产物用乙腈，按1:1的体积比组成的甲醇和水混合液，丙酮依次进行清洗。
[0019] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法中，所述的干 燥条件为80°c氮气保护。
[0020] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法中，所述的高 效液相色谱反相键合相为C18、C8、phenyl、hexyl-phenyl、C5、C4、Cl、PFPP、酰胺、酰酯或 C30键合相。
[0021] 所述高效液相色谱反相键合相覆盖所有颗粒大小，包括但不限于：1. 2 ym， 10 u m，12 u m，15 u m，20 u m，40 u m，75 u m。
[0022] 所述高效液相色谱反相键合相覆盖所有孔径大小，包括但不限于：60人， 70A, 8〇A, 10〇A, ll〇A，12〇A, 13〇A, 1404 15〇A, 200A, 250A, 300A, 400A, 500A，1000A, 2000A和无孔。
[0023] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法，所述封端试 剂包括1，1，3, 3, 5, 5-六甲基环三硅氮烷、八甲基环四硅氮烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-环五 聚二甲基硅氧烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11，11-十二甲基环己硅氧烷、1，1，3, 3, 5, 5-六苯 基环三硅氮烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7-八乙基环丁硅氨烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-十二乙基环 戊硅氧烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11，11-十二乙基环己硅氧烷、二甲基二氯硅烷、二甲基二 甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、甲氧基三甲基硅烷、二甲基叔丁基氯硅烷、正丁基二甲基甲氧 基硅烷、N- 丁基甲基二氯化硅、正丁基甲基二甲氧基硅烷、丁基三甲氧基硅烷、叔丁基三氯 硅烷、甲基三氯硅烷和甲基三甲氧基硅烷中的一种或几种；所述催化剂包括N，0-双三甲基 硅基乙酰胺、氨、三乙胺、1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亚胺和N，N-二甲基三甲基硅胺中的一 种或几种。
[0024] 本发明所述高效液相色谱反向键合相的超/亚临界流体封端方法可广泛应用于 分析和/或制备反相HPLC、UHPLC或UPLC产品。产品品质非常高。
[0025] 本发明还提供一种高效液相色谱柱，该色谱柱的键合相采用上述高效液相色谱反 相键合相的超/亚临界流体封端方法进行封端。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027] (1)使用这种新的方法和工艺能彻底封闭残留的活跃的硅烷醇基团，生产完全电 荷中性的疏水反相键合相。
[0028] (2)使用这种新战略（新的技术和工艺）生产的高效液相反相色谱柱或超高效液 相反相色谱柱，没有残留的活跃的硅烷醇基团和碱性化合物阳离子交换副作用，因此碱性 化合物（和酸性化合物，中性化合物，两性化合物一样）有非常对称的峰形，保留时间和机 理完全遵循化合物疏水性从低到高的顺序。
[0029] (3)碱性化合物柱效和峰形比现有技术制作的高效液相反相色谱柱或1. 7 ym UPLC超高效液相色谱柱，2. 6 y m核壳UHPLC高效液相反相色谱柱显著提高。
[0030] (4)这种新的方法和工艺反应条件温和，反相键合相无损伤，色谱柱寿命长。
[0031] (5)生产批次重复性很好。
[0032] (6)超临界流体和亚临界流体封闭方法生产碱性化合物柱效和峰形比现有技术制 作的高效液相反相色谱柱或1. 7 y m UPLC超高效液相色谱柱、2. 6 y m核壳UHPLC高效液相 反相色谱柱在LC-MS的TIC分析中键合相非常稳定，无泄漏。
[0033] (7)本发明提供的方法确保绿色化学，最大限度地减少有毒的有机溶剂如甲苯的 使用，最大限度地减少对环境的污染，并可实现工艺连续化和半自动化。
【附图说明】
[0034]图1是本发明超/亚临界流体封端技术（左侧）和固-液回流下的封端技术（右 侦D比较示意图；
[0035] 图2为代表性的反相键合相pH-表面电荷曲线比较结果；
[0036] 图3为代表性的反相键合相Zeta电势比较结果；
[0037] 图4为用不同高效液相色谱柱检测同一样品阿米替林、丙咪嗪的结果比较，其中 A为常规液-固封端生产的l〇〇A C18 5 y m25cmX4. 6mm HPLC色谱柱，B为超临界流体封 端生产的 10〇A C18 5ym25cmX4.6mm HPLC 色谱柱，C 为 Supelco 公司 Ascenti# C18 5ym25cmX4.6mm HPLC色谱柱，D为Supelco公司 Disc〇very?C18 5ym25cmX4.6mm HPLC 色谱柱，E 为 Waters 公司 Simfire? C18 5 ym25cmX4. 6mm HPLC 色谱柱。
[0038] 图5:为超临界流体封端生产的100A C18 5ym25cmX4. 6mm HPLC柱检测氟西汀 的色谱图。
[0039] 图6为超临界流体封端技术生产的5ym PFPP HPLC高效液相色谱柱做马尿中阿 米雷司鉴定的结果，阿米雷司LC-MS/MS MRM峰（M+1 = 163) :18. 1分钟，另一个活性代谢产 物（M+1 = 162)峰：28. 0 分钟；
[0040] 图7为亚临界流体封端方法封端技术生产的300A C18色谱柱产生的肽图谱；
[0041] 图8为市场上知名品牌高效液相色谱柱1上面的肽图谱；
[0042] 图9为市场上知名品牌高效液相色谱柱2上面的肽图谱；
[0043] 图10为通过超临界流体封端生产的1. 7 y m UPLC稳定酰胺超高效液相色谱柱对 中草药有效成分的分离结果；
[0044] 图11为超临界流体封端技术生产的2. 6 y m C18核壳UHPLC超高效液相色谱柱测 定大鼠脑微透析液中的精氨酸和组氨酸的结果。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0046] 实施例1 :5 y m C18键合相超临界流体封端
[0047] 传统固_液回流封端方法：采用日本Daiso公司丨20A 5 y m B型球形硅胶和硅烷 试剂十八烷基二甲基氯硅烷作为原材料，使用甲苯为溶剂，咪唑和吡啶为催化剂，在甲苯回 流温度用氮气保护回流24小时，洗涤后获得C18键合相。技术参数：比表面积300m2/g，键 合密度 3. 2ymol/m2。
[0048] 100g C18键合相使用三甲基氯硅烷为封端试剂，和1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亚 胺、N，N-二甲基三甲基硅胺等为催化剂，在甲苯回流温度用氮气保护回流24小时。反应后 使用甲苯，二氯甲烷，乙腈，甲醇和水（50:50)，丙酮依次洗，80°C氮气保护干燥，冷却下来后 使用。
[0049] 本发明的超临界流体封端方法：100g C18键合相放置到图1左侧SC-方法所示超 临界流体设备中间位置S和I，过量（封端试剂与C18键合相硅醇基的摩尔浓度比为2:1)三 甲基氯硅烷和1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亚胺，N，N-二甲基三甲基硅胺作为封端试剂和催 化剂放置到图1超临界流体设备中间位置2。反应体系的温度首先上升到31. 2°C，压强上 升到73. 8bar，这个时候0)2变成超临界流体。反应体系的温度10分钟内上升到100°C，压 强上升到414bar，超临界流体封端持续3~8小时。反应后，使用新鲜的C0 2超临界流体快 速清洗20~30分钟，冷却，减压。进一步使用乙腈，甲醇和水（体积比50:50)的混合液， 丙酮依次洗，80°C氮气保护干燥，冷却下来后使用，标记为Novel C18。
[0050] 实施例2:表面电荷滴定
[0051] 表面电荷滴定，Zeta电势是胶体与界面科学领域两个最重要的表面表征技术。滴 定方法：10克色谱键合相放置在电位滴定室内，用10mM氯化钠（80 % )和甲醇（20 % )作为 液相，用〇? 1M盐酸调整pH值至3. 0,从pH值3. 0在氮气保护下用0? 1M NaOH滴定到pH8， 又用0. 1M盐酸返滴定到pH3. 0,再一次用0. 1M