷号LT00668PCT ;和
[0157].2013年3月15日递交的生命技术公司案卷号LT00699PCT。
[0158]所有这些申请均通过引用整体并入本文。
[0159]尽管针对某些示例性实施方案、实例和应用描述了不同的实施方案，对本领域技术人员显而易见的是，可进行各种修改和改变而不脱离本发明的教导。
【权利要求】
1.用于进行生物反应的系统，所述系统包含: 芯片，其包含多个反应位点，其中所述多个反应位点中的每个反应位点被配置为容纳最多I钠升的液体样品； 控制系统，其被配置为用于在所述液体样品中启动生物反应；以及 检测系统，其被配置为用于检测所述芯片上的生物反应。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述芯片包含至少20000个反应位点。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述芯片包含至少30000个反应位点。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述多个反应位点中的每个反应位点为通孔。
5.如权利要求1所述的系统,其中所述多个反应位点中的每个反应位点为小井。
6.如权利要求1所述的系统，其中所述控制系统被配置为用于进行聚合酶链式反应(PCR)。
7.如权利要求6所述的系统，其中所述控制系统被配置为用于进行数字PCR。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述检测系统包含光学系统，其中所述光学系统包含激发源和光传感器，所述光传感器被配置为用于检测从所述多个反应位点中的多个液体样品发出的荧光信号。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述反应位点的表面为亲水性的。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述基底的表面为亲水性的。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述芯片被包裹于载体中。
12.如权利要求11所述的系统，其中所述芯片浸没于所述载体中的包封介质中。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述包封介质为聚二甲硅氧烷(PDMS)，其中所述PDMS被完全固化且未完全交联。
14.如权利要求11所述的系统，其中所述载体包含导液漏斗，其被配置为用于促进加载液体样品至所述多个样品区域的至少一些样品区域中。
15.如权利要求12所述的系统，其中所述包封介质被配置为用于减少所述液体样品的蒸发。
16.如权利要求12所述的系统，其中所述包封介质在插入所述芯片前被预装载在所述载体中。
17.如权利要求1所述的系统，其中所述芯片具有1mmX1mm的面积。
18.如权利要求1所述的系统，其中所述多个反应位点包括一系列体积以增加动态范围。
19.如权利要求1所述的系统，其中所述芯片和所述多个反应位点被配置为用于将所述液体样品加载至所述多个反应位点。
20.如权利要求19所述的系统，其中所述多个反应位点被配置为被加载多于一个样品O
21.如权利要求1所述的系统，其中所述光学系统具有15mm的焦距。
22.如权利要求19所述的系统，其中所述多个反应位点的第一部分加载有第一稀释度的所述液体样品，且所述多个反应位点的第二部分加载有第二稀释度的所述液体样品，以增加动态范围。
23.如权利要求10所述的系统，其中所述反应位点的表面和所述基底的表面包被有材 料。
24.如权利要求23所述的系统，其中所述材料为六甲基二硅氮烷(HMDS)。
25.如权利要求23所述的系统，其中通过气相沉积包被所述反应位点的表面和所述基底的表面。
26.如权利要求23所述的系统，其中所述液体样品与所述材料具有70-100°的接触角。
27.如权利要求23所述的系统，其中所述液体样品通过毛细管作用被加载至所述反应位点。
28.进行生物反应的方法，所述方法包括: 以液体样品加载芯片，所述芯片包含基底和多个反应位点，其中所述多个反应位点中的每个反应位点被配置为容纳最多I钠升的所述液体样品体积； 启动所述多个反应位点中的生物反应；和 以光学系统检测所述芯片上的多个生物反应。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述芯片包含至少20000个反应位点。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述芯片包含至少30000个反应位点。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述多个反应位点中的每个反应位点为通孔。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述多个反应位点中的每个反应位点为小井。
【文档编号】B01L3/00GK104411408SQ201380022560
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月16日
【发明者】迈克尔·C·帕拉斯, 詹姆士·讷尔斯, 加里·利姆, 西奥多·斯特劳博, 艾里奥道·陈丘, 埃文·福斯特, 乔治·方斯卡, 凯文·马赫尔 申请人:生命技术公司