壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于水体和食品级之中痕量有机物分析领域，涉及到特异性吸附微囊藻毒素的壳聚糖改性材料的制备及使用方法，具体涉及一种壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成及其应用。
【背景技术】
[0002]随着我国现代化进程加快，由地表水富营养化引起的有害蓝藻水华经常性大范围发生，其中蓝藻水华中以微囊藻(Microcystis)水华发生最为普遍，所产生的微囊藻毒素不仅严重危害淡水水体，在淡水生态环境的食物链中，含有微囊藻毒素的藻体细胞被浮游动物、甲壳类、贝类等摄食，通过动物摄食而富集于多种鱼类等水产品和禽类肉制品中，可以造成人类和禽畜多脏器损伤甚至引发癌症。
[0003]由于微囊藻毒素(MC-LR)浓度在水体和食品样品中较低，在检测前需要进行样品的富集再进行分析。目前纯化富集微囊藻毒素的方法包括免疫亲和柱、C18固定相、甲基丙烯酸丁酯毛细管、分子印迹聚合物、活性炭纤维和大孔树脂等。但在这些方法中要么耗时长、对技术操作要求高，要么价格昂贵、对藻毒素的吸附量低，要么对微囊藻毒素的专一性不高，导致富集纯化的微囊藻毒素的纯度不高。因此目前需要一种廉价、专一性强和吸附量高的富集纯化微囊藻毒素的方法。
【发明内容】
[0004]为了解决上述技术问题，本发明根据微囊藻毒素(MC-LR)的结构特点进行理性设计，针对MC-LR结构中含有疏水的苯环结构和带正电荷精氨酸的胍基，理论上疏水的苯环结构可以和环糊精的疏水空腔进行主体-客体反应而特异性结合，带正电荷精氨酸的胍基可以与带负电荷的磷酸基团发生静电作用和形成氢键并特异性结合，通过两个化学键的特异性结合，可以提高材料对MC-LR结合专一性。
[0005]壳聚糖具有生物可降解性，无毒性，生物相容性好和低成本的优点，主要应用在医药、食品和环保等领域。壳聚糖上有许多羟基和氨基基团，因此能够参与许多壳聚糖的修饰反应，固载环糊精的壳聚糖具有环糊精对有机物和金属离子的包络作用，近年来应用化学修饰的方法来合成具有新的生物功能的壳聚糖衍生物，由于新基团的引入而使其具有新的功能。
[0006]本发明选用了壳聚糖作为载体，进行环糊精的固载，并进行磷酸化修饰，合成壳聚糖固载环糊精磷酸化修饰的衍生物(CTS-⑶-P)，该衍生物通过壳聚糖上的环糊精和巯基磷酸特异性结合微囊藻毒素，提高了 MC-LR的富集效率，建立壳聚糖双修饰衍生物对微囊藻毒素的吸附及其洗脱方法，旨在开发一种廉价、专一性强和吸附量高的富集纯化微囊藻毒素的新型材料及其应用方法。
[0007]本发明提供的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成方法，包括如下步骤: 取壳聚糖固载环糊精溶于甲烷磺酸中，氮气保护下加入P2O5，于冰浴下反应，反应结束后，加入乙醚以沉淀产物，即得壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物。
[0008]作为优选技术方案，壳聚糖固载环糊精、甲烷磺酸与P2O5的比例为Ig:7-12 mL:l-5go
[0009]作为优选技术方案，壳聚糖固载环糊精、甲烷磺酸与P2O5的重量比为lg: 10 mL:5
g°
[0010]作为优选技术方案，上述合成方法于冰浴搅拌下反应，反应时间为1~3小时。
[0011]作为优选技术方案，上述的合成方法还包括，将得到的沉淀产物洗涤的步骤，沉淀产物依次以乙醚、丙酮、甲醇和乙醚洗涤。
[0012]作为优选技术方案，壳聚糖固载环糊精通过如下方法制备:
壳聚糖溶解于体积浓度为1%的冰醋酸中，将溶解有单-6-对甲苯磺酰-β -环糊精的N, N- 二甲基甲酰胺加入其中，混合均匀，该混合体系在80-100°C下冷凝回流40-60小时，反应结束后用透析袋透析混合液3-4天，来纯化目标产物，接着冷冻干燥，得到棉花状的固体，即为壳聚糖固载环糊精。
[0013]上述单_(对甲苯基磺酰基)β -环糊精通过如下方法制备:
I)称取I份的β-环糊精加入8份水中，将含有碱的蒸馏水缓慢加入到β-CD(环糊精)的悬浮液中，碱为NaOH，KOH或氨水，一边滴加一边搅拌，滴加时间为8~10min，最后β -⑶完全溶于碱中，悬浮液变成透明的β -CD溶液。
[0014]将I份的对甲基苯磺酰氯溶解到3份的有机溶剂中，有机溶剂为丙酮，乙腈，三氯甲烷，然后逐渐滴到透明的β-CD溶液中，一边滴加一边用玻璃棒搅拌，滴加时间为10~12mino滴加结束后，透明的⑶溶液变成浑浊液。恒温磁力搅拌器18_22°C下100r/min搅拌2.5h。反应结束后离心分离得到上清液，将上清液于4°C里放置半天，会有大量白色沉淀析出。再将白色沉淀以蒸馏水为溶剂75°C下重结晶两次，再冷冻干燥。得到干燥高纯度的磺化产物(β -⑶-0TS)。
[0015]本发明提供上述的合成方法制备得到的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物。
[0016]本发明提供上述的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物富集微囊藻毒素的方法，包括如下步骤:
1)将壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物溶解于pH10~11的NaHCO3/ Na2CO3缓冲溶液中；
2)在步骤I)得到的缓冲体系中加入含有微藻囊毒素的样品，混匀放置进行吸附；
3)向步骤2)的体系中加入浓度为0.1-0.5mol/L冰醋酸以沉淀壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物，离心沉淀得到吸附了微藻囊毒素的衍生物。
[0017]4)三氯乙酸加入浓度50%_70%甲醇水溶液中，构成洗脱液，洗脱液中三氯乙酸的体积浓度为0.03-0.07%，以洗脱液洗脱步骤3)得到的吸附了微藻囊毒素的衍生物上的微藻囊毒素。
[0018]本发明另提供一种上述的壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物富集微囊藻毒素的方法，包括如下步骤:
I)所述壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物加入含微囊藻毒素的水样或含微囊藻毒素的样品悬浊液放置吸附，离心沉淀得到衍生物； 2)三氯乙酸加入浓度50%-70%甲醇水溶液中，构成洗脱液，洗脱液中三氯乙酸的体积浓度为0.03-0.07%，以洗脱液洗脱步骤I)得到的吸附了微藻囊毒素的衍生物上的微藻囊毒素。
[0019]本发明旨在克服用于微囊藻毒素富集的高分子材料的C18固定相、分子印迹聚合物、活性炭纤维和大孔树脂等方法对微囊藻毒素的选择性不高，吸附量较低的缺点，本发明提供了一种壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰的衍生物材料制备方法及其微囊藻毒素富集的方法。
[0020]本发明提供了一种壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰的衍生物材料，壳聚糖具有生物可降解性，无毒性，生物相容性好和低成本的优点，其结构上有许多羟基和氨基基团，因此能够参与许多壳聚糖的修饰反应，应用化学修饰的方法来合成具有新的生物功能的壳聚糖衍生物，由于新基团的引入而使其具有新的功能。
[0021]本发明中选用了壳聚糖作为载体，进行β -环糊精(β -CD)的固载，并进行磷酸化修饰，合成壳聚糖固载环糊精磷酸化修饰的衍生物(CTS-⑶-P)，该衍生物通过壳聚糖上的环糊精和巯基磷酸特异性结合微囊藻毒素结构中的含有疏水的苯环结构和带正电荷精氨酸的胍基，进行特异性的结合。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0023]实施例1
一、壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物的合成第一步单-(6-对甲苯基磺酰基)β -环糊精的制备
将55g β -⑶加入435mL的蒸馏水中，将溶有5.2g NaOH的蒸馏水缓慢加入到β -⑶的悬浮液中，一边滴加一边搅拌，滴加时间为8~10min，最后β -⑶完全溶于NaOH中，悬浮液变成透明的β -⑶溶液。再将溶有7.96g对甲基苯磺酰氯的24mL乙腈逐滴到透明的β -⑶溶液中，一边滴加一边用玻璃棒搅拌，滴加时间为10~12min。滴加结束后，透明的β-CD溶液变成浑浊液。然后于恒温磁力搅拌器22°C下lOOOr/min搅拌2.5h。反应结束后离心分离得到上清液，将上清液于4°C里放置半天，会有大量白色沉淀析出。再将白色沉淀以蒸馏水为溶剂75°C下重结晶两次，再冷冻干燥。得到干燥高纯度的环糊精磺化物(单-(6-对甲苯基磺酰基)β-环糊精)。
[0024]第二步壳聚糖固载环糊精(⑶-CS)的合成
将Ig壳聚糖溶解于40mL 1%的冰醋酸，并将溶解有5g β -环糊精磺化物的DMF溶液加入其中，搅拌混合均匀，该体系在100°C下冷凝回流48h，于透析袋中纯化3天，然后冷冻干燥，得到棉花状的壳聚糖固载环糊精(CD-CS)固体。
[0025]第三步壳聚糖固载环糊精磷酸化双修饰衍生物(CTS-⑶-P壳聚糖衍生物)的合成将合成得到的0.5g壳聚糖固载环糊精溶于5mL的甲烷磺酸，然后加入2.5g的P2O5，整个反应在N2的保护下用玻璃棒不断的搅拌，在冰浴中进行(0-5°C)，通过改变反应时间或P2O5的用量获得不同取代程度的磷酸化壳聚糖。反应完成后，加入乙醚使产物沉淀，离心分离，