依次分别用乙醚(5次)，丙酮(3次)，甲醇(3次)，乙醚(I次)洗涤沉淀，然后冷冻干燥。
[0026]微囊藻毒素的吸附与洗脱:
方法一:将0.0lg CTS-CD-P壳聚糖衍生物溶于ImL NaHCO3/ Na2CO3C 10.83)缓冲液中，待溶解后取10PL作为反应体系，再在该体系中加入50μ? MC_LR(25(^g/mL)标准混匀放置进行吸附。用10PL 0.3mol/L冰醋酸沉淀CS-CD-P壳聚糖衍生物，12000r/min离心5min，用500μ1的70%甲醇溶液(加入0.05%TFA)进行洗脱，液相色谱分析结果显示溶解CTS-⑶-P壳聚糖衍生物对MC-LR的吸附能力达到8.98mg/g，结果显著高于文献中利用分子印迹聚合物(对MC-LR最大吸附量为153.7Pg/g)和活性碳纤维(对MC-LR最大吸附量为246 Pg/g)的吸附量。
[0027]方法二:取0.002g CS-CD-P壳聚糖衍生物于150μ?蒸馏水中，再加入50μ1MC-LR(125Pg/mL)标准，混合放置吸附10小时，12000r/min离心5min，用500μ1体积浓度70%甲醇水溶液(加入0.05%TFA)进行洗脱收集，可用于液相色谱的测定，经测定吸附量为3.37 mg/go
[0028]实施例2
一、壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成第一步和第二步同实施例1。
[0029]第三步
第三步壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物(CTS-CD-P壳聚糖衍生物)的合成将合成得到的3g壳聚糖固载环糊精溶于36mL的甲烷磺酸溶液，然后加入15g的P2O5，整个反应在队的保护下用玻璃棒不断的搅拌，在冰浴中进行(0-5°C )，通过改变反应时间或P2O5的用量获得不同取代程度的磷酸化壳聚糖。反应完成后，加入乙醚使产物沉淀，离心分离，依次分别用乙醚(5次)，丙酮(3次)，甲醇(3次)，乙醚(I次)洗涤沉淀，然后冷冻干燥。
[0030]微囊藻毒素的吸附与洗脱:
方法一:准确称取5.00 g鲫鱼试样均勾样品于15 mL离心管中，加入50 μ L标准MC-LR, (125 μ g/mL)，于液体混匀器(10000 r/min)上快速混合I min，使标准与试样混合均勾，均质2 min，离心5 min (3000 r/min)，将上清液转移到试管中待测；将0.02gCTS-⑶-P壳聚糖衍生物溶于2 mL NaHCO3/ Na2CO3 (10.83)缓冲液中，再在该体系中加入待测匀浆鱼肉制品混匀放置12小时进行吸附。用Iml 0.3mol/L冰醋酸沉淀CS-⑶-P壳聚糖衍生物，12000r/min离心5min，用2ml的70%甲醇溶液(加入0.05%TFA)进行洗脱，液相色谱分析结果显示CTS-CD-P壳聚糖衍生物对MC-LR的吸附能力达到5.46mg/g.方法二:
待测鱼肉样品的制备同方法二，取0.02g CS-⑶-P壳聚糖衍生物于ImL蒸馏水浸溶，加入待测匀浆鱼肉制品混匀放置12小时进行吸附，12000r/min离心5min，用2ml体积浓度70%甲醇水溶液(加入0.05%TFA)进行洗脱收集，可用于液相色谱的测定，经测定吸附量为2.95mg/go
[0031]实施例3
一、壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成第一步和第二步同实施例1。
[0032]第三步
第三步壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物(CTS-CD-P壳聚糖衍生物)的合成将合成得到的2g壳聚糖固载环糊精溶于14ml的甲烷磺酸溶液，然后加入28的己05，整个反应在队的保护下用玻璃棒不断的搅拌，在冰浴中进行(0-5°C )，通过改变反应时间或P2O5的用量获得不同取代程度的磷酸化壳聚糖。反应完成后，加入乙醚使产物沉淀，离心分离，依次分别用乙醚(5次)，丙酮(3次)，甲醇(3次)，乙醚(I次)洗涤沉淀，然后冷冻干燥。
[0033]微囊藻毒素的吸附与洗脱:
方法一:将贝类组织取出，沥干水分后在冰水浴中搅碎、混匀，准确称取均质后的样品5g于15 mL离心管中，再加入50μ1 MC_LR(125Pg/mL)标准，于液体混勾器(10000 r/min)上快速混合I min，使标准与试样混合均勾，均质2 min，离心5 min (3000 r/min)，将上清液转移到试管中待测，将0.0lg CTS-⑶-P壳聚糖衍生物溶于2 mL NaHCO3/ Na2CO3(10.83)缓冲液中，再在该体系中加入待测匀浆鱼肉制品混匀放置12小时进行吸附，用5ml 0.3mol/L冰醋酸沉淀CS-CD-P壳聚糖衍生物，12000r/min离心5min，用3ml的70%甲醇溶液(加入
0.05%TFA)进行洗脱，液相色谱分析结果显示CTS-⑶-P壳聚糖衍生物对MC-LR的吸附能力达到 6.21mg/g.方法二:
待测贝类肉样品的制备同方法二，取0.0lg CS-⑶-P壳聚糖衍生物于ImL蒸馏水浸溶，加入待测匀浆鱼肉制品混匀放置12小时进行吸附，12000r/min离心5min，用3ml体积浓度70%甲醇水溶液(加入0.05%TFA)进行洗脱收集，可用于液相色谱的测定，经测定吸附量为 2.37mg/g。
[0034]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤: 取壳聚糖固载环糊精溶于甲烷磺酸中，氮气保护下加入P2O5，于冰浴下反应，反应结束后，加入乙醚以沉淀产物，即得壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，壳聚糖固载环糊精、甲烷磺酸与P2O5的比例为 Ig:7-12 mL:l-5go3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，壳聚糖固载环糊精、甲烷磺酸与P2O5的重量比为lg: 10 mL:5 g。4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，于冰浴搅拌下反应，反应时间为1~3小时。5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，还包括，将得到的沉淀产物洗涤的步骤，沉淀产物依次以乙醚、丙酮、甲醇和乙醚洗涤。6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，壳聚糖固载环糊精通过如下方法制备: 壳聚糖溶解于体积浓度为1%的冰醋酸中，将溶解有单-6-对甲苯磺酰-β -环糊精的N, N- 二甲基甲酰胺加入其中，混合均匀，该混合体系在80-100°C下冷凝回流40-60小时，反应结束后用透析袋透析混合液3-4天，来纯化目标产物，接着冷冻干燥，得到棉花状的固体，即为壳聚糖固载环糊精。7.权利要求1~6任一项所述的合成方法制备得到的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物。8.权利要求7所述的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物富集微囊藻毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤: I)将壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物溶解于pH 10~11的NaHCO3/ Na2CO3缓冲溶液中； 2)在步骤I)得到的缓冲体系中加入含有微藻囊毒素的样品，混匀放置进行吸附； 3)向步骤2)的体系中加入浓度为0.1-0.5mol/L冰醋酸以沉淀壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物，离心沉淀得到吸附了微藻囊毒素的衍生物； 4)三氯乙酸加入浓度50%-70%甲醇水溶液中，构成洗脱液，洗脱液中三氯乙酸的体积浓度为0.03-0.07%，以洗脱液洗脱步骤3)得到的吸附了微藻囊毒素的衍生物上的微藻囊毒素。9.权利要求7所述的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物富集微囊藻毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)所述壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物加入含微囊藻毒素的水样或含微囊藻毒素的样品悬浊液放置吸附，离心沉淀得到衍生物； 2)三氯乙酸加入浓度50%-70%甲醇水溶液中，构成洗脱液，洗脱液中三氯乙酸的体积浓度为0.03-0.07%，以洗脱液洗脱步骤I)得到的吸附了微藻囊毒素的衍生物上的微藻囊毒素。
【专利摘要】本发明公开了一种壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成方法，包括如下步骤：取壳聚糖固载环糊精溶于甲烷磺酸中，氮气保护下加入P2O5，于冰浴下反应，反应结束后，加入乙醚以沉淀产物，即得壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物。本发明选用了壳聚糖作为载体，进行β-环糊精的固载，并进行磷酸化修饰，合成壳聚糖固载环糊精磷酸化修饰的衍生物（CTS-CD-P），该衍生物通过壳聚糖上的环糊精和巯基磷酸特异性结合微囊藻毒素，提高了MC-LR的富集吸附效率。
【IPC分类】B01D15/08, B01J20/24, G01N30/02, B01J20/30, C08B37/08
【公开号】CN104959124
【申请号】CN201510425700
【发明人】王海英, 赵晖, 梁晓声, 王朝元, 甘科
【申请人】中南民族大学, 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月20日