一种用于黄曲霉毒素b1富集分离的适配体-磁性纳米粒子制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黄曲霉毒素 Bl样本的净化处理工艺，具体涉及一种黄曲霉毒素 Bl分 离的适配体-磁性纳米粒子制备及应用方法。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素 Bl均为黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢物，具有致癌、致畸、致 突变的作用，是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素，一般食品加工条件都不易破坏，因 此给消费者的饮食安全埋下了巨大的隐患。各国对食品中黄曲霉毒素残留量现状非 常重视，制定了相应的限量标准，如我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素允许量标准为 (B1+B2+G1+G2)10ng/g。
[0003] 目前，黄曲霉毒素 BI的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱 价格较贵，多为一次性的，使得分析成本较高、耗时长、选择性低，严重制约了分析方法的发 展。
[0004] 有关对磁纳米粒子进行修饰，并应用于磁性纳米分离试剂的研宄已有报道。磁性 纳米粒子具有较大比表面积，易于利用氨基、环氧基等官能团进行化学修饰，经修饰后的磁 性纳米粒子能够与被测试样品相结合，再利用外加磁场，使磁性纳米粒子可以快速从复杂 的样液中分离。
[0005] 申请号为CN102680673的专利申请公开了一种将黄曲霉毒素 Bl抗体与磁性微粒 偶联，制备出具有特异性的免疫磁性微粒，用于样本中黄曲霉毒素 Bl净化。该发明改善了 分离效率，但同样存在抗体的不足，不易保存，再生后效率低等缺陷。核酸适配体作为一种 人工筛选的特异性DNA或RNA片段。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、 可反复使用和长期保存的优点，并且核酸适配体作为识别分子在蛋白质研宄、药物检测、医 学诊断和食品安全等方面得到了广泛应用。
[0006] 然而，单独的磁性纳米粒子并不具有对目标物的特异性识别。因此，对于复杂样品 中微量的黄曲霉毒素 Bl的高选择、快速、有效的分离是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的目的提供一种用于黄曲霉毒素 Bl分离的适配 体-磁性纳米粒子复合物，进一步地，本发明还提供一种用于黄曲霉毒素 Bl分离的适配 体-磁性纳米粒子复合物的制备，更进一步地，本发明还涉及一种用于黄曲霉毒素 Bl分离 的适配体-磁性纳米复合物的应用，以解决【背景技术】中黄曲霉毒素 Bl样品净化分离操作复 杂、分离效率低等问题。
[0008] 本发明首先提供一种用于黄曲霉毒素 Bl分离的适配体-磁性纳米粒子复合物，包 括如下结构：
[0009] (1)由顺磁性的Fe3O4磁纳米粒子构成内核层；
[0010] (2)包覆内核层的硅烷化层，所述的硅烷化试剂为3-(2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧 基硅烷；
[0011] (3)外壳层表面为黄曲霉毒素 Bl适配体的修饰层，黄曲霉毒素 Bl适配体的序列 为：5' -NH2-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'。
[0012] 进一步地，本发明还涉及一种用于黄曲霉毒素 BI的适配体-磁性纳米粒子复合物 的制备方法，它包括了以下步骤：
[0013] (1)通过共沉淀技术、制备出Fe3O4磁纳米粒子，在外加磁场下，洗绦纳米粒子，冷 冻干燥；
[0014] (2)使用3_(2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷在甲苯体系中对步骤（1)的磁纳 米粒子表面进行修饰，得到修饰了环氧官能团的磁纳米粒子，用乙醇和甲苯反复洗涤除去 未反应的3-(2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷；
[0015] (3)使用PBS缓冲溶液超声分散所述步骤（2)得到的磁纳米粒子，加入黄曲霉毒 素 Bl适配体，37°C孵育12小时，反应完成后，磁分离弃去上清液，所得磁性纳米粒子溶于 lmol/L pH为8. 0的乙醇胺中，封闭未反应的环氧官能团，40-50°C孵育4小时，反应完成后， 磁分离弃去上清液，并用PBS缓冲溶液反复清洗，最终获得黄曲霉毒素 Bl适配体-磁性纳 米粒子复合物。
[0016] 本发明第三方面提供了 .黄曲霉毒素 Bl适配体-磁性纳米粒子复合物的应用方 法，包括步骤：
[0017] (1)按照上述的制备方法值得适配体-磁性纳米粒子复合物；
[0018] (2)样本用甲醇-水或乙腈-水进行提取，0. 01~0. lmol/LpH7. 4的PBS缓冲液 稀释至有机溶剂比例少于10% (体积分数）；
[0019] (3)将上述步骤（2)稀释液与步骤（1)复合物进行反应，捕获黄曲霉毒素 B1。磁 性分离，弃上清。
[0020] (4)甲酸甲醇（l+99，v/v)或甲酸乙腈（l+99，v/v)作为洗脱液加入到步骤⑶得 到的磁性纳米粒子，室温振荡，磁性分离，上清液为净化后黄曲霉毒素 Bl样本。
[0021] (5)将步骤（4)中适配体-磁纳米粒子复合物进行再生，再生方法是用3mL含 0. 5mol/LNaCl的0. lmol/LpH4. 0乙酸缓冲液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3磷酸缓冲液交 替清洗，每次清洗2min，至少循环3次。再生后适配体-磁纳米粒子复合物重悬于0.1mol/ LpH7. 4的PBS缓冲液保存在4°C冰箱中。
[0022] 本发明的有益成果是：
[0023] (1)适配体-磁性纳米粒子用于黄曲霉毒素 Bl样品净化效率高。因为磁性微粒具 有较大的比表面积，对生物分子如适配体的固定化容量很高，能有效分离黄曲霉毒素 Bl。
[0024] (2)适配体-磁性纳米粒子用于黄曲霉毒素 Bl样品净化分离过程简单便捷。本发 明方法只需要对样品进行简单处理，不需要高速离心和固相萃取的活化处理，也不存在堵 塞和反应后分离困难的问，还可根据实验调整反应体积。
[0025] (3)适配体-磁性纳米粒子用于黄曲霉毒素 Bl样品净化选择性强。采用黄曲霉毒 素 Bl适配体作为识别分子，可以特异性将黄曲霉毒素 Bl从复杂基质中分离出来，分离效率 和回收率高达80%~88%。
[0026] (4)适配体-磁性纳米粒子可多次使用，研宄表明重复使用5次分离效率和回收率 未见明显下降。
【附图说明】
[0027] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0028] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0029] 图IA为实施例1所述顺磁性Fe3O4磁纳米粒子的透射电子显微镜图；
[0030] 图IB为实施例1所述的表面带有环氧官能团的磁纳米粒子的透射电子显微镜 图；
[0031] 图IC为实施例1所述的适配体-磁纳米粒子复合物的透射电子显微镜图；
[0032] 图2为实施例1所述顺磁性Fe3O4磁纳米粒子、所述表面带有环氧官能团的磁纳米 粒子及所述适配体-磁纳米粒子复合物的磁滞回线；
【具体实施方式】
[0033] 本发明者经过广泛而深入研宄，发明了在磁纳米粒子的表面修饰并结合适配体， 然后用这种磁纳米粒子去捕获目标分子，再在外磁场作用下进行分离的技术。
[0034] 以下实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定 参数不应视为本发明基本技术方案的局限。
[0035] 实施例1
[0036] 制备黄曲霉毒素 Bl适配体-磁性纳米粒子复合物方法包括以下步骤：
[0037] (1)磁纳米粒子内核层制备方法
[0038] 将 FeCl3 ·6Η20 和 FeCl2 ·4Η20 按 2:1 的摩尔比溶于 160mL0. lmol/L 盐酸溶液。将 混合液移入250mL烧瓶中，剧烈搅拌30min，40°C下缓慢滴加5mol/LNaOH溶液，调节pH至 10~11，升温至60°C，陈化2小时，整个过程在氮气保护下进行。用去离子水将磁纳米粒子 洗至中性，冷冻干燥磁纳米粒子。
[0039] (2)磁纳米粒子硅烷化层制备方法
[0040] 称取200mg步骤（1)冷冻干燥后的Fe3O4纳米粒子，加入5-15mL含5% 3-(2, 3-环 氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（体积分数）甲苯溶液，超声溶解30-60min，室温振荡过夜。反 应完全后，用甲苯和乙醇交替清洗未反应的3- (2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷，在氮气 保护下80-120°C干燥1-2小时，得到表面带有环氧官能团的磁纳米粒子。
[0041] (3)磁纳米粒子修饰层制备方法
[0042] 称取10_30mg步骤⑵溶于2. OmL PBS缓冲溶液，超声溶解，在外加磁场下，弃去 上清液。重新溶解在超声溶解在2. OmLPBS缓冲溶液中，加入IOOnmol黄曲霉毒素 Bl适配 体，30-40°C振荡反应过夜。反应后加入2. 0mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶