T细胞受体交互作用的调节的制作方法

专利名称：T细胞受体交互作用的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合物(MHC)抗原间的交互作用的调节化合物。一方面本发明的特点涉及识别试验化合物的方法。另一方面本发明提供通过该方法检测与识别的试验化合物、包括该化合物的医药制剂、以及该等化合物的治疗用法。本发明有多项重要应用包括用于高产出量筛选检定分析，以选择可减低或消除有害免疫反应的化合物、或可提升或引发有用的免疫反应的化合物。
背景技术：
抗原特异性T细胞识别且应答于结合至主要组织相容性复合物(MHC，包括人类MHC称作HLA)的结合沟或裂缝的特定肽。肽由MHC分子提呈且由抗原特异性T细胞识别表示识别且应答于外来抗原之一项重要免疫监视策略。抗原肽系非共价键结至包含MHC蛋白质结合沟的多形性残基的特定「结合口袋」。与MHC结合的抗原性肽与T细胞表面的T细胞受体(TCRs)特异性交互作用，且调节免疫反应。概略而言参考基础免疫学，第3版，W.Paul编辑芮森(Rsen)出版社，纽约(1993年)。
也参考Rhode，P.等人的美国专利第5,869,270号(让与桑诺(Sunol)分子公司)。
MHC分子为与膜结合的异二聚体糖蛋白，其包括α链及β链。用于第II类MHC分子，α1与β1领域结合形成一个肽结合沟。抗原肽系经过肽上的锚定氨基酸与由α1及β1领域形成的结合口袋间的交互作用而结合MHC分子。人类第II类MLA-DR1复合流行性感冒病毒肽的X光晶相学结构显示肽与MHC分子间的交互作用的原子细节。参考Brown，J.H.等人(1993)自然36433-39；Stern，L.J.等人(1994)自然368215-221；以及Garboczi，D.N.等人(1999)免疫101-7。
MHC第I类分子具有与第II类MHC分子不同的领域组织结构。第I类MHC分子中，α1与β1领域结合而形成肽结合沟。但两类MHC分子具有整体类似结构，肽结合位置或结合沟位在膜领域远程。例如参考Rudensky，A.Y.等人(1991)自然353622-626。也参考美国专利第5,284,935；5,260,422；5,194,425；5,130,297号；以及WO92/18150、WO93/10220有关MHC分子的讨论。
T细胞反应系经过抗原结合至T细胞受体(TCR)予以调节。一类型TCR为α链及β链组成的与膜结合的异二聚体。这种TCR被视为类似免疫球蛋白可变区(V)以及恒定区(C)。TCRα链包括共价键联的V-α及C-α链，而β链包括V-β链共价键联至C-β链。V-α及V-β链形成口袋或裂缝，该口袋或裂缝可结合至MHC分子的超抗原或肽抗原、或结合至异种反应性MHC分子。概略参考Paul，W.(参见上文)。
已经报告若TCRα链及β链未组合成为一种复合物，该复合物包括特定分化群集(CD)蛋白质，换言之CD3复合物包含γ、δ、ε及ζ链，则该TCR可被分解。例如参考Shin等人(1993)科学2591901。
已知MHC分子复合抗原肽，可经过若干不同机转诱生选择性免疫抑制。例如参考Guery，J.等人(1993)免疫学关键综论13(3/4)195-206。
特别，曾经报告若抗原提呈细胞(APCs)也传输共同刺激信号，则抗原提呈分子表面上的肽-MHC复合物只诱发与MHC结合肽的特异性T细胞系的克隆扩大。曾经提出一种办法利用此项T细胞活化要求，以及经过于无共同刺激信号存在下，与结合至MHC分子的抗原性肽交互作用而抑制T细胞的发展。参考Nicolle，M.等人，临床研究期刊(J.Clin.Invest.)(1994)931361-1369；以及Sharma，S.等人，美国国家科学院议事录(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1991)8811465-11469。
已经对TCR与其兼容性(同源)MHC间形成的免疫复合物作相当大量研究意图了解该种免疫复合物。其中一种办法系使用X光晶相学研究复合物的原子层面。参考Garboczi，D.N.等人(1996)自然384134-141，Garcia，K.C.等人(1998)科学2791166-1172，Ding，Y.H.等人(1998)免疫8403-411及Reinherz，E.L.等人(1999)科学2861913-1921。使用这种办法，报告不同的TCRMHC/肽免疫复合物具有类似的结合交互作用特色。这些报告系经过突变发生研究获得证实。参考RabinowitzJ.D.等人(1996)免疫5125-135，Lyons D.S.等人(1996)免疫553-61，BrawleyJ.V.& Concannon P.(1999)免疫学期刊(J.Immunity)1634946-4952，HornellT.M.C.等人(1999)免疫学期刊(J.Immunity)1633217-3225。
这些研究努力进一步提示抗原肽或MHC分子的微小氨基酸变化，可制造MHC/肽复合物，其未能以最理想方式刺激T细胞反应。例如据报告这种复合物为T细胞拮抗剂以及微弱激动剂。某些情况下，抗原肽变化可能导致MHC/肽复合物其可作为T细胞超激动剂。
曾经致力于研究了解T细胞及其同源性MHC/肽间的交互作用、以及可导致刺激T细胞反应的免疫复合物的形成。例如TCRMHC/肽免疫复合物的安定性对于获得最理想T细胞反应有其重要性。多个TCRMHC/肽免疫复合物进行寡聚合反应，对于获得最理想反应也相当重要。参考Lyons D.S.等人(1996)免疫553-61，Cochran，J.R.等人(2000)免疫12241-250。
曾经致力于研究发展使用基于细胞以及基于蛋白质的方案来检测化合物的筛选方法。例如若干筛选方法识别据报告可抑制蛋白质蛋白质交互作用的化合物。参考Tian，S.S.等人(1998)科学281257-259，Kelly T.A.等人(1999)免疫学期刊(J.Immunity)1635173-5177，Jenh，C.H.等人(1998)分析生物化学25647-55。
希望有一种化合物其可调节TCR与其同源MHC间的交互作用。进一步希望有有效方法可用以检测于多种高产出量筛选检定分析兼容的化合物。

发明内容
概略而言本发明涉及调节T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合物(MHC，包括人类HLA)抗原间的交互作用的化合物。一方面本发明涉及TCR与其同源性MHC抗原分子间的交互作用调节化合物的检测方法。
特别发明人发展出特别经过增或减这些分子间形成的免疫复合物的存在而调节TCRMHC抗原交互作用的化合物的检测方法。「调节」一词用于本发明方法，意图表示检测得的化合物较佳用作为免疫复合物的激动剂或拮抗剂，更概括地，作为TCRMHC抗原复合物本身的调节剂。
「MHC抗原」或「MHC抗原分子」用于特异性结合TCR的基于MHC的分子。MHC抗原的MHC组成分系由(但非限制性)典型或非典型MHC Ia类、Ib类或II类分子或MHC同系物组成(参考Maenaka，K & Jones，E.Y.1999，结构分子学流行观点9745-753)。MHC抗原可由(但非限制性)MHC/肽化合物、MHC/超抗原复合物、MHC/脂质(或糖脂质)复合物或同种异体反应性(异种反应性)MHC分子组成。
本发明方法广义言的涉及至少一种TCR分子于有或无至少一种试验化合物存在下与至少一种同源MHC抗原(定义如前)接触。「同源」一词用于特定TCR或MHC抗原分子时，表示作为另一分子的特异性结合对偶的分子。多个具体实施例中，该方法包括至少一个TCR分子以及至少一个同源MHC抗原分子。分子间的典型接触通常系于可促成TCR与MHC抗原分子间的特异性结合的预定条件下进行。该特异性结合通常有助于形成免疫复合物，且于某些情况下有助于稳定复合物。检测可相对于至少一对照显著增或减特异性结合的试验化合物，该对照可于试验化合物通过该方法检测的同时或不同时进行。具有期望活性或多于一种期望活性的化合物可于免疫复合物形成的调节方法识别。如此识别的试验化合物进一步根据本发明方法选择。经过识别而选出的化合物有多项用途，包括用作为试管试验及活体试验多种免疫反应的调节(增或减)剂。这种免疫反应例如包括免疫监视、自体免疫病症、感染、增殖病症如癌症、移植物接受性等。
特别鉴于先前筛选尝试本发明提供多项优势。例如本发明方法全部可与多种TCR及MHC抗原分子兼容。本发明的此项特点的重要性在于其可扩大探针检定分析用于检测试验化合物的用途。举例言之，本发明方法可配合全然可溶性TCR及MHC抗原分子，以及较非可溶性分子，例如表现于细胞表面的分子。如此本发明相当有弹性而可用于较宽多种不同试验计划，例如完全可溶性蛋白、细胞表现膜蛋白、或其组合，包括筛选检定分析，其中分子之一为完全可溶，而分子的另一可由预定细胞表现。截然相反地，先前筛选方法采用较为限制性的筛选检定分析，此处只能使用一种分子类型或少数分子类型。
本发明提供其它优点。例如一具体实施例中，特殊方法使用至少第I类或第II类MHC抗原分子，实施本发明，免除纯化MHC分子的需求，该MHC分子先前载荷以来自抗原提呈细胞(APCs)的紧密结合肽。相反地，先前筛选办法据报告系使用由不同时间密集纯化步骤制备的MHC分子。相反地，本方法与使用较宽多种更容易制造且更容易使用的第I类或第II类MHC抗原分子兼容。例如参考Rhode，P.等人的美国专利第5,869,270号，该案揭示以引用方式并入此处。
此外，多个本方法的具体实施例提供比先前筛选尝试报告更高的敏感度。例如已揭示需要MHC抗原复合物的多价数组来刺激某些TCR表现细胞。换言之报告一价MHC抗原复合物于多种筛选尝试无法作为良好探针。截然相反地，本发明方法可使用一定范围的第I类或第II类MHC抗原分子(包括一价及多价分子)检测试验化合物。参考后文讨论及美国专利第5,869,270号，该案揭示以引用方式并入此处。
此外，先前筛选尝试常注意使用细胞表现的TCR异二聚体作为探针。相信这种办法不必要地造成限制，某些情况下可能对筛选结果造成负面影响。相反地，本发明方法并未限于特定TCR分子或试验版本。反而本发明可与较宽多种TCR分子兼容，有用的TCR分子包括但非限于天然TCRs、完全可溶性TCR分子包括重组单链构成体、以及细胞锚定单链及异二聚体TCR分子。
本发明的额外弹性系由较宽多种MHC抗原分子表现，有用的MHC抗原分子包括天然MHC分子、完全可溶性MHC分子包括(但非限于)单链构成体以及细胞表现作为细胞表面分子的构成体。此外此处称作「空白」MHC分子也可用于本发明。
如此本发明的实施例可实质上增加可测试的TCR及MHC抗原探针分子范围。这种范围大小相当大也显著增加可测试的免疫复合物数目，因而扩大可通过本发明检测、识别以及选择的试验化合物的通用性。相反地，先前筛选尝试只限于一型或少数探针类型，通常为TCR及MHC的异二聚体。相信这种缺陷实质减低于多种检定分析可能检测的化合物数目。
更进一步，先前筛选尝试也常限于仅使用一种或少数限制性方法检测TCRMHC-肽交互作用。典型方法涉及细胞粒化测量相对不敏感且不精确。截然相反地，本发明提供宽广检测该等交互作用的方法，通常系经过监视于有及无试验化合物存在下的免疫复合物检测。更具特异性的检测方法提供TCRMHC抗原交互作用的较为敏感且可靠的指针，该方法可使用直接或间接技术进行。
特别本发明可配合多种检测免疫复合物的方法因而提供显著优势。一项优点为本发明方法更有弹性，可调整适用于多种不同筛选方案。
例如于需要高度敏感性检测免疫复合物的具体实施例中，本发明可用于间接检测方法，例如放大TCRMHC抗原交互作用的典型微弱或间歇信号。另外，于免疫复合物存在下特别强劲的具体实施例中，本发明使用的方法涉及直接检测免疫复合物、其TCR及/或MHC抗原组成分或试验化合物。这种具体实施例用于快速筛选试验化合物的方法特别实用。相反地，如先前筛选报告的TCRMHC-肽交互作用的先前检测方法，较受限制且通常较不敏感，因而减低或甚至丧失检测多种有用试验化合物的机会。
本发明可提供其它优点。
例如本发明之一具体实施例中，一或多种试验化合物调节感兴趣的免疫复合物的能力与多种对照比较。范例对照系检测于无试验化合物存在下的免疫复合物。但某些情况下，试用更精制的对照来选择非特异性影响免疫复合物的试验化合物。特别本发明提供多种偶尔称作为「内部对照」，内部对照可辅助检测试验化合物，具有特异性调节本TCRMHC抗原交互作用的能力。
一具体实施例中，这种内部对照包括本(第一)TCR或MHC抗原分子以及至少一抗体，通常为可与TCR或MHC抗原分子特异性结合的单株抗体。特定感兴趣抗体将结合TCR或MHC抗原分子，该TCR或MHC抗原分子通常位于免疫复合物特异性结合与形成区域外侧。其它特定抗体适当结合且通常为特异性结合与TCR分子紧密结合的CD蛋白质，典型系出现于TCR分子经细胞表现的具体实施例。
前述本发明的例子中，抗体与TCR或MHC抗原分子间形成的复合物于此处称作「对照免疫复合物」等词。形成根据本发明的对照免疫复合物，典型有助于该方法中可检测的反应，例如(但非限于)细胞反应。这种反应可额外或连同(实验性)免疫复合物直接或间接测量，换言之，经过本(第一)TCR与感兴趣的MHC抗原分子间交互作用形成的复合物。特殊试验化合物可调节实验性免疫复合物的形成，但远较少且较好丝毫也未影响对照免疫复合物。
另一具体实施例中，对照免疫复合物包括第二TCR分子及其同源MHC抗原分子，较佳其中第二TCR分子具有与第一TCR分子不同的结合特异性。本发明的本实施例中，特定感兴趣的试验化合物将调节本(第一)TCR与其同源MHC抗原分子间形成的免疫复合物。但试验化合物远较少且较佳丝毫也未影响第二TCR分子与其同源MHC抗原分子间的对照免疫复合物。
如此处讨论，存在有包括所揭示的特定对照免疫复合物的免疫复合物可使用多种检测版本检测，包括仰赖直接或间接技术检测。一或多种内部对照可于试验化合物筛选前、筛选中或筛选后进行。
本发明的具体实施例其中使用一或多种前述对照为较佳，可实现实质优点。例如采用这种对照的方法可提供远较佳的敏感度、选择性及/或可靠度。换言之，其中使用至少一种对照例如前文讨论之内部对照的具体实施例中，存在有对照将有助于辅助试验化合物的检测及选择，例如经过识别非特异性干扰TCRMHC抗原交互作用的试验化合物作检测及选择。本发明的此项特色可改进可特异性调节感兴趣的免疫复合物的试验化合物的筛选。相反地，先前筛选尝试无法经常性提供良好对照，且未知这种尝试是否可提供敏感而可靠的结果。
如此显然易知本发明有高度弹性，适合筛选较宽多种试验化合物。根据本发明的较佳试验化合物具有一或多种期望活性，包括调节本TCRMHC抗原交互作用的能力。
例如于该方法适合检测拮抗剂的具体实施例中，相对于至少一种适当对照，于免疫复合物存在下，适当试验化合物将显示至少约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％及又更佳至少约75％至约100％降低。如此处讨论，该免疫复合物系由本TCR与其同源MHC抗原分子间形成。例如此处讨论，存在有免疫复合物方便使用多种直接及间接检测技术检测。范例对照包括于无试验化合物存在下进行检定分析。另外或此外，对照可为前文叙述以及后文讨论之一或多种内部对照。
但于本发明用以检测激动剂的具体实施例中，采用的检定分析于免疫复合物存在下，相对于至少一种适当对照较佳显示至少约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％以及又更佳至少约75％至约100％高达约500％至约1000％提高。
如此处指示，本发明可用于较宽多种检定分析。例如本发明可用于称作「高产出量」或「超高产出量」类型筛选方法。这种具体实施例中，本发明特别可用于筛选大量试验化合物，包括可调节免疫复合物的特定化合物文库。
此外，本发明方法可组合一或多种活体内筛选计划，以更精确地测定试验化合物调节本TCRMHC-肽交互作用的能力。例如一具体实施例中，本发明用于预先筛选(或同时筛选)用于哺乳类的适当试验化合物，例如已经确知的动物试验模式用来识别影响免疫监视、自体免疫病、感染、增殖病如癌症及/或移植物接受性的该等化合物。于动物体监测的函数变化可为预先存在的函数变化例如遗传上好发变化，或可例如通过化学或手术方式诱发的变化。
显然本发明涵盖多重检测版本(例如试管内及活体内检定分析的组合)以辅助检测高度有用的试验化合物，其可调节TCRMHC抗原交互作用以及特别调节预定免疫复合物的存在。本发明的此项特色大为扩充本发明的弹性，提供有用试验化合物的更特定选择与识别。
通过试管内及/或活体内方法，这种范围宽广的试验可提供额外优点。如此例如，多种方法可用于进行多重分析，因而促进识别试验化合物的效率及机率，该试验化合物可特异性调节免疫复合物且实质上具有治疗能力。本发明的此项特色特别可用于有大量化合物需要测试时，例如当使用高产出量或超高产出量方法时。例如通过标准合成方法包含组合化学操控，然后根据本发明试验可做出试验化合物文库。另外，本发明方法可用于已经可利用的试验化合物，例如小分子、大分子包括商业化学文库的化合物。
如此于一方面，本发明涉及一种识别调节TCRMHC抗原交互作用的化合物的方法。一具体实施例中，该方法包括下列至少一步骤且较佳全部步骤a)第一TCR分子与第I类或第II类MHC抗原分子于有或元至少一种试验化合物存在下接触，该接触系于足够特异性结合TCR与MHC抗原分子成免疫复合物的条件下进行，b)于有以及无试验化合物存在下检测免疫复合物的存在；以及c)选择可变更TCR与MHC抗原分子间特异性结合的试验化合物。较佳该方法进一步包括识别可调节免疫复合物的选定化合物。
该方法之一特殊具体实施例中，本发明提供一种识别试验化合物的筛选方法，筛选试验化合物其可调节包括TCR及其同源MHC抗原的免疫复合物。更特定具体实施例中，该方法包括下列步骤的至少一步骤且较佳全部步骤a)于有或无试验化合物存在下，可表现第一TCR分子的细胞包括T细胞杂交瘤与结合至固体载体的第I类或第II类MHC抗原分子接触，该接触系于足够让TCR与结合MHC抗原分子特异性结合成免疫复合物的条件下进行，b)于有以及无试验化合物存在下，经过测量来自细胞的细胞反应而检测免疫复合物的存在；以及c)选择可变更第一TCR与结合MHC抗原分子间的特异性结合的试验化合物。较佳该方法进一步包括识别选定的化合物可调节免疫复合物。
如此处讨论，本发明方法可用于使用一种策略或组合多种策略筛选期望试验化合物。也如此处讨论，含括一或多个步骤，该步骤可于无试验化合物存在下检测免疫复合物作为对照，如此常极有裨益。但于其中于特定检定分析已知存在有免疫复合物的具体实施例中，若有所需可删除这些步骤。
其它具体实施例中，除了于无试验化合物存在下检测免疫复合物外，对照包括至少一种适当内部对照。于适用至少一内部对照的具体实施例中，该方法通常包括于有以及无试验化合物存在下检测是否存在有对照免疫复合物的步骤。是否包括前述对照的选择系经过使用的TCR及MHC抗原分子、选用的检定分析版本以及要求的敏感度等参数指示。
另一方面，本发明提供医药组合物，其较佳包括通过本方法检测及识别的化合物中的至少一个。这种组合物包括化合物，该化合物可单独作为治疗剂、或可组合一或多种其它已知药剂包括对免疫系统功能具有已知影响的药物使用。
本发明也提供于哺乳类抑制免疫反应的方法。一具体实施例中，该方法包括投予治疗有效量的至少一种此处提供的医药化合物。该方法包括但非限于投予至少一种医药化合物作为唯一活性剂。另一具体实施例中，该方法提供投予至少一种医药化合物组合至少另一种已知药剂，例如已知对免疫系统有疗效的药物。
另一方面，本发明提供实施此处揭示的方法的试剂盒，特别为诊断或研究试剂盒。本发明的特定试剂盒较佳呈包装组合，包括一第一容器其包含至少一种TCR分子或其功能片断；以及一第二容器其包含至少一种MHC抗原分子或其功能片断。根据需要，该试剂盒进一步包括一或多种实施该方法用缓冲液以及使用该试剂盒的指示。以及视情况需要地，试剂盒包括一或多种此处所述对照。一具体实施例中，对照包括至少一种天然、合成或半合成化合物，其具有已知调节经识别的TCR分子与经识别的MHC抗原分子间的特异性结合调节活性；或包括该化合物的功能片段。较佳该化合物可降低特异性结合。
此外，本发明提供包括哺乳类CD3ζ序列的重组TCR分子或其功能片段。一具体实施例中，这种分子为于细胞膜发挥功能的单链构成体。


图1A-B为略图显示多种T细胞受体(TCRs)与同源主要组织兼容性(MHC)肽复合物间的交互作用。
图2为示意图显示本发明的检测试验化合物的方法。本例中，小分子抑制剂抑制TCR/MHC抗原交互作用，且有助于阻断非期望的免疫反应。
图3为示意图显示检测可阻断自体免疫病的试验化合物的基于特定蛋白质的方法。
图4为示意图显示检测可阻断自体免疫病的试验化合物的基于特定细胞的方法。
图5为示意图显示本发明的「原理证明」实施例，其中化学文库系筛选DO11.10TCR与sc-IAd/OVA交互作用抑制剂。
图5B为示意图显示另一本发明的「原理证明」实施例，其中使用高产出量筛选版本来检测DO11.10TCR与sc-IAs/OVA交互作用间的抑制剂。检测得的抑制剂系由比较内部对照的吸光比差异识别。
图6A为示意图显示检测可抑制多发性硬化(MS)的试验化合物的方法的特例。
图6B为示意图显示检测试验化合物的特定方法，该方法中使用高产出量筛选。图中该方法用于检测可抑制多发性硬化(MS)的分子为最理想。
图7A-C为略图显示进行IEk克隆的步骤。图7A图含有各种α及β链片段的基因构成体。图7B带有键联肽的单链IEk分子的构成。图7C包括IEk单链的昆虫细胞表现载体。各图使用的缩写定义于图7C。
图8为SDS-PAGE凝胶的照相代表图，显示于还原(线道1-2)以及未经还原(线道3-4)形式的sc-IAd-IgG分子。线道5显示蛋白质大小标记。线道编号由左至右。
图9为SDS-PAGE凝胶的照相代表图，显示DO11.10sc-TCR-IgG2b融合。线道1显示抗体对照，线道2显示DO11.10scTCR-IgG2b融合蛋白质。
图10为示意图显示本发明的各种TCR-CD3ζ融合构成体。
图11为线图显示萤光活化细胞分类(FACS)实验结果，其中BW5147转移感染株表现各种DO11.10 scTCR-CD3ζ融合构成体，BW5147转移感染株系使用抗-TCR抗体探针染色。
图12A及12B为线图显示BWDZCD4+转移感染株的FACS决定特征。图12A通过FACS检测表面CD4表现。图12B通过FACS检测表面DO11.10scTCR表现。
图13为线图显示通过肽脉冲化抗原提呈细胞(APCs)刺激BWDZCD4+细胞的结果。
图14为线图显示于DO11.10T细胞刺激检定分析抑制IL-2的制造的结果。
图15A及15B为线图显示滴定两种检测得的试验化合物180B10(图15A)及29D11(图15B)的结果。
图16为略图显示范例抑制化合物。
图17A及17B为线图显示通过肽脉冲化APCs刺激DO11.10sc-TCR 2B4转移感染株的结果。图17A显示使用载荷OVA肽A20 APCs的T细胞刺激检定分析。图17B显示使用PCC肽载荷CH12细胞的T细胞刺激检定分析。
图18为线图显示通过NDO APCs刺激DO11.10scTCR 2B4转移感染株的结果。
图19为线图显示经2B4 T细胞杂交瘤转移感染的DO11.10sc-TCR-CD3ζ融合分子的刺激结果。
图20为线图显示使用多价MHC/肽分子染色T细胞。
图21为线图显示HLA-A2/264肽与264sc-TCR-ζ交互作用的ELISA值。
图22A为表格显示基于蛋白质的ELISA检定分析的反应特异性。该信息以线图显示于图22B。
图23A为表格显示蛋白质ELISA的浓度相依性。表中信息以线图显示于图23B。
图24A及24B为线图显示不同TCR反应剂于蛋白质ELISA的比较。线图信息分别显示于图24C及24D。
具体实施例方式
如前文讨论，本发明涉及检测可调节TCR与其同源MHC抗原分子间的交互作用的化合物的方法。特别本发明提供高度有用的检测与识别该化合物的筛选方法。进一步提供通过该方法识别以及选定的化合物、包括至少一种所选试验化合物的医药化合物或医药制剂、以及治疗性使用该等制剂于病人治疗免疫病症的方法。
也如前文讨论，本发明可宽广应用于称作为「高产出量」或「超高产出量」的筛选计划。本发明的具体实施例特别可用于操控与试验大量试验化合物，有关具有优异TCR与MHC抗原间的交互作用的调节能力的化合物。特别通过本发明方法识别的化合物可减少或消除经过非期望的TCR与MHC抗原交互作用所触发的有害免疫反应。另外，这种医药化合物可预防性用以辅助消除病人的免疫病症、降低免疫病症严重程度、或延迟疾病发作时间。患有或怀疑患有免疫病症的特定病人包括出现该病症的「危险性」病人，例如带有预定遗传倾向容易发作这种病症的病人。
已知MHC分子或其抗原(提呈)肽之中等氨基酸变化，即使是保留性氨基酸变化，皆可能提供MHC/肽复合物其就刺激T细胞反应而言为去活化、或可作为拮抗剂、微弱拮抗剂或超激动剂。TCR的类似中等氨基酸变化也改变T细胞对肽及MHC的特异性。例如参考Rabinowitz J.D.等人(1996)免疫5125-135，Brawley J.V.&Concannon P.(1999)免疫学期刊(J.Immunity)1634946-4952，Hornell T.M.C.等人(1999)免疫学期刊(J.Immunity)1633217-3225。用于与MHC抗原复合物或TCR交互作用的化学化合物可变更与同源受体的交互作用，同理可作为T细胞拮抗剂或激动剂。
此外，现行可利用的X-光晶相学研究提示TCR与MHC的保留性支链以及多形性支链间有显著氨基酸交互作用。此外研究提示TCR与肽支链以及MHC以及肽二者的肽骨架间发生交互作用。不欲受任何特定理论所限，相信本发明极为适合检测可影响且特别阻断或促进这些交互作用的化合物。更佳这些化合物可作为试管内及活体内TCR与MHC抗原间形成的免疫复合物的特定拮抗剂或激动剂。
供举例说明但非限制性，图1A-B显示若干主要TCR-肽/MHC交互作用。多项交互作用显示为TCR与MHC抗原分子间的相对低亲和力结合。特别图1A显示一种完整TCRMHC/肽复合物的整体肽骨架结构(右图)，以及肽/MHC组合位置的视图(左图)，TCR的CDRs(带有编号)叠置于MHC/肽结构之上(参考Garboczi，D.N.等人(1996)自然384134-141，Garcia，K.C.等人(1998)科学2791166-1172)。图1B显示不同同源TCRs接触的保留性以及可变MHC残基(参考Garboczi，D.N.&Biddison，W.E.(1999)免疫101-7)。不欲受理论所限，本发明经过检测可调节这些及其它TCR与MHC抗原分子间的低亲和力交互作用的试验化合物而利用这些交互作用。
图1A-B提供的信息有助于了解TCRMHC抗原复合物的多个目标。此项了解辅助本发明检测及识别可调节该等目标的试验化合物。通过该方法检测得的多种化合物可极为特异性的发挥作用，例如以肽特异性、MHC对偶基因特异性、MHC家族特异性或MHC类别特异性方式发挥作用。
此外与TCRMHC抗原复合物交互作用的化合物变更复合物稳定性或变更复合物多元聚合的能力。这些化合物可作为T细胞拮抗剂或激动剂。
如前文说明，一具体实施例中，本发明可检测拮抗T细胞活化的化合物，例如通过特异性MHC对偶基因或MHC家族拮抗T细胞活化。本发明的此项特色提供的优点包括可发展与实现多项治疗计划。这些办法包括治疗免疫病症包括已知自体免疫病的最理想办法。显然已知多种自体免疫病与特异性MHC对偶基因及/或MHC家族有强力遗传关联。如此本发明的另一目的系提供可调整适合特定病人或病人组群，以检测可以MHC对偶基因及/或MHC家族特异性方式调节(例如降低或阻断)TCR与MHC交互作用的试验化合物。
如前述，免疫复合物的形成例如为TCR与MHC抗原分子间出现低亲和力但又有特异性交互作用的复合物数组。这些及其它因素限制该方法用于研究高度亲和力受体-配位子交互作用以及评比TCRMHC抗原复合物的形成的用途。其限制包括敏感性不足、交互作用特异性的决定困难、以及检定分析的变异性大。本发明有多项特色可解决这些限制。如后文更完整讨论，本发明使用适当基于蛋白质及基于细胞的反应剂来提升敏感度，以及降低检定分析检测免疫复合物的形成的变异性。一特定具体实施例中，本发明也包括使用适当内部对照。如后述以及实施例所示，采用非同源TCR或MHC抗原之内部对照，特别可用于评比同源TCRMHC抗原交互作用的特异性。使用本发明的其它内部对照可有利地检测特异性调节TCR与MHC抗原分子间的交互作用的试验化合物。
容后详述，本方法可配合多种TCR及MHC抗原分子。概略言的，适当分子可为天然或重组分子，通常涵盖某个范围的完全可溶或细胞定锚(结合于膜)分子。需强调本发明的此项特色极为要紧，原因在于此项特色例如提供设计以及执行多项不同且有用的筛选计划的架构。此项特色可扩大检测具有重要治疗活性的试验化合物的机会。这种格式的说明例包括基于蛋白质及基于细胞的筛选检定分析，例如前文已述以及后述的筛选检定分析。
「TCR分子」或相关术语(包括复数形式)当用于描述本发明筛选方法使用的分子时，表示天然分子或重组分子，其包括至少部分TCR V-α及V-β链或TCR V-γ或V-δ链直至且包括各链全长。较佳链长足够形成口袋或裂缝，该口袋或裂缝可特异性结合至超抗原、或更佳结合至MHC分子的抗原、或结合至异体反应MHC分子。大部分情况下，TCR分子将经过多个非共价键而结合MHC抗原分子。如特定检定分析版本所需，适当TCR分子可为一价或多价。这种TCR分子的识别方法为已知且包括标准TCR结合试验例如后述试验。
用于本发明的范例TCR分子揭示于审查中的美国专利申请案第08/943,006号，名称「可溶性单链T细胞受体」，申请日1997年10月2日以及08/813,731，名称「包含噬菌体膜衣蛋白质及单链T细胞受体的融合蛋白质」，申请日1997年3月7日；二案揭示以引用方式并入此处。
U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案各别说明多种适合用于本方法的TCR分子及其功能片段。例如适当sc-TCR分子包括V-α及V-β链透过适当肽连接子序列共价键联。特别V-α链透过适当肽连接子序列共价键联至V-β链融合至V-α链C端以及V-β链N端。Sc-TCR融合蛋白质的V-α及V-β链通常长约200至400氨基酸且较佳约300至350氨基酸，至少有90％且较佳100％与天然TCR的V-α及V-β链相同。「相同」一词表示V-α或V-β链的氨基酸系百分的百类似对应天然TCR的V-α或V-β链。
如U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案揭示，若有所需，sc-TCR分子的V-β链可进一步包括一个C-β链或其片段融合至V-β链C端。此外，V-α链可包括一个C-α链或其片段融合至V-αC端或肽连接子序列N端。通常于该等包括C-β链片段的融合蛋白质，片段长约50至126氨基酸，且通常不包括位置127的最末半胱胺酸残基。对于包含C-α链的融合蛋白质，长度可于约1至90氨基酸间改变(换言之C-α链长达但不含最末半胱胺酸)。例如一具体实施例中，融合蛋白质包括长度约1至72个氨基酸的C-α链片段，始于氨基酸1至72。另一具体实施例中，C-α链片段长度约1至22个氨基酸，始于第一氨基酸至22(白胺酸)。C-α链片段典型不含半胱胺酸残基，但C∝90变异株包括二个半胱胺酸残基。
如U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案揭示，为了有助于表现完全可溶性功能蛋白质，Ig-CL链或适当Ig-CL片段共价键联至sc-TCR分子，例如共价键联至V-β链或C-β链片段C端。虽然典型并不佳，但可共价键联Ig-CL或其片段至V-α链N端。大半案例中，Cα及Cβ链长度的选择系由若干参数指导，指导参数包括选用的特定V链以及可溶性融合分子的预定用途。
其它本发明的sc-TCR蛋白质包括但非限于有二个肽连接子序列的sc-TCR蛋白质，此处第一肽连接子序列系融合于V-α链C端与V-β链N端间。V-β链C端系融合至C-β链片段N端。然后第二肽连接子系融合至V-β链或C-β链片段C端以及例如Ig-CL链或Ig-CL链片段或效应物或标记分子N端。
其它范例具体实施例中，sc-TCR蛋白质的制造方式系经过V-β链透过适当肽连接子融合至V-α链，其中V-β链或其C-β链片段C端与V-α链N端共价键联。若有所需，Ig-CL链或片段可共价键联至分子的C端或N端，但通常联结于C端为佳。
sc-TCR蛋白质的肽连接子序列典型系选择sc-TCR分子形成一个结合位置，该结合位置类似天然TCR V-α及V-β链的结合位置。Vα及Vβ链可衍生自未经诱导的T细胞，但大部分情况下V链与病理例如免疫相关病症或疾病有关。
特佳连接子序列已经揭示于U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案。
供举例说明，分开Vα，β链的肽连接子序列于口袋中弹性定位V链，可特异性结合配位子(例如期望的MHC抗原)。例如结合至sc-TCR融合蛋白质的配位子可用以调节T细胞活性，如前文引述的U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案所述的检定分析测定。Ig-CL链或Ig-CL链片段融合至sc-TCR分子于某些方案可提高检定分析性能，例如经过辅助sc-TCRs的可溶性表现且维持sc-TCR于水溶液(例如细胞培养基)的完整性而提高检定分析性能。
如前文以及U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案讨论，若有所需，本发明sc-TCR融合蛋白质可包括共价键联Ig-CL链或适当Ig-CL链片段例如键联至sc-TCR分子C端。一具体实施例中，sc-TCR融合蛋白质包括融合哺乳类Ig-CL链，且较佳为全长鼠或人Ig-CL链(例如Cκ链)。已经揭示若干Ig-CL链的核酸及蛋白质序列。例如参考基础免疫学(1993年)第3版，W.Paul编辑芮森出版公司，纽约；以及Kabat，E.A.等人，(1991年)免疫学感兴趣的蛋白质序列(第5版)公共卫生服务，美国国家卫生院。
Ig-CL链一词也表示包括免疫球蛋白轻链恒定区，该Ig-CL链与所揭示的全长序列差异为一或多个氨基酸取代或加成。例如氨基酸可通过习知重组方法加成至所揭示的Ig-CL链序列的链一端或二端。此外，若有所需，重组方法可用以替代链中的指定氨基酸。通常氨基酸的加成包括约1至30个中性或亲水性氨基酸，且较佳约1至10个这种氨基酸。Ig-CL链中一个氨基酸取代另一个氨基酸将为保留性或非保留性氨基酸置换。如此Ig-CL链序列酪胺酸氨基酸以苯基丙胺酸取代为保留性氨基酸取代范例，而精胺酸以丙胺酸置换表示非保留性氨基酸取代范例。如后文对Ig-CL链片段指出，包含融合Ig-CL链的sc-TCR融合蛋白质全然可溶且有功能。
本方法若干具体实施例中，使用Ig-CL链片段例如鼠或人Cκ链片段有用。例如当希望减低融合蛋白质分子量时，适当Ig-CL链片段可融合至sc-TCR分子。「适当Ig-CL链片段」一词或相关术语表示Ig-CL片段，其当融合至预定sc-TCR分子时将形成全然可溶的功能性sc-TCR融合蛋白质，定义如后。期望的Ig-CL链片段(包括Cκ型及Cλ型)可根据标准重组法制造，例如经过PCR扩大鼠或人Cκ型或Cλ链片段，接着接合PCR产物至编码期望sc-TCR分子的DNA节段或区段。如后述，PCR产物可经操控而包括限剪酶裂解位置以有助于克隆。通常适当鼠或人Cκ链片段长约70至150，较佳约90至120及更佳约100至110氨基酸。适当鼠或人Cκ链DNA序列范例揭示如后。参考后文实施例5、6及7。
U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案揭示的较佳sc-TCR蛋白质全然有功能且可溶。「全然有功能」等类似术语表示融合蛋白质特异性结合配位子以及特别结合MHC抗原。检测这种特异性结合的检定分析揭示于此处，包括标准免疫斑点技术如西方斑点技术。
「特异性结合」等类似术语用于此处描述抗体与抗原间的结合。抗体(较佳为单株抗体)结合抗原形成特异性结合对。典型地抗体不会识别以及结合至其它分子，如西方斑点、ELISA、RIA、凝胶移动性位移检定分析、酶免疫检定分析、竞争检定分析、饱和检定分析或其它适当蛋白质结合检定分析测定证实。
「特异性免疫复合物」等类似术语用于此处表示结合对，其包括特异性TCR分子及其同源MHC抗原分子。特异性免疫复合物包括一型抗原分子或多于一型抗原分子，但各类型抗原分子皆有助于形成特异性结合对(换言之TCR抗原MHC分子)。
检测特异性免疫复合物的方法为已知且将依据本发明的期望用途改变。例如于大致不含细胞的版本(换言之基于蛋白质-蛋白质)的筛选具体实施例中，较佳方法包括西方斑点、ELISA、RIA、凝胶移动性位移检定分析、酶免疫检定分析、竞争检定分析、饱和检定分析或其它适当蛋白质结合检定分析。本发明基于细胞的具体实施例中，包括使用一或多种细胞反应来识别候选化合物的筛选方法，检测得该等反应表示形成特异性免疫复合物的指针。适当细胞反应范例以及包括细胞因子的制造，特别由T细胞制造细胞因子范例提供如后。
U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案揭示的sc-TCR融合蛋白质包含方便易得实质上全长编码序列的Vα，β链。由细胞来源获得全长TCR V链序列的方法为众所周知。另外，Vα，β链区可经过PCR扩大公开取得的Vα，β链(其至少部分序列为已知)获得。范例Vβ基因序列包括Vβ8.1、Vβ6.1、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ2.1及Vβ2.3基因序列。参考Abe等人(1992)PNAS(USA)894066；Wang等人(1993)；PNAS(USA)90188；Lahesma等人(1993)免疫学期刊(J.Immunity)1504125；Kotzin等人(1991)PNAS(USA)889161；Uematsu等人(1991)PNAS(USA)888534。也参考Kabat，E.A.等人(参见上文)及Chotia，C.等人(1988)EMBO J.73745有关其它TCR V链序列。
特别U.S.S.N.08/943,006申请案的实施例3及第7及8提供PCR扩大多种V-α及V-β链的寡核苷酸引子。
如U.S.S.N.08/943,006申请案特别揭示，范例sc-TCR融合蛋白质通常系通过DNA节段编码，该DNA节段包括序列中共价键联激活基因/先导子序列/V-α链/单链连接子序列/V-β链/Cκ链；激活基因/先导子序列/V-α链/单链连接子序列/V-β链，C-β链片段/Cκ链；激活基因/先导子序列/V-α链，C-α链/单链连接子序列/V-β链/Cκ链；或激活基因/先导子序列/V-α链，C-α链片段/单链连接子序列/V-β链，C-β链片段/Cκ链。范例sc-TCR分子系如前述，但Cκ链未由DNA节段编码。编码sc-TCR蛋白质的DNA区段被导入期望细胞，包括此处揭示的特异性表现系统用以可溶性表现融合蛋白质。
制造及使用sc-TCR分子的更特定区段教示于U.S.S.N.08/943,006及08/813,731申请案。
本发明方法可兼容使用其它TCR分子，包括异二聚体版本的TCR分子。这些分子例如包括共价键联至免疫球蛋白恒定区的TCR V链。参考例如Gregoire，C.等人(1991)PNAS，88，8077(报告如何制造及使用异二聚体αβTCR链，其包括Cα，Vα序列接合至κ轻链C区(Cκ链))。该参考文献也揭示VβCβCκ序列。也参考Weber，S.等人(1992)自然，356793。
也参考下述参考文献有关如何制造及使用其它sc-TCR分子用于本发明。Novotny，J.等人PNAS(USA)88，8646(1991)；Soo Hoo，W.F.等人PNAS(USA)89，4759(1992)；Wülfing，C.等人以及Plückthun，A.，分子生物学期刊242，655(1994)；Kurucz，I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；PCT WO96/13593；Ward，E.S.等人，分子生物学期刊224，885，(1992)；Schlueter，C.J.等人，分子生物学期刊256，859(1996)；Mariuzza，R.A.及Winter，G.(1989)2647310；Gascoigne，N.R.J.等人，PNAS(USA)(1987)，842936。
较佳根据本发明使用的TCR分子有足够大小以允许TCR特异性结合至MHC抗原。于MHC抗原为肽-MHC分子的具体实施例中，TCR分子含有至少CDR结合回路形成MHC-肽结合口袋。V有用的含MHC-肽结合口袋的α/βTCR分子较佳系由至少α链可变领域(依据α链的CDR长度而定，约氨基酸1至约氨基酸110至约130)以及β链可变领域(依据V-β链的CDR长度而定，约氨基酸1至约氨基酸110至约130)组成。
用于本发明的更佳TCR分子有显著结合活性，于标准TCR结合试验指示。较佳，TCR分子特异性结合其同源MHC抗原分子至相对于适当对照，至少约50％，较佳至少约80％且更佳至少约90％至99％的程度。适当对照例如包括天然TCR分子(换言之野生型异二聚体)或重组TCR。大半情况下，对照为全然可溶的重组TCR，且较佳为可溶性单链TCR。
这种检定分析中，TCR与经制动的MHC抗原的交互作用系使用BIA核心(BIAcore)2000系统(BIA核心公司)通过表面质粒基因体共振(SPR)监视。典型地，约500-5000共振单位(RU)MHC抗原通过标准NHS/EDC偶合化学偶合至BIA核心CM5芯片。本TCR与对照TCR(于PBS)以10-50微升/分钟流速分开注入MHC抗原表面上。施行多次注入，其中各次TCR浓度于2μM至20μM的范围。基于SPR结合曲线，使用BIA评比2.1软件(BIA核心公司)进行速率常数分析。计算所得对照TCRMHC抗原交互作用的结合与解离速率常数、亲和常数及半生期取作100％。
「MHC抗原」一词或相关术语包括本发明筛选方法使用的复数形系就特异性结合TCR的基于MHC的分子使用。MHC抗原的组成(但非限于)为MHC/肽复合物、MHC/超抗原复合物、MHC/脂质(或糖脂质)复合物或同种异体反应性(异种反应性)MHC分子。MHC抗原的组成分包含但非限于典型或非典型MHC Ia类、Ib类或II类分子或MHC同系物(包括人类HLA分子)(参考Maenaka，K&Jones，E.Y.1999。结构生物学流行观点9745-756)。用于本发明筛选方法的MHC组成分表示天然分子或重组分子，其包含至少部分MHC链至(且含)各链全长。一具体实施例中，这些链足够形成肽(或脂质)结合沟或裂缝，该结合沟或裂缝可特异性结合提呈肽(或脂质)。根据本发明，提呈肽系透过稳定轻键，非共价键结至「空白」MHC组成分的肽结合沟。这种复合物常称作为「载荷」。又根据本发明，MHC抗原分子可包括共价键联(换言之融合)提呈肽，例如第I类及第II类分子，揭示于美国专利第5,869,270号；该案揭示以引用方式并入此处。用于本发明的适当MHC抗原分子可为一价或多价，说明如后。于MHC组成分为天然或重组第I类分子的具体实施例中，MHC抗原分子可进一步包括天然或重组β2-微球蛋白分子。
另一具体实施例中，MHC抗原分子可由天然或重组分子组成，该天然或重组分子包括至少部分MHC链及超抗原链直至且含各链全长。这些链足够形成MHC/超抗原复合物。超抗原为可利用特定V基因节段结合至TCRs的蛋白质，而与TCR其它部分无关。参考Kotzin，B.L.等人(1993)先进免疫学5499-166。较佳本发明的超抗原包括Mls抗原、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、SPE-A、SPE-B、SPEC、ExFT及TSST。
另一具体实施例中，MHC抗原分子可由天然或重组分子组成，该分子包括至少部分同种异体反应性(异种反应性)MHC链直至且含各链全长。这些链足够形成同种异体反应性MHC复合物。同种异体MHC分子为非自我MHC分子，该分子经过(自我)T细胞识别为外来分子。TCR结合至同种异体反应性MHC分子可能与特定肽抗原结合至MHC分子相关或不相关。参考Obst，R.等人(2000)实验医学期刊191805-812。
第I类分子为整合膜蛋白质，包含一种糖蛋白重链其有三个胞外领域(换言之α1、α2及α3)、一个跨膜区域以及一个胞质领域。重链系非共价结合可溶性亚单元β2-微球蛋白。重链的α1及α2领域共同折叠而形成肽结合沟。重链与β2-微球蛋白结合有助于稳定肽结合沟。于其中MHC组成分为第I类分子的具体实施例中，MHC组成分可由天然或重组第I类重链(或其片段)与天然或重组β2-微球蛋白分子(或其片段)的任一种组合组成。其它本发明中，MHC组成分可由第I类重链的单链构成体(或其片段)与β2-微球蛋白(或其片段)组成。本发明的MHC组成分可由第I类重链及/或β2-微球蛋白的任何片段(呈任一种分子排列)组成，该片段足够允许形成功能MHC抗原(换言之可与TCR特异性交互作用的MHC抗原)。本发明的MHC组成分也可由嵌合体分子组成，该嵌合体分子包含第II类链、第I类重链及/或β2-微球蛋白的足以允许功能MHC抗原形成的任何片段(呈任一种分子排列)组成。
适合用于本发明的其它MHC抗原分子系揭示于美国专利申请案第08/776,084号，名称「MHC复合物及其用途」，申请日1997年1月17日，该案系基于PCT申请案PCT/US95/09816且为美国专利申请案第08/382,454号，申请日1995年2月1日的连续案；该申请案为美国专利申请案第08/283,302号，申请日1994年7月29日的连续案；各案揭示以引用方式并入此处。
特别于08/776,084、PCT/US95/09816、08/382,454及08/283,302号专利申请案揭示适合用于本发明的多种异二聚体MHC分子(第I类及第II类。也参考McCluskey，J.等人免疫学期刊(J.Immunity)1411451；PCT/US92/10030；及Kappler及Marrack的美国专利第5,820,866号(揭示其它第I类及第II类MHC分子)；其揭示以引用方式并入此处。
其它适当MHC抗原分子揭示于美国专利申请案第08/960190号，名称「可溶性MHC复合物及其用法」，申请日1997年10月29日、PCT WO 96/04314及PCT97/28191；其揭示以引用方式并入此处。
简言之，该等申请案揭示适合用于本发明的高度有用的单链(「sc-」)MHC第I类及第II类复合物。特别揭示sc-MHC与重组融合提呈肽的第I类及第II类复合物(称作sc-MHC肽融合分子)、空白sc-MHC分子(表示不含重组融合提呈肽)、以及经载荷的sc-MHC复合物(表示包含非共价附着的提呈肽)。
更特别于08/960,190、PCT WO 96/04314及PCT97/28191申请案揭示如何制造与使用带有经修饰的第II类β2链及/或经融合的Ig-CL链的sc-MHC分子、或提供适当Ig-CL链片段。也报告称作为「多重特异性」MHC复合物其带有或未带有经修饰的第II类β2链及/或经融合的Ig-CL链或Ig-CL链片段。
也参考Rhode，P.等人的美国专利第5,869,270号(揭示用于本发明的其它较佳sc-MHC分子)；其揭示以引用方式并入此处。
用于本发明的特定MHC抗原分子含有有足够大小允许MHC抗原特异性结合至TCR的MHC组成分。于MHC抗原为肽-MHC分子的具体实施例中，MHC组成分含有至少一个肽结合沟。含肽结合沟的有用第II类MHC组成分至少系由第II类α1领域(约α链氨基酸1至约氨基酸84)与β1领域(约β链氨基酸1至约氨基酸95)组成。含有肽结合沟的有用的第I类MHC组成分至少系由第I类α1及α2领域(重链的约氨基酸1至约氨基酸182)组成。于MHC抗原为同种异体反应性MHC分子的具体实施例中，MHC组成分至少含有同种异体反应性MHC决定子，若同种异体反应性系与肽有相依性，则MHC组成分含有肽结合沟。同种异体反应性MHC决定子的性质以及对肽的相依性系依据TCR的特异性决定，可经过实验决定。参考Obst，R.等人(2000)实验医学期刊191805-812。于MHC抗原为超抗原-MHC复合物的具体实施例中，MHC组成分至少含有超抗原结合位置。MHC组成分的超抗原结合位置位在肽结合沟外侧，且随超抗原组成分而异。参考Kotzin，B.L.等人(1993)先进免疫学5499-166。适当MHC抗原分子的识别方法包括后述标准MHC抗原结合试验。
用于本发明的更佳MHC抗原分子于所谓的标准MHC抗原结合试验具有显著结合活性。较佳，MHC抗原分子可特异性结合其同源TCR分子至高达适当对照的至少约70％，较佳至少约80％且更佳至少约90％至99％。适当对照例如包括天然MHC抗原分子(换言之呈野生型异二聚体形式)或重组MHC抗原分子。大部分情况下，对照为全然可溶的重组MHC抗原分子，且较佳为可溶性单链MHC抗原分子。这种分子的制法及用法完全说明于前文，包括说明于美国专利第5,869,270号。
这种检定分析中，MHC抗原与经制动的TCR的交互作用系使用BIA核心2000系统(BIA核心公司)通过表面质粒基因体共振(SPR)监视。典型地，约500-5000共振单位(RU)TCR通过标准NHS/EDC偶合化学偶合至BIA核心CM5芯片。本MHC抗原与对照MHC抗原以10-50微升/分钟于TCR表面流速分开注入于PBS。施行多次注入，其中各次MHC抗原浓度于2μM至20μM的范围。基于SPR结合曲线，使用BIA评比2.1软件(BIA核心公司)进行速率常数分析。计算所得对照TCRMHC抗原交互作用的结合与解离速率常数、亲和常数及半生期取作为100％。
如此处讨论，某些本发明具体实施例中，可使用包括脂质、糖脂质、同种异体反应性、异种反应性及/或超抗原组成分的MHC分子。
于MHC/脂质及糖脂质分子令人感兴趣的具体实施例中，有一类仿MHC第I类分子家族可用于本发明。该家族的较佳成员称作为CD1家族。了解此特定家族可提呈细菌性脂质抗原给T细胞。这种复合物的特例包括CD1c/己糖基-1-磷代异戊间二烯、CD1c/甘露糖基-β1-磷代扁豆醇、CD1b/脂阿拉伯糖基甘露聚糖、CD1b/霉菌酸脂质。概略参考Moody DB等人(1999)免疫学综论172285-96及其中揭示的参考文献。
用于本发明的特定同种异体MHC分子包括几乎任一种存在于器官或组织移植物的人类MHC分子。较佳该分子未由宿主共享(结果导致宿主-相对于-移植物T细胞反应)，或存在于宿主的任何MHC分子未由移植物共享(结果导致移植物-相对于-宿主T细胞反应)。通常移植物的存活最主要系仰赖降低对MHC第II类抗原的同种异体反应性反应。更为特定同种异体反应性MHC分子包括主要出现于白种人的MHC分子例如HLA-A1、HLA-A2、HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DQ6、HLA-DQ7及HLA-DQ8。概略参考细胞与分子免疫学第3版Abbas、Lichtman、Pober、Abbas及Schmitt，伟伯桑德斯(W.B.Saunders)公司，费城，1997年。
此外可使用多种异种反应性MHC分子于本发明，包括异种移植物MHC分子。更特定范例包括猪异种移植物器官移植的猪MHC分子、人MHC分子对异种移植物T细胞的反应。较佳人MHC分子包括上列MHC分子。较佳猪MHC分子包括SLA-1至-6、SLA-DR及SLA-DQ分子。概略参考Chardon P，等人(1999)免疫学综论167179-92及其中引述的参考文献。
其它可用于本发明的有用TCR分子及MHC抗原分子揭示于后文实施例一节。
另一方面，本发明提供通过此处提供方法检测与识别的适当试验化合物。
如此处讨论，本发明的实施可检测试验化合物，该试验化合物于蛋白质蛋白质、蛋白质细胞或细胞细胞检定分析中可调节TCR与MHC抗原分子间的交互作用。也如此处讨论，若有所需可直接或间接测定相关TCR与MHC抗原交互作用，通常系经过结果形成的免疫复合物检测。
特定本发明方法设计用来检测及识别可与TCR分子交互作用(例如结合至)TCR分子的试验化合物。「交互作用」一词表示包括但非限于TCR分子的胞外领域(ECD-TCR)或胞质领域(CD-TCR)。较佳交互作用出现于或接近于负责特异性结合至同源MHC抗原分子的结合位置、口袋或裂缝。如此特别感兴趣的试验化合物将与TCR口袋或裂缝交互作用，其可结合至适当MHC分子的超抗原或肽抗原、或结合至同种异体反应性MHC分子。
也设计其它方法用来识别可与MHC抗原分子交互作用(或结合)的化合物。如此用于MHC抗原分子的「交互作用」包括但非限于MHC分子、肽抗原或超抗原的胞外领域(ECD-MHC)或胞质领域(CD-MHC)。较佳交互作用将出现于或接近于影响与TCR分子特异性结合的MHC肽(或脂质)结合沟及其它位置。更特别化合物常与MHC肽结合沟或接近该MHC肽结合沟交互作用。
也设计其它方法来识别可与TCRMHC抗原复合物交互作用(或结合)的化合物。如此，TCRMHC抗原复合物中的「交互作用」一词包括但非限于ECD-TCR、CD-TCR、ECD-MHC、CD-MHC、肽抗原或超抗原。较佳交互作用将出现于或接近影响复合物稳定性位置，或出现于或接近影响复合物形成多元体的能力的位置。
用于本发明筛选方法的适当试验化合物包括但非限于可结合至TCR分子、MHC抗原分子或二者的肽、多肽、抗体及其片段及其它有机化合物(例如拟肽及非拟肽)；以及仿真TCR与MHC抗原分子间的特异性结合触发活性的化合物(换言之促效化合物)、或抑制触发活性的化合物(换言之拮抗化合物)；以及可增或减期望TCR分子与其同源MHC抗原分子间的特异性结合的肽、抗体或其片段及其它有机或无机化合物。
这些化合物特别包括但非限于例如可溶性肽等肽，包括但非限于随机肽文库成员(例如参考Lam，K.S.等人，1991，自然35482-84；Houghten，R.等人，1991，自然35484-86)以及D-及/或L-组态氨基酸、磷肽组成的组合化学衍生分子文库(包括但非限于随机或部分简并性针对磷肽文库成员；参考例如Songyang，Z.等人，1993，细胞72767-778)。也意图包含包括或由抗体组成的化合物(包括但非限于多株、单株、人化、抗特应型、嵌合体或单链抗体以及Fab、F(ab’)2及Fab表现文库片段及其抗原决定部位结合片段)，以及小、中及大有机或无机分子。例如参考美国专利第5,980,892号。
有关适合用于本发明的多种分子文库的制法及用法的揭示可参考美国专利案6,001579(标记编码组合文库)；5,573,905(编码组合文库)；5,639,603(多样化分子文库)；5,880,972(制造组合化学文库的方法及装置)；其揭示以引用方式并入此处。也参考Nielsen，J.等人(1993)美国化学会1159812；Brenner，S.及R.Lerner(1992)PNAS(USA)895381-5383；以及Pinella，C.等人(1992)生物技术13901。也参考EPO公开案第0 432 691 A1号(揭示某些结合MHC分子的肽)。
另外或此外，多种有用的化学文库可得自商业供货商例如坎伯里(Chembridge)、奥克雷(ArQule)、康毕坎(CombiChem)、法马考培(Pharmacopeia)、萃嘉(Trega)生物药品公司及萃博(Tripos)。
但某些情况下，可能需要更集中目标筛选试验化合物。多数例中，使用标准计算机及搜寻技术预先识别候选化合物以及操控先前识别的化合物。如此这些化合物可「预先筛选」其调变指定TCR与MHC抗原分子间的交互作用的能力。这种「预先筛选」候选化合物可通过进行下列概略步骤达成1.例如发现这种TCR与MHC抗原分子可特异性交互作用而形成免疫复合物，其活性位置或活性区经过识别。此活性位置典型为配位子结合位置例如TCR分子、MHC抗原分子；或两种分子的交互作用领域。活性位置可使用标准方法识别，包括例如由决定TCR或MHC抗原多肽链的氨基酸序列特征识别，或由研究TCR与其同源MHC抗原的复合物识别。前述情况下，比较其它TCR或MHC抗原分子的已知活性位置的序列同系，可用来找出活性位置。后述情况下，突变、化学或C光晶相学方法可用来寻找TCR或MHC抗原上何处出现同源配位子而找到活性位置。
2.其次，测定活性位置的三度空间几何结构。三度空间可通过已知方法测定，包括X光晶相学方法，其可决定原子层面的几乎完整分子结构。它方面，固相或液相NMR可用以决定某些分子内距离。任何其它测定结构的试验方法皆可用来获得部分或全部几何结构。几何结构可使用天然或人工复合配位子测定，其可提高测定的活性位置结构的准确度。
若测定结构不完全或未充分准确，则必须使用基于计算机的数值模式化方法来完成结构或改善结构准确度。几乎任一种已知的模式化方法皆可使用，包括特殊生物聚合物(例如蛋白质或核酸)的特定参数化模式；基于运算分子运动的分子动力学模式、基于热效果的统计技巧模式、或组合模式。用于大半模式类别，经常需要标准分子力场，表示组成原子与基团间的作用力，而可选自物理化学已知的力场。不完全或较不准确的实验结构可作为通过这种模式方法运算所得全部及更准确结构的限制。
3.最后已经经实验、通过模式化、或通过组合方法测定活性位置结构，经过搜寻含化合物的数据库连同搜寻分子结构信息，可识别候选调节化合物。这种搜寻系找出化合物，该化合物的结构是可匹配测定的活性位置结构，且可与界定活性位置的基团交互作用。这种搜寻可为人工搜寻，但较佳通过计算机辅助搜寻。由搜寻找出的化合物可视为可调节TCRMHC抗原交互作用的化合物。
另外，这些方法可用以由已知的调节化合物识别经改良的调节化合物。已知化合物的组成可经修改，修改的结构效果可使用前述实验及计算机模式化方法应用至新组成测定。然后变更后的结构与化合物活性位置结构比较，决定匹配或交互作用结果是否改善。通过此方式，可快速评估组成的系统性变化，例如改变分支基(如甲基、羟基、羰基、羧基、氢等)评估而获得具有改良特异性或活性的经修饰的调节化合物或配位子。
分子模式化系统例如包括但非限于CHARMM及QUANTA程序(波丽金(Polygen)公司，麻省沃坦)。CHARMM执行能量减低及分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的组成、图形模式化及分析。QUANTA允许分子彼此间的交互作用组成、修饰、可目视及行为分析。参考后文参考文献有关化合物计算机模式化的揭示，该化合物例如可与特定抗原交互作用的药物Rotivinen等人，1988，Acta PharmaceuticalFennica 97159-166；Ripka，新科学家54-57(Jun.16，1988)；McKinaly及Rossmann，1989，药理与毒物学的年度综论29111-122；Perry及Davies，OSAR药物设计的定量结构-活性关系，第189-193页(Alan R.Liss公司，1989年)；以及Lewis及Dean，1989 Proc.R.Soc.Lond.236125-140及141-162。
其它可筛选且以图形说明化学品的计算机程序可得自下列公司例如生物设计(BioDesign)公司(加州帕萨迪那)、亚勒立司(Allelix)公司(加拿大安大略省密西索加)及超立体(Hypercube)公司(安大略省剑桥)。虽然这些计算机程序主要系设计应用于特殊蛋白质的特异性药物，但原则上可适合用于设计可调节TCR与MHC抗原交互作用的药物。然后这些药物进一步根据本发明方法筛选。
虽然前述计算机辅助方法可用于若干本发明具体实施例「预先筛选」候选化合物，但经常希望将本方法用于已知候选化合物文库。另外，根据已确立的程序可制造及使用高度有用的化学文库。这些文库包括但非限于天然产物或合成化学品以及生物活性材料，包括氨基酸(含经修饰的氨基酸)、肽、多肽及蛋白质。这种文库作为丰富的候选化合物来源，该候选化合物可选用以识别TCR与MHC抗原分子间的交互作用作为拮抗剂或激动剂的化合物。概略参考Drews J.(2000)科学2871960-1964，Schreiber S.L.(2000)科学2871964-1969。
本发明的最理想实务通常涉及使用可接受的试管试验检测版本，该检测版本视情况需要可为直接或间接检测。较佳检测版本系设计用以检测可与本TCR分子、MHC抗原分子或二者交互作用(或结合)的化合物。这种检测版本通常监视且较佳定量于有及无试验化合物存在下出现的免疫复合物。
如此处所述，本发明可与检测免疫复合物的版本之一或版本组合兼容。例如根据已确立的直接或间接检测原理，可存在免疫复合物(或甚至对照免疫复合物之一)。本发明领域的熟谙技艺人士经过此处提供的导引，偶尔经过中等例行实验，将可决定用于特定TCR与MHC抗原分子组合的操作条件以及最理想检定分析条件。
至于特定版本，检测是否存在有免疫复合物之一种方式系以可检测方式标示可特异性结合复合物的抗体。标示例如将抗体(通常为单株抗体)联结至酶且使用可检测的标示抗体进行酶免疫检定分析(EIA)。参考Voller，A.「酶联结免疫检定分析(ELISA)」，1978，诊断视界21-7，微生物协会季报，Walkersville，Md.；Voller，A.等人，1978，临床病理期刊31507-520；Butler，J.E.，1981，酶学方法73482-523；Maggio，E.(编辑)1980，酶免疫检定分析，CRC出版社，佛罗里达州波卡雷顿，Ishikawa，E.等人(编辑)，1981年，酶免疫检定分析(东京科学社)。
也参考Harlow及Lane(编辑)抗体实验室手册1988年，冷泉港实验室，纽约；以及Bishop，G.A.等人(1992)生物技术12326-330(揭示供检测细胞表面物质用的细胞ELISA)；及Kelly，T.A.等人(1999)免疫学期刊(J.Immunity)5173-5177；其揭示以引用方式并入此处。
本检测方法具体实施例中，结合至抗体的酶将与适当基质且较佳为产色基质交互作用，因而制造例如可通过光谱术、萤光术或目测手段检测的化学部分。可用于检测标示抗体的酶包括但非限于苹果酸去氢酶、葡萄球菌核酸切割酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇去氢酶、α糖基磷酸去氢酶、参糖磷酸异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖 酶、核糖核酸酶、尿素酶、催化酶、葡萄糖-6-磷酸去氢酶、葡萄糖淀粉酶及乙酰胆碱酯酶。检测可通过比色法达成，比色法系利用该酶的产色酶基质。检测也可通过目测比对达成，目测比较酶基质的酶反应程度而与以类似方式制备的标准品作比较。
使用多种其它免疫检定分析的任一种也可获得良好检测。例如经过发射性标示可特异性结合免疫复合物的抗体或抗体片段，于本发明方法经过使用放射性免疫检定分析(RIA)可检测TCRMHC抗原交互作用(例如参考Weintraub，B.，放射性免疫检定分析原理，放射性配位子检定分析技术第七期训练课程，内分泌学会，1986年3月，以引用方式并入此处)。放射性同位素可利用珈玛计数器或闪烁计数器或自动放射性摄影等手段检测。
又可使用萤光化合物标示抗体或抗体片段。当经过萤光标示的抗体或片段暴露于有适当波长光时，抗体的存在可通过萤光检测。最常用的萤光标示化合物为萤光素异硫氰酸酯、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻青蛋白、邻 醛(phthaldehyde)及萤光胺。
此外抗体或抗体片段可使用发射萤光金属例如152Eu或镧系元素的其它金属作检测性标示。这些金属可使用金属螯合基例如二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)或伸乙基二胺四乙酸(EDTA)附接至抗体。
例如参考派克(Packard)仪器公司提供的使用有用于检定分析开发及高产出量筛选的HTRF(均质时间解析萤光)抗体试剂。也参考美国专利第4,568,649号；EPO 0154734及日本专利申请案第84，52452号；其揭示以引用方式并入此处。
其它以可检测方式标示抗体或抗体片段的方法为业界人士众所周知。例如抗体经过耦合至化学发光化合物而作可检测标示。然后经过检测化学反应过程中出现的发光，而测定经过化学发光标示抗体的存在。特别有用的化学发光标示化合物例如为苯巴比妥、异苯巴比妥、热吖啶(acridinium)酯、咪唑、吖啶盐(acridinium)、金刚烷基二氧丁环、二甲基噻吩衍生物及草酸酯。此外抗体或其片段也可使用光敏化剂化合物作可检测性标示。例如参考美国专利第5,807,675号及其中引用的参考文献。
也包含部分或全部基于分子的生物素化检测版本，使用链丝菌抗生物素或其结合物来目测观察生物素化分子。这种版本的更特定范例举出于下列实施例。
同理，生物发光化合物可用来以可检测方式标示抗体或抗体片段用来检测免疫复合物的存在。生物发光属于于生物系统出现的化学发光类型，其中催化蛋白可提高化学发光反应效率。生物发光蛋白的存在系经过检测亮度的存在而测定。标示用的重要生物发光化合物有虫萤光素、虫萤光素酶及水生萤光素(aequorin)。
抗体或抗体片段也可使用具有萤光性质的蛋白质标示。这种蛋白质例如包括绿色萤光蛋白及其衍生物。
此外，生物效应物标记可用来以可检测方式标示抗体或抗体片段用来检测免疫复合物的存在。生物效应物标记为一种可执行可量测的生物反应，换言之于试管试验可检测细胞反应的化合物。有用的生物效应物标记例如为针对细胞受体的天然及人工配位子或抗体(或抗体片段)。特别有用的生物效应物标记为细胞因子例如IL-2。
其它适当蛋白质(及非蛋白质)标记系揭示于美国专利申请案第08/813,781号，申请日1997年3月7日以及美国专利案第09/422,375号，申请日1999年10月21日；其揭示以引用方式并入此处。这些探针的特例包括EE、myc、6Xhis。也较佳为通过蛋白质特异性结合的标记，包括抗体、细胞受体、蛋白质A、蛋白质G、抗生物素、链丝菌抗生物素；或其功能片段。其它有用的标记包括可直接或间接通过一或多种蛋白质分解酶、蛋白质激酶、生物素接合酶或其功能片段修饰的标记。
另外，可用于若干具体实施例直接标示免疫复合物。直接标示可通过多种方法达成，包括适当标示TCR分子、MHC抗原分子或试验化合物中的至少一个。当欲标示的分子为蛋白质时，此处所述用以标示抗体的任一种方法皆同样可用于标示TCR及/或MHC抗原分子。适合使用放射性核种(放射性同位素)例如碘如125I或131I。于其中试验化合物以可检测方式标示的具体实施例中，适当放射性核种的选择将依据例如试验化合物的化学性质以及要求的敏感度决定。这种放射性核种包括3H、14C、32P等。
特殊标示MHC肽的方法揭示于EPO 0 432 691 A1。也揭示其它肽。参考Hemmer等人(1998)免疫学期刊(J.Immunity)3631-3636及美国专利第5,614,192号(揭示治疗性T细胞受体肽)。
其它特定检测版本极为适合用于本发明。
更特殊检测版本涉及例如经过监视且经常定量至少一种细胞反应而间接检测免疫复合物的存在。该细胞反应经预先测定会受免疫复合物存在的影响。如此于本发明的多个具体实施例中，于一方法中检测细胞反应被取作为是否存在有免疫复合物的指针。适当细胞反应例如包括增或减下列的至少一个细胞黏着性、膜电位、胞内或胞外离子浓度、胞内激酶活性、磷酸酶活性、胞内蛋白质输送、内生性或非同系基因表现、蛋白质的制造或分泌，包括至少一种细胞因子的制造、细胞增殖、细胞凋零程序、RNA合成或DNA合成。概略参考细胞与分子免疫学第3版Abbas、Lichtman、Pober、Abbas及Schmitt，伟伯桑德斯公司，费城，1997年。
当然于本发明的具体实施例中，其中采用蛋白质蛋白质筛选方法，更为有用地系顺着前文讨论的方向直接或间接监视免疫复合物的形成。
但于TCR或MHC抗原分子中的至少一个系于基于细胞版本操控的具体实施例中，某些情况下，检测细胞反应中的至少一个作为免疫复合物指针较为有用。一具体实施例中，可表现TCR分子的细胞，例如T细胞、T细胞杂交瘤或表现重组TCRs的细胞，经监视是否表现出细胞反应中的至少一个。
供举例说明，于其中细胞表现TCR分子的具体实施例中，检测的细胞反应中的至少一个可为细胞媒介至少一种细胞因子例如介白质-2(IL-2)的合成与分泌。本发明的具体实施例中，该细胞因子(或多于一种细胞因子)的制造比较一或多种适当对照用来指示生产性TCRMHC抗原交互作用，更特别指示是否存在有免疫复合物。包括前文讨论的方法的不同策略之一或不同策略的组合可用于特定检定分析版本用来检测是否存在有细胞因子。更特定例中，细胞因子系于抗体「夹置」型检定分析检测，该检定分析中第一抗体(通常为单株抗体)系涂覆于固体载体上，于此处其特异性结合细胞因子，第二抗体(通常也是单株抗体)结合经制动的细胞因子于与第一抗体不同的位置。多个具体实施例中，通常以可检测方式表示至少第二抗体为较佳。
参考Schwarz，M.K.等人(1999)，化学生物学流行观点3407-417有关细胞因子的讨论。
其它具体实施例中，由TCRMHC抗原免疫复合物形成所得细胞反应可检测为基因表现变更。基因表现变化可通过多种方法测定，包括测定可诱生或可遏阻基因的转录活性或信使RNA浓度。此外，可使用内生性或外生性「通报子」基因检查激活基因活性变化。例如可产生通报子构成体，其中TCR反应性激活基因元体(例如IL-2激活基因)系联结至可检测蛋白质(例如萤火虫萤光素酶或绿萤光蛋白)的通报子基因。然后构成体被稳定导入其表面表现TCR的细胞系。这些细胞中，比较一或多种适当对照，诱使通报子基因转录，结果造成虫萤光素酶活性提高，被取作为生产性TCRMHC抗原交互作用指针，更特别作为免疫复合物存在的指针。虫萤光素酶活性可于虫萤光素酶基质进行虫萤光素酶相依性氧化后检测生物发光的标准方法测定。例如特别设计用于高产出量筛选版本测量虫萤光素酶活性的检定分析试剂(稳定葛罗(Steady-Glo))可得自普罗麦加(Promega)公司。
又另一具体实施例中，经过TCRMHC抗原免疫复合物形成导致的细胞反应，可检测作为胞内离子浓度变化。例如TCRMHC抗原复合物的形成，结果导致胞内钙离子浓度以及T细胞酸化的增高。这些反应程度系与MHC抗原作为激动剂、部分激动剂及拮抗剂的能力有交互关联(参考Wülfing，C.等人，1997，实验医学期刊1851815-1825)。本发明的这种范例中，比较一或多种适当对照，胞内离子浓度变化被取作为生产性TCRMHC抗原交互作用指针，特别指示是否存在有免疫复合物。不同策略之一或多种不同策略的组合可用于特定检定分析版本检测胞内离子浓度的变化。更特定实例中，使用基于萤光素的试剂(例如Fluo-3 AM)检测胞内钙离子移动性，基于萤光素的试剂当结合Ca2+时，可提高萤光强度约100倍。使用Fluo-3 AM试剂以及萤光剂量成影平板读取器，检测胞内钙移动性的高产出量筛选方法(例如参考Jurewicz，A.等人(1999)遗传工程新闻19，44)可用于研究经过生产性TCRMHC抗原复合物形成媒介的T细胞反应。
如熟谙本特定领域人士显然易知，特定检测版本的选择系由已知参数指导，包括感兴趣的TCR及MHC分子、该等分子的亲和力及/或彼此间的亲和力、以及为了获得试验化合物的最理想检测要求的检定分析特异性程度。
一特定具体实施例中，本发明用于特异性检测特殊免疫复合物的实务方面可通过含括适当内部对照辅助。这种内部对照包括TCR与非同源MHC抗原分子间、或MHC抗原与非同源TCR间形成的对照复合物。概略言的，适当非同源分子可为天然分子或重组分子，有用地涵盖某个范围的完全可溶或细胞锚定(结合于膜)分子。形成的对照复合物数量表示TCR(或MHC抗原)与其非同源对间的非特异性结合程度，当评比TCR与同源MHC抗原分子间的特异性交互作用时，可用作为背景对照值。
于其中需要称作「高产出量」或「超高产出量」筛选方法的具体实施例中，特殊检测版本极为有用。这些版本例如包括但非限于不含细胞系统，例如使用完全可溶性TCR及MHC分子的本发明具体实施例。这些版本的更特定例包括但非限于基于光学、萤光或发光强度的不含细胞的检定分析、时间解析萤光的检定分析、基于近似值的能量移转检定分析(包括萤光共振能量移转检定分析、闪烁近似值检定分析及亮度近似值检定分析)、萤光偏极化光谱术、及萤光交互关系光谱术。例如参考Silverman，L.等人(1998)化学生物学的流行观点2397-403。
也曾揭示多种基于细胞的检测版本其可用于本发明。特定言的，这些检测版本涵盖基于细胞的检定分析，包括但非限于光学、萤光或发光强度检定分析、萤光共振能量移转检定分析、时间解析萤光检定分析、发光及闪烁近似值检定分析、以及称作为二混成以及三混成系统。例如参考Fernandes，P.B.(1998)化学生物学的流行观点2597-603；Gonzalez，J.E.及Negulescu，P.A.(1998)化学生物学的流行观点9624-631；Jenh，C-H(1998)分析生物化学25647-55；Wu，P.等人(1997)分析生物化学24929-36。
其它特别适合用于使用基于细胞的版本的具体实施例的检测方法包括萤光活化细胞分类(FACS)技术。例如参考Altman，J.D.等人(1996)科学27494-96。
通过该方法检测与识别的化合物例如可用于减少或增加包含TCR及MHC抗原分子的免疫复合物的形成；降低或升高免疫复合物的安定性，或减少或增加TCR或MHC抗原分子彼此间的需求。检测得的化合物的其它用途包括用于调节活体内TCRs及MHC抗原分子。更特定的活体试验方法包括于活体内调节免疫反应的方法讨论如后。
一旦选定特殊检测版本(或一组多个版本)，则执行本发明方法的重要考量为适当制备至少一种反应混合物，其包括至少一种TCR分子及至少一种感兴趣的MHC抗原分子。一具体实施例中，MHC抗原分子系由MHC组成分与共价键联(换言之融合)提呈肽组成。但其它具体实施例中，经过载荷肽至通过识别方法识别的MHC分子来产生肽-MHC复合物更为有用。其它具体实施例中，MHC组成分含有共价键联的超抗原。另外，MHC组成分可通过识别方法复合至超抗原链。至少一种试验化合物添加至该混合物，混合物系于足够让TCR与MHC抗原分子彼此交互作用的条件下处理。较佳于无可拮抗TCRMHC抗原交互作用的试验化合物存在下，TCR及MHC抗原分子形成多个特定非共价键而有助于免疫复合物的形成。若有所需，该免疫复合物可由反应混合物中移出且例如通过前文讨论的方法分析。若有所需，免疫复合物可使用淀积离心、电泳、过滤、层析术或相关分子筛选技术检测。
本发明方法使用的特定TCR及MHC抗原分子将依据识别参数改变，识别参数例如为筛选检定分析目标、期望敏感度、试验化合物汇集物大小、以及选用完全可溶筛选版本或基于细胞的筛选版本。
例如多个具体实施例中，使用基于细胞的办法，包括使用后文实施例提供的特定细胞，将可表现TCR分子。本发明的实施例中，MHC抗原分子完全可溶，但视需要分子可通过适当APC或其它细胞表现。于TCR分子及/或MHC抗原分子包括全长或接近全长链的具体实施例中，免疫复合物的检测可使用例如前文所述直接或间接检测版本，检测TCR分子、MHC抗原分子、或二者辅助。
特别本发明方法可使用一种特定反应版本或多种版本的组合进行。该方法之一具体实施例中，适当MHC抗原分子制动于固体载体或固相。随后被制动的MHC抗原分子接触适当TCR分子，通常系接触其同源分子，若有所需该TCR分子可以检测方式经标记。然后至少一种试验化合物接触TCR及MHC抗原分子，但于某些情况下于添加TCR分子前，包括制动MHC抗原分子至固相前可加入试验化合物。另外，可于形成免疫复合物后加入试验化合物。至于对照，TCR分子添加至另一反应室，于该反应室中，MHC抗原分子系结合至相同或类似的固体载体。但若非添加试验化合物，通常系以类似实验性反应使用的容积，添加一份适当空白溶液例如水、缓冲液等。其次如同实验性反应检测免疫复合物。该方法的具体实施例中，视需要使用直接或间接检测版本可达成免疫复合物的检测目的。例如TCR分子、MHC抗原分子、试验化合物、或全部三种分子可经直接或间接标示而辅助获得免疫复合物的良好检测。然后通过前文讨论的标准选择试验化合物，该等标准包括增加或减少免疫复合物的形成及/或安定性的能力。
「固体载体」或「固相」等词表示几乎任何可结合TCR或MHC抗原分子的载体。众所周知的载体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡萄聚糖、尼龙、淀粉酶、天然及改性纤维素、聚丙烯酰胺、飞白岩、磁铁矿、树状聚合物及硅晶圆。载体性质为可溶解至某种程度、或用于本发明为不溶性。载体材料实质上可为任一种可能的结构组态，只要偶合分子可结合至抗原或抗体即可。如此载体组态可为球体，例如珠粒；或为圆柱体例如于试管内面或杆外表面。另外，载体表面可平坦例如薄片、试验条等形状。较佳载体包括聚苯乙烯珠粒。基于珠粒的试剂于商业上可以多种版本格式获得，该试剂允许重组蛋白质的高能力结合/捕捉、有效检测、以及使用不同的分离方法及均质检定分析方法。用于多种高产出量筛选方法，以珠粒为主的试剂为较佳。本发明领域的熟谙技艺人士了解多种其它适当载剂可用以结合TCR及MHC抗原分子，或可使用例行实验确定其结合。
本发明的范例示意显示于第2图。第2图中，小分子抑制剂实质上阻断由APC的肽-MHC配位子组成的MHC抗原与由适当细胞表现的TCR间的交互作用。本具体实施例中，TCRMHC抗原交互作用可由另一种受体例如CD分子辅助。存在有小分子抑制剂可阻断免疫反应。但于无小分子抑制剂存在下，将表现该免疫反应。
本发明的另一具体实施例显示于第3图。本实施例中，TCR分子以可检测方式标示，试验分子于「高产出量」或「超高产出量」筛选版本添加至反应。但须强调这种高容积筛选并非实施本发明所必需，反而可辅助分析大量试验化合物。本发明的此一实施例中，经常使用多个反应室，其中各个反应室包括以可检测方式标示的TCR分子、被制动的MHC抗原分子、以及每个反应室至少一种且较佳约一种试验分子。根据本具体实施例的试验化合物将有助于于试验化合物存在下，信号显著丧失，指示免疫复合物的存在量对应减低。若干具体实施例中，可使用多种化合物的汇集物，此处于该汇集物中各别化合物浓度系超过检定分析的检测极限。
另外，可调整第3图所示特定筛选方法，故MHC抗原分子以可检测方式标示，TCR分子被制动至固体载体或固相。另一具体实施例中，替代TCR分子及/或MHC抗原分子、或此外，试验化合物可以可检测方式标示。特定筛选方案的选择系由前文讨论的参数决定，该等参数包括筛选检定分析目标以及需要的敏感度程度。
举例言之，第3图所示筛选方便调整用于检测特定免疫病症拮抗剂。本具体实施例中，筛选中采用的TCR及MHC抗原分子系预先经过选择而由经过识别可参与免疫病症或怀疑参与免疫病症的该等分子组成。这些TCR及MHC抗原分子范例提供于此处，包括提供于实施例以及后文讨论。
须强调根据本发明操控TCR分子、MHC抗原分子或试验化合物的正确顺序通常并不重要，只要容易符合预定筛选结果即可。换言之，当希望试验化合物有能力调变免疫复合物的形成时，经常可于添加TCR及MHC抗原分子前或添加期间加入该等分子极为有用。但于筛选方法系设计用以检测调节先前形成的免疫复合物的试验化合物的具体实施例中，视情况需要，试验化合物可于TCR与MHC抗原分子组合前、组合中或组合后添加。如此于特定检定分析的各组成分的添加顺序系由参数指导，参数包括该筛选版本的特定目的。
多种情况下，业界称作「滴度」或「微滴度」孔板可方便地用作为固相。96孔微滴度孔板为较佳，但更多孔则适合用于更复杂的筛选方案。锚定组成分根据一般采纳的实务可通过非共价或共价附着制动。例如经过单纯使用TCR或MHC抗原蛋白质溶液涂覆固体表面经历蛋白质结合固相需要的时间可达成非共价附着。另外，对欲制动蛋白质的特异性已经经制动的抗体且较佳为单株抗体，可用于定锚蛋白于固体表面。若有所需该表面可事先准备妥而储存备用。
特别本发明的实施涉及添加未经制动组成分至含有经锚定组成分(可为TCR分子或MHC抗原分子)的涂覆面。于反应完成后，未反应的组成分于任一种形成的复合物将保持制动于固体表面的条件下移开(例如通过洗涤去除)。定锚于固体表面的复合物的检测可以多种方式达成，该等方式涉及直接或间接检测版本。若先前未经制动的组成分预先加标记，则检测得标记已经制动于表面，表示已经产生TCR与MHC抗原分子间的免疫复合物。若先前未经制动的组成分未预先加标记，则使用间接标记来检测复合物锚定表面，例如使用该先前未经制动的组成分的特异性经过加标记的抗体(该抗体又可以加标记的抗-Ig抗体直接加标记或间接加标记)。
本发明的另一具体实施例中，适当MHC抗原分子制动于适当固相例如96孔微滴度孔板上。本例中，MHC抗原分子系由MHC组成分载有共价融合提呈肽组成。另外，MHC抗原分子可由复合物组成，该种情况下，提呈肽较佳系于额外操控进行前载荷入MHC组成分上。其它具体实施例中，MHC抗原系由MHC组成分复合经共价结合或未经联结的超抗原组成。培养约12至约24小时来辅助获得最大制动后，MHC抗原分子由孔板移开，孔内填装适当细胞培养基例如DMEM、IMDM等。其次，于加入可表现同源TCR分子之前或之中，添加试验化合物至各孔。然后细胞培养一段足够应答于经结合的MHC抗原分子的时间，通常为约数小时至约3日或3日以上。用以检测免疫复合物的存在用的细胞反应为细胞因子的制造且较佳为IL-2的制造。
例如第4图显示期望的MHC抗原分子制动于固体载体例如前述多孔孔板上。本具体实施例中，MHC抗原分子系由MHC组成分共价键联提呈肽组合而成。但如前文所述，于载荷提呈肽为较佳的具体实施例中，于本方法可使用空白MHC分子。其它具体实施例中，MHC抗原可由MHC组成分复合共价键联或未经键联的超抗原组成。于本发明的这种实施例中，可表现期望TCR分子的细胞例如天然T细胞或重组T细胞杂交瘤接触已经被制动的MHC抗原分子。根据所需版本且较佳为前文讨论的「高产出量」或「超高产出量」版本之一，可筛选至少一或多种试验化合物。试验化合物几乎可于检定分析的任一点添加，包括添加细胞至各孔或制动MHC抗原分子至该等孔之前、之中或之后添加。于本发明的此例中，监视的细胞反应为IL-2的制造。如第4图可知，于无适当试验化合物存在下，产生TCR与MHC抗原分子间的特异性结合，结果导致形成免疫复合物。该免疫复合物触发T细胞的活化以及IL-2细胞因子的制造。但结合适当试验化合物，例如免疫复合物形成拮抗剂，将降低细胞反应以及结果所得由T细胞的IL-2产量。经过观察细胞因子制造的减少，试验化合物由其它化合物中检测与选出。
更特定具体实施例中，由细胞制造且分泌于培养基的细胞因子的检测方式，系将培养基移转至事先已经涂覆以该细胞因子特异性抗体的孔内。经过适当培养期来让细胞因子结合被制动的抗体(换言之于25℃培养2小时)后，去除(于PBS洗涤去除)各孔的培养基，添加加可检测标记的抗体至各孔，该抗体偏好结合细胞因子分子。培养加标记的抗体，例如培养数小时至长达1日左右后，各孔以一或多种不同试剂处理，该试剂适合用于目测观察加标记抗体结合至细胞因子分子。前文已经说明多种可接受的目测版本，包括涉及产生产色原的版本。如前述，一种细胞因子为介白质-2(IL-2)，但本筛选方法也适合用于检测可指示包括其它细胞因子的细胞反应的可检测分子。
本发明的另一具体实施例系作为「原理证明」实施例。示意显示于第5A图。本实施例中，T细胞杂交瘤用来表现DO11.10 T细胞受体。MHC抗原分子例如结合至多孔孔板的各孔，本例中(sc)-IAd/OVA蛋白质与DO11.10 TCR进行特异性交互作用。适当试验化合物例如于「高产出量」或「超高产出量」版本提供的试验化合物，系于添加重组T细胞之前、之中或之后添加。此时，监视其细胞反应为IL-2的制造。
如由第5A图可知，于适当试验化合物存在下，DO11.10 TCR与sc-IAd/OVAMHC抗原分子间的特异性结合被阻断，因而无法形成免疫复合物。不存在有足够免疫复合物，T细胞的活性以及IL-2细胞因子的产量减低或完全被阻止。IL-2细胞因子产量的减低方便使用多种直接或间接版本检测。
第5A图所示筛选方法的另一具体实施例示意显示于第5B图。本发明的这种实施例偶尔称作为「双重」检定分析版本，该检定分析系测定一种方法于一孔或数孔进行T细胞刺激且测量T细胞的反应能力。例如更特定具体实施例中，适当MHC抗原分子例如经纯化后的sc-IAd/OVA连同适量抗IL-2单株抗体(亦即捕捉抗体)制动于多孔培养孔板上。孔板的各孔包括至少一种试验化合物以及典型包括这些化合物之一。随后可表现DO11.10 TCR的T细胞添加至各孔，于一段足够培养时间后洗掉。其次，通过添加可由捕捉抗体特异性结合制动IL-2的经过可检测标记抗体，适量添加至各孔，可测量各孔的IL-2产量。典型地，ELISA检测版本为较佳，但视各特定试验版本需求，可使用其它免疫检测版本。如第5B图可知，作为拮抗剂的抑制性化合物方便通过测量吸光比识别。
前述筛选的更特定例于后文讨论于实施例10。本发明的此例中，由商业取得的化学文库筛选约2000种小分子。显然实施例10显示检测得30种化合物，其显示远较低的IL-2吸光比读值，换言之，该化合物减少DO11.10 TCR与sc-IAd/OVA蛋白质间形成的免疫复合物的形成及/或降低形成的复合物的稳定性。
另一具体实施例中，所需MHC抗原分子结合细胞膜。本具体实施例中，MHC抗原分子系由MHC组成分共价键联至提呈肽组成。但于载荷提呈肽为较佳的具体实施例中，本方法可使用MHC分子。其它具体实施例中，MHC抗原系由MHC组成分复合共价键联或未经共价键联的超抗原组成。例如，MHC抗原系由存在于APCs上的MHC/肽复合物组成，该APCs系以特定肽施加脉冲。适当肽及制法及肽的施加脉冲方法为业界已知。例如参考Sette，A.等人(1987)自然328395-399及Martin，R.等人(1990)免疫学期刊(J.Immunity)145540-548。本发明的此例中，可表现预定TCR分子的适当细胞，例如天然T细胞或重组T细胞杂交瘤接触MHC抗原分子。根据预定检定分析版本可筛选至少一种试验化合物。试验化合物几乎可于检定分析的任一点添加，包括细胞添加至各孔之前、之中或之后添加。本发明的此例中，监视的细胞反应为IL-2的制造。于无适当试验化合物存在下，TCR与MHC抗原分子间产生特异性结合，结果导致形成免疫复合物。该免疫复合物触发T细胞的活化以及IL-2细胞因子的制造。但结合适当试验化合物，例如免疫复合物形成拮抗剂，将降低细胞反应以及结果所得T细胞的IL-2产量。经过观察细胞因子产量的减低而可检测得试验化合物且由其它化合物中选出试验化合物。
如下实施例10提供本发明的此一具体实施例的更特定说明。本例中，A20APCs、OVA肽及DO11.10 T细胞混合，让OVA肽与A20细胞的IAd分子间形成复合物，且通过IAd/OVA复合物刺激DO11.10 T细胞。本例中DO11.10 T细胞的刺激系通过IL-2细胞因子的制造测定(容后详述)。试验化合物添加至经过OVA施加脉冲的A20DO11.10 T细胞混合物，以评比试验化合物影响免疫复合物的形成以及细胞因子产量的能力。显然实施例10显示检测得四种化合物，其显示远较低的IL-2吸光比读值，换言之该化合物减少DO11.10 TCR与IAd/OVA复合物间形成免疫复合物及/或降低形成的免疫复合物的稳定性。
如此处讨论，本发明之一目的系提供辅助检测多种试验化合物的高度有效筛选方法。较佳检测得的试验化合物可特异性调节同源TCR与MHC抗原对间形成的免疫复合物。
根据此项目的，本发明提供选择试验化合物的策略，该试验化合物可非特异性调节细胞，例如该试验化合物影响细胞制造IL-2而非特异性调节细胞。本具体实施例中，前述任一种方法可重复施行，检定分析该检测得的化合物对非特异性T细胞刺激的影响。
例如一种检定分析非特异性T细胞刺激的方式，系经过使用抗体于可结合分化群集(CD)蛋白质例如CD3的方法。如此处讨论，据报告CD3蛋白质密切关联多种TCRs。本发明的本例中，抗体可于TCR或MHC抗原分子添加之前、之中或之后制动于孔。存在有制动抗体，通常可活化T细胞，刺激T细胞制造细胞因子如IL-2。如此干扰抗体媒介T细胞活化的试验化合物，被指定作为无法特异性调节TCR与MHC抗原分子间形成的免疫复合物的试验化合物。虽然这种试验化合物于某些例中令人感兴趣，但更佳本发明试验化合物可通过检测是否存在有免疫复合物而特异性调节TCRMHC抗原交互作用。
再度参照第5B图，显示本特定筛选方法之一具体实施例，其中使用抗-CD3抗体作为对照。如此处讨论，偶尔将这种对照称作为「对照免疫复合物」、「内部对照」等词。
本发明的主要目的系提供检测方法，该方法若有所需可调整适合检测试验化合物，该试验化合物可特异性调节T细胞刺激相依性MHC抗原，同时对这些细胞透过TCR/CD复合物例如TCR/CD3刺激的反应能力极少或无任何影响。对照免疫复合物的更特定说明参考后文实施例10。感兴趣的特定试验化合物调节MHC抗原媒介TCR细胞的刺激，而对抗-CD3抗体媒介的IL-2制造具有不显著或可忽略的抑制作用。
若有所需，本方法可用于前述对照免疫复合物之一或其组合，例如前述TCR/CD3复合物。如此处讨论，于有以及无试验化合物存在下，分析这种对照免疫复合物有助于精制特定筛选方法(假设该筛选方法需要精制)，且辅助可特异性调节免疫复合物的化合物的检测。例如另一种极为适合用于本发明的对照免疫复合物包含抗-TCR抗体，通常为抗-TCR单株抗体。本具体实施例中，抗-TCR抗体较佳特异性结合位于受体结合位置外侧的TCR抗原决定部位，换言之如通过习知蛋白质蛋白质结合实验测定，抗-TCR抗体无法抑制TCR与其同源MHC抗原分子间的结合。这种单株抗体例如为业界已知。例如参考Haskins，K.等人(1983)实验医学期刊1571149-1169，Kubo，R.T.等人(1989)免疫学期刊(J.Immunity)1422736-2742以及Brenner，M.B.等人(1984)实验医学期刊160541-551。抗-TCR抗体作为对照免疫复合物的较佳用途于后文讨论于实施例11。
某些情况下，例如当预定试验化合物于指定的检定分析条件下对特定TCR与MHC抗原交互作用的调节能力微弱，则加强该检定分析的敏感度极有助益。这种加强检定分析敏感度可经过不同策略之一或多种不同策略的组合达成，包括使用习知方法加强免疫反应的直接或间接检测。另外，这种敏感度的加强可通过操控TCR及/或MHC抗原分子达成，例如经过提供该等分子呈多价复合物达成。实施例15提供此项技术的特定说明。
一具体实施例中，检定分析敏感度可通过由提高细胞对来自免疫复合物刺激的反应能力而加强。特别业界了解共同刺激受体(例如T细胞表面的某些CD分子)与其同源配位子间的交互作用可刺激TCRMHC抗原交互作用所媒介的胞内信号的引发以及胞内信号的放大。因此本发明的又一目的系提供可表现所需TCR或MHC抗原分子的天然或重组细胞，该天然或重组细胞进一步表现至少一种适当共同刺激受体，例如CD28或LFA。本发明的本具体实施例中，共同刺激受体与TCR及/或MHC抗原分子共同表现，于较佳检定分析条件下，可提升对免疫复合物的细胞反应，因而提高检定分析敏感度及可靠度。较佳检定分析条件包括但非限于添加可结合该共同刺激受体的同源配位子或抗体(或抗体片段)，其中同源配位子或抗体系呈可溶性、经制动或经与细胞结合的分子形式添加。
另一种提高检定分析敏感度的方式，系提供免疫复合物的更优异提呈。特别业界了解某些CD蛋白质可辅助与MHC抗原分子的交互作用。如此本发明的又一目的系提供可表现所需TCR或MHC抗原分子的天然或重组细胞，该细胞进一步表现至少一种适当CD蛋白质例如CD4或CD8。本发明的此一具体实施例中，CD蛋白质与TCR及/或MHC抗原分子共同表现有助于形成免疫复合物，因而提高检定分析敏感度及可靠度。
本发明的特定具体实施例中，细胞经过工程处理而可于细胞表面表现所需TCR分子(例如sc-TCR融合分子)及CD4蛋白质或其片段。另一具体实施例中，提供所需TCR分子呈sc-TCR融合分子，该分子经过工程处理而含括至少部分另一种CD分子(如CD3ζ)或其功能片段作为融合蛋白质之一部分。又另一具体实施例中，sc-TCR-CD3ζ构成体系与CD分子通常与CD4或CD8共同表现。多种情况下，TCR分子与CD蛋白质共同表现将让细胞对MHC抗原分子的刺激更为敏感。本例中，MHC抗原分子可呈全然可溶性蛋白质提供或视需要呈基于细胞的版本提供。
如下实施例12提供本发明的此一具体实施例的更细节说明。此处DO11.10TCR系呈sc-CD3ζ融合蛋白质提呈，该融合蛋白质系由细胞表现，而该细胞也表现重组CD4蛋白质于细胞表面。同源MHC抗原分子scIAd/OVA连同适当抗IL-2抗体通常为单株抗体共同制动于适当多孔孔板上，通常经历约12-48小时。该抗体可于MHC抗原分子制动之前、之中或连同制动一起添加至孔板。随后，可共同表现单链TCR及CD4蛋白质的重组细胞添加至孔板，培养数小时或长达数日或数日以上。细胞的IL-2的制造系遵照前述方法测定。
该方法之一具体实施例中，MHC抗原构成体共价键联至免疫球蛋白片段例如IgM、IgG、IgA等及其功能片段。若有所需，可准备对照孔，使用不同MHC抗原测定细胞的刺激。又若有所需，可进行进一步对照，例如使用前述内部对照中的至少一个，包括于实施例特别说明的对照。本发明的此一具体实施例中，试验化合物调节重组细胞的刺激能力将以细胞制造细胞因子产量的对应增减测定。试验化合物可抑制MHC抗原刺激T细胞，但不会抑制抗-TCR抗体刺激T细胞，则该种试验化合物可用作为先导化合物。
本方法的特定例示意显示于第6A图。此处采用的TCR及MHC抗原探针出现于多发性硬化症(MS)，多发性硬化症为造成轴突严重脱髓鞘之一种常见人类自体免疫病。第6A图显示该方法之一具体实施例，该方法中试验化合物系筛选可调节MS TCR以及MHC抗原探针间的交互作用的化合物。T细胞较佳系衍生自多发性硬化症病人T细胞。另外如所示，细胞(亦即重组MS TCR细胞)系通过TCR克隆及表现步骤制造，例如此处提供的TCR克隆及表现步骤。然后重组MS TCR细胞遵照前文讨论方式添加至多孔孔板(孔内带有结合的MHC抗原分子)。如此，至少一种试验化合物且通常约为一种试验化合物系于重组MS TCR细胞添加之前、之中或之后添加至孔内。较佳该方法系以高产出量筛选版本进行。本发明的此例中，试验化合物的检测方式，系经过比较至少一种适当对照，例如于无试验化合物存在下细胞的IL-2产量，由MS TCR细胞的IL-2产量降低或消失，检测得试验化合物。
如第6B图所示，纯化后的sc-DR2/MBP(带有融合MBP提呈肽的单链第II类MHC)制动于多孔细胞培养孔板上。孔板适合包括一个化学文库，其中各孔较佳含有至少一种且通常约为一种试验化合物。其次，通过习知手段由患有或怀疑患有或好发多发性硬化症病人，获得可表现相关TCRs的T细胞。但大半例中，如已知参数指示，病人患有多发性硬化症。至于替代的道，可产生可表现相关TCRs的重组细胞。当遵照前文说明进行筛选时，适量T细胞添加至各孔。本具体实施例中，该细胞反应中系于有以及无得自该化学文库的试验化合物的存在下测定，该反应可为先前说明的制造细胞因子。
当然前述检测调节多发性硬化症免疫复合物的试验化合物的特定方法，方便调整适合用于筛选其它感兴趣的TCR及MHC抗原分子。
前述筛选方法的更特定实例通过实施例13提供如后。本发明的此实施例中，适当T细胞V-α及V-β链系得自对髓磷脂碱性蛋白质(MBP)经过限剪的特定人类多发性硬化症T细胞系。若有所需，该链的编码核酸可融合至人类CD3ζ序列或该序列的功能片段。然后结果所得构成体于适当细胞及特别于永生T细胞表现。然后这种经过转移感染的细胞遵照前述方式操控。换言之，永生T细胞加至多孔孔板，其中各个孔包括经制动的或经细胞表现的同源MHC抗原，例如载荷MBP肽的DR2+APCs。另外，MHC抗原分子可于此处提供以及美国专利案第5,869,270号提供的细胞产生，该细胞中提呈肽系共价键联至MHC。如此本发明的具体实施例的检测版本系完全基于细胞。
特别实施例13提供一种检测版本其中MS限剪的TCR系基于细胞，而同源MHC抗原分子(sc-DR2+/MBP)系制动于孔上。本发明的本实施例中，MHC抗原蛋白质可融合至可接受的免疫球蛋白分子例如IgM、IgG、IgA等或其片段。ScDR2/MBP制动于孔经历数小时至一日左右后，重组T细胞添加至孔内的培养基，且于其中培养数小时至数日。各个孔也包括至少一种且经常为一种试验化合物提供于适当溶剂。试验化合物可于检定分析的任一点添加，包括于T细胞添加或MHC抗原分子制动之前、之中或之后添加。但连同T细胞一起添加试验化合物通常对本发明的范例而言为较佳。化合物调节MHC抗原与TCR分子间的交互作用的能力可如前述直接或间接监视。又本例中，IL-2的制造系遵照前文讨论测定。若有所需，本特定方法包括一或多个对照，包括于无试验化合物存在下培养重组细胞。也可采用额外对照，包括前述对照免疫复合物。通过该方法检测的特定试验化合物可显著调节TCR与MHC抗原分子间的交互作用，但无法调节通过前述抗-TCR抗体或抗-CD3抗体的刺激。较佳试验化合物为于本检定分析中显示实质拮抗活性的试验化合物。
另一具体实施例中，本发明提供基于细胞的筛选方法，其中细胞经设计而可于细胞表面表现至少两种抗原特异性TCRs。本发明的本特定实例提供优点。例如经常让该方法对不同TCRs显示独特影响的试验化合物更为敏感。如该例说明，试验化合物具有可调节多种TCR分子之一而同时远较少或丝毫也未调节另一种TCR分子的能力。
通过由本具体实施例的举例说明，适当细胞例如永生T细胞经工程处理而表现预定(第一)TCR分子连同于此处偶尔称作「对照」或「第二」TCR分子。这种细胞遵照前文讨论方式使用，例如用于可表现感兴趣的MHC抗原分子的APCs、或用于制动MHC抗原分子。化合物调节MHC抗原与第一TCR分子间的交互作用的能力可如前述直接或间接监控。然后这种交互作用与化合物调节第二TCR分子与其同源MHC抗原间的交互作用的能力比较。多种情况下，希望利用前述方法测定细胞产生的细胞因子产量，包括IL-2分泌量。特定感兴趣的化合物将调节第一TCR与其同源MHC抗原间的交互作用，同时提供第二TCR分子与其同源MHC抗原间远较低的调节作用或丝毫也无调节。
如此，本发明之一目的系提供一种方法其若有所需可包括至少一种适当内部对照。如此前述任一种方法包括下列步骤的至少一个1)本TCR分子(例如第一TCR分子)与至少一种抗体(较佳单株抗体)接触，该抗体较佳可特异性结合TCR于由MHC抗原分子结合位置外侧之一或多个抗原决定部位，该接触系于有或无试验化合物存在下进行，以及于足够结合TCR及抗体成为对照免疫复合物的条件下进行，2)于有及无试验化合物存在下检测是否存在有对照免疫复合物；以及3)选择试验化合物，该化合物不会以可检测方式变更(增或减)TCR与抗体间的特异性结合。
另一具体实施例中，若有所需，该方法包括下列步骤的至少一个1)第二TCR分子接触其同源MHC抗原分子，该接触系于有或无试验化合物存在下、且于足够结合第二TCR与MHC抗原成为对照免疫复合物的条件下进行，2)于有及无试验化合物存在下检测是否存在有对照免疫复合物；以及3)选择不会以可检测方式变更(增或减)第二TCR与MHC抗原分子间的特异性结合的试验化合物。较佳第二TCR具有与前文指示本(第一)TCR分子不同的MHC抗原结合特异性。
如此处讨论，是否含括一或多种内部对照的选择系由已知参数指导，该等参数例如欲筛选的试验化合物、以及要求的敏感度及选择性数量。
如下实施例14特别就含括内部对照提供本发明的特定举例说明。本例中，第一TCR分子为单链DO11.10 TCR分子，而第二TCR分子为内生性TCR。为了评比细胞对透过第一及第二TCR分子刺激的反应，细胞系于适当多孔孔板培养，孔板包括适当对照MHC抗原分子。例如适当对照MHC抗原可由MHC/肽复合物存在于适当经以特定肽施加脉冲的APCs上组成。适当肽的制法及施加脉冲方法为业界已知。例如参考Sette，A.等人(1987)自然328395-399及Martin，R.等人(1990)免疫学期刊(J.Immunity)145540-548。较佳当肽存在于APCs时主要可刺激第二TCR，但不会刺激第一TCR。第一TCR的同源MHC抗原分子通常系制动于孔，摘述如前文。MHC抗原分子系由载有融合提呈肽、或视需要载荷有肽的MHC组成分组成。该肽较佳对第一TCR分子为特异性，而对第二TCR分子为非特异性。其它具体实施例中，MHC抗原系由MHC组成分复合共价键联或未键联超抗原组成。该超抗原较佳为第一TCR分子特异性，而非第二TCR分子特异性。
本发明的本例中，遵照前文说明，至少一种试验化合物可于添加APCs或制动MHC抗原分子之前、之中或之后添加至孔。举例说明，于MHC抗原分子制动后，而于添加表现TCR分子的细胞前，可加入试验化合物。较佳细胞反应为细胞因子的制造，特别IL-2的制造，但某些情况下可用于监视其它细胞反应，例如前述细胞反应。本具体实施例中，感兴趣的特定试验化合物将调节第一TCR与其MHC抗原间的交互作用，同时对第二TCR与其MHC抗原间极少调节或无调节。更特别感兴趣的试验化合物对第一TCR与其同源MHC抗原间的交互作用提供良好抑制效果，但对第二TCR及其同源MHC抗原未能提供类似的抑制。
更特定具体实施例中，本发明涵盖一种筛选方法，该方法系利用使用至少二个TCR分子重构、且较佳通过不同MHC抗原限剪的细胞系。本发明的此项特色提供多项优势，包括降低任何检定分析的变异。
以下多个实施例提供本发明的另一项特定范例，特别含括额外内部对照的范例。例如内部对照包括TCR与非同源MHC抗原分子间、或MHC抗原与非同源TCR间形成的对照复合物。如此处所述，这些对照复合物表示TCR(或MHC抗原)与其非同源对偶间的非特异性结合，且可用作为阴性对照，来评比TCR与同源MHC抗原分子间的特异性交互作用程度。例如实施例3、5、11、12、14、15及16举例说明的特定具体实施例利用适当MHC抗原分子来建立TCR与非同源MHC抗原分子间的非特异性结合。各例中，非同源MHC抗原为载有肽的肽-MHC复合物，该肽系与TCR特别识别的同源肽不同。实施例11、14及15所示其它具体实施例利用适当TCRs，来建立MHC抗原分子与非同源TCR间的非特异性结合。
本发明的实施特别比先前基于细胞的筛选法(亦即参考WO96/36881)提供多项优势。例如本发明方法与宽广范围的TCR及MHC抗原分子完全兼容。本发明的此项特色重要，其可扩大基于细胞以及基于蛋白质的检定分析用以检测试验化合物的范围。与先前筛选尝试相反，本发明方法也提供多个内部对照，其可对非特异性调节细胞反应的试验化合物做选择。如此处讨论，通常使用基于细胞的筛选检定分析的主要限制之一系检测「伪阳性」化合物，伪阳性化合物系非特异性或间接调节测量的细胞反应。本发明的较佳用途可实质减少或于某些情况下消除伪阳性或误导性试验结果。
如此处讨论，提高本方法敏感度之一项方式系提供本TCR分子及/或MHC抗原分子呈多价复合物。本具体实施例中，本发明提供显著优势。例如业界了解多价MHC抗原分子可刺激T细胞反应至比单元体MHC抗原分子更高程度，某些情况下刺激至远更高程度。参考Abastado，J.(1995)实验医学期刊182439-447及Hamad，A.R.等人(1998)实验医学期刊1881633-1640。
例如使用多价TCR及/或MHC抗原分子实施该方法可合乎所需地提高TCRMHC抗原复合物的微弱交互作用。达成此项目的之一种方式系共价键联或融合至少一个「配接子」或「标记」分子至TCR分子、MHC抗原分子或二者。这些配接子或标记可直接或间接作用于促进多价复合物的形成。范例配接子或标记包括生物素、链丝菌抗生物素及免疫球蛋白分子，例如免疫球蛋白可变区及/或恒定区包括IgG及IgM重链、κ及λ链或其功能片段。感兴趣的特定配接子系由另一种分子特异性结合，该另一分子包括蛋白质A、蛋白质G、生物素、链丝菌抗生物素或抗体如单株抗体。抗体可视需要加可检测标记。其它感兴趣的配接子为可结合而形成多元体复合物的蛋白质领域，例如白胺酸拉链领域。多价形式的MHC抗原及TCR分子也可经过直接或间接化学交联分子生成。有关本发明的MHC抗原分子的多价形式的进一步说明可参考美国专利申请案第08/960,190号。
本发明的多价形式TCRs的进一步说明可参考美国专利申请案第09/422,375号，名称「多重特异性结合分子及其用途」，申请日1999年10月21日；其揭示以引用方式并入此处。
也参考美国专利申请案第09/422,375号有关其它用于本发明的MHC抗原分子及TCR分子，包括这些分子的多价形式的揭示。
例如一具体实施例中，本MHC抗原分子通过标准方法融合至适当配接子或标记分子，例如IgG的免疫球蛋白恒定区或其功能片段。一特定具体实施例中，MHC抗原分子较佳系配置成单链MHC构成体，其包括融合提呈肽及配接子。通常配接子或标记将融合至单链构成体C端，但其它配置也适用于某些用途，例如配接子或标记系融合至N端。特定多价复合物通常具有约2至约10个单元，较佳约2至5个单元，以约4个单元(换言之四聚体)对多项应用用途有用。
如下实施例3及5说明本发明的方法的特定细节，该方法使用多价复合物来提升免疫分析用于检测免疫复合物的形成的敏感度。例中，生成多价MHC抗原且制动于固体载体上，换言之制动于前述多孔孔板上。本具体实施例中，MHC抗原分子为共价键联至提呈肽的MHC组成分。但如前文已述，空白MHC分子可用于本方法用于其中载荷提呈肽为较佳的具体实施例。其它具体实施例中，MHC抗原可由MHC组成分复合共价键联或未经键联的超抗原组成。如所述，可使用不同方法来生成多价复合物。实施例3中，MHC抗原分子、scIAd/OVA融合至IgG重链及κ链的免疫球蛋白恒定领域。实施例4中，scIAd/OVA融合至IgM重链的免疫球蛋白恒定领域。二例中，scIAd/OVA分子的多元体化皆系利用免疫球蛋白骨架媒介。本发明的本具体实施例中，表现DO11.10 TCR的细胞加至孔内，培养数小时或长达数日或更久。遵照前述方法测量细胞的IL-2产量。如下实施例3及5所述，使用多价复合物可提供检定分析敏感度的显著增强(2至10倍)。
另一具体实施例中，其中使用多价MHC抗原分子，表现同源TCR分子细胞典型系于隔夜培养，接触至少一种完全可溶的多价MHC抗原分子。试验化合物可遵照前文讨论添加至孔板，包括于细胞或多价MHC抗原分子添加之前、之中或之后添加。随后，细胞经洗涤，细胞接触加可检测标记的抗体，该抗体可特异性结合多价MHC抗原分子(现在系结合至细胞)。然后分析细胞是否出现可检测标记。若出现可检测标记则取作为形成TCRMHC抗原复合物的指针。特别令人感兴趣的试验化合物为比较此处所述一或多个对照，显示具有调节免疫复合物形成能力的试验化合物。
该方法的更特定例为后文实施例15所述的基于孔板的检定分析版本。本发明的此例中，MHC抗原为sc-IAd/GD-Ig融合蛋白质，细胞为可表现DO11.10或GD12TCR的T细胞杂交瘤。多价MHC抗原分子经过与使用生物素加可检测标记的抗-Ig单株抗体共同培养方法制备。该生物素的本身又与联结至产色基团的链丝菌抗生物素进一步培养。本发明的本特定例中，对照为多价MHC抗原与可表现DO11.10 T细胞共同培养。如实施例15解释，染色后细胞的流动细胞计量术(亦即FACS)指示scIAd/GD-Ig分子可特别染色GD12 T细胞杂交瘤，但未能染色表现DO11.10细胞的细胞。
实施例15举例说明的本发明的具体实施例可配合于多种筛选版本例如前述高或超高产出量检定分析以及后述实施例筛选试验化合物。典型地，试验化合物将识别且选择特异性调节GD12 T细胞杂交瘤与其同源性多价MHC抗原分子间的交互作用的能力。特定感兴趣的试验化合物将显示细胞信号易检测的变化(增或减)。本特定检定分析可进一步配合筛选其它TCRMHC抗原对偶，若有所需DO11.10细胞可用作为有用的对照，用于非特异性调节TCRMHC抗原交互作用的试验化合物。
另一具体实施例中，本发明提供采用可溶性分子包括完全可溶性TCR及MHC抗原分子的方法。一具体实施例中，本发明特别提供基于蛋白质的筛选方法，用以筛选可调节TCRMHC抗原交互作用的试验化合物。本发明的此项特色提供重大优势，包括减少或消除「伪阳性」信号，某些情况下由于对细胞反应的非特异性影响可能出现伪阳性信号。典型地，包括ELISA、基于萤光的版本以及均质检定分析办法为较佳，但其它直接或间接检测版本用于特定筛选计划更为有用。
本发明的基于ELISA版本的特定例中，筛选包括三种有用的组成分1可识别同源性MHC抗原分子的可溶性TCR，2.可溶性同源性MHC抗原分子以及3.抑制性化合物，抑制性化合物阻断TCR与MHC抗原分子间的特异性交互作用。用于本例，该检定分析的版本为TCR(1)需固定于微滴度孔板的孔；MHC抗原分子(2)及抑制性化合物(3)添加后，让其结合TCR(1)，然后结合程度系经过添加可识别MHC抗原的加标记的抗体或其它试剂揭示，透过化学反应(标记＝辣根过氧化酶[HRP]或碱性磷酸酶[AP])、或直接测量(标记＝放射性同位素或萤光化合物)提供读值。
例如于一种办法，制造重组细胞，该重组细胞例如可于重组单链版本表现可溶性TCR。纯化适量sc-TCR，然后制动于固体载体或固相例如多孔孔板，通常经历数小时至长达约24小时或更长时间。典型地，孔板的各孔包括制动TCR分子。随后适量加可检测标记的MHC抗原分子添加至各孔。一具体实施例中，选择可检测标记来提供MHC抗原分子的多元体化；但其它具体实施例中则该标记无需提供多元体化。视情况需要，MHC抗原分子可由载有融合提呈肽的MHC组成分组成。另外，MHC分子可为空白，此时分子可根据已经确立的程序载荷提呈肽。其它具体实施例中，MHC抗原系由MHC组成分复合共价键联或未经键联超抗原组成。但于使用多元体MHC抗原分子的例中，经常可加强微弱交互作用复合物的需求。如此显然本发明的本具体实施例于已知免疫复合物或怀疑该免疫复合物属于交互作用微弱者的情况下为较佳。
本例中，试验化合物可遵照前文讨论添加至各孔，包括于TCR或MHC抗原分子添加之前、之中或之后添加。特定感兴趣的试验化合物较佳调节TCR分子与多元体化或单元体MHC抗原分子间的特异性结合。
本具体实施例的特例提供于后文实施例16。本具体实施例中，筛选方法经设计而检测试验化合物，该试验化合物可调节264 TCR与其同源性MHC抗原(HLA-A2第I类分子载荷p53人类肿瘤阻遏子蛋白质的肽264-272片段)间形成的免疫复合物。
本具体实施例的另一特例提供于后文实施例17。本具体实施例中，筛选方法设计用以检测试验化合物，该试验化合物可调节衍生自多发性硬化症病人的单链TCR与其同源性MHC抗原(共价键联至MBP肽的单链HLA-DR2分子)间形成的自体免疫复合物。
本检定分析版本可有较宽多种变化。例如MHC抗原可固定于孔板上且使用可溶性一价或多价TCR检测。另外，可经过固定一种或另一种试剂于珠粒或树状聚合物以辅助溶液化学、捕捉或检测而设计反应于溶液中进行。
更特定例中，筛选版本如后MHC抗原附着于孔板，孔板经洗涤及阻断，加入可溶性TCR，于室温培育1小时。洗涤孔板，加入酶联结或生物素联结抗体，让其与TCR复合物交互作用30分钟至1小时。孔板经洗涤，再度使用酶联结抗生物素探测(若有所需)以及洗涤。加入产色酶基质，让酶将酶基质转成产色基团产物。中止反应，于孔板读取器收集结果，读取于适合该产色基团产物波长的吸光比。若MHC抗原系由肽-MHC复合物组成，则TCR对MHC抗原的整体需求为无肽或带有不相干肽存在下，TCR对MHC的亲和力的总和(Reich等人(1997)自然387617-620测量这种Kd交互作用对2B4 TCR及空白IEκ的交互作用为＞2mM)、TCR对载荷适当肽MHC的亲和力(Reich等人，同文-2B4对IEκ/MCC肽的Kd＝50-90μM；Seibel等人(1997)实验医学期刊1851919-1927-DO11对IAd/OVA肽的Kd＝31μM)、以及寡聚物形成提供的额外溶解度的总和(Reich等人)。使用的TCR价数影响整体检定分析条件(O’Herrin S.M.等人(1997)实验医学期刊1861333-1345，显示当使用二价TCRs相对于一价TCRs时亲和力约提高50倍)，属于需要精制的变量之一。
另一具体实施例中，检定分析经格式化成为均质检定分析，避免样本移转以及洗涤步骤时的相关问题。对高产出量及超高产出量筛选而言，以均质检定分析为佳。特佳均质检定分析为仰赖检测萤光或发光探针表示免疫复合物的形成的该种检定分析。这些检定分析的更特定例(但非限制性)为基于光学、萤光或发光强度的检定分析、时间解析萤光的检定分析、基于近似值的能量移转检定分析(包括萤光共振能移转检定分析、闪烁近似值检定分析及发光近似值检定分析)、萤光偏极化光谱术以及萤光交互关联光谱术。
如下实施例18提供本具体实施例的特定例。该例中，筛选方法设计成可检测试验化合物，该试验化合物可调节衍生自多发性硬化症病人的单链TCR与其同源性MHC抗原(共价键联至MBP肽的单链HLA-DR2分子)间形成的自体免疫免疫复合物。纯化后的MS sc-TCR及sc-DR2/MBP蛋白质分别制动于施体珠粒以及受体珠粒。受体珠粒设计成当其接近施体珠粒的紧邻附近时，经过制动TCR与MHC抗原分子间的交互作用而发射化学发光信号。经TCR及MHC抗原涂覆珠粒添加至微滴度孔，以时间分割模式测定形成免疫复合物导致的发光信号。试验化合物遵照前文讨论添加至各孔，包括于添加TCR或MHC抗原分子之前、之中或之后添加。特别感兴趣的试验化合物较佳系调节TCR分子与MHC抗原分子间的特异性结合。
前述筛选方法用来检测可抑制或刺激T细胞反应的化合物。一种肽或拟肽的筛选方法为，当结合至空白MHC分子的肽结合沟时可阻断MHC分子提呈其它肽抗体的能力(参考Lamont A.G.等人(1990)免疫学期刊(J.Immunity)1442493-2498，Falcioni F.等人(1999)自然生物技术17562-567)。如文中揭示，该方法识别可阻断功能性MHC抗原分子形成的化合物(换言之，MHC拮抗剂)。另一种筛选肽的方法为，当结合至空白MHC分子的肽结合沟时，导致形成MHC-肽复合物，该复合物可作用为TCR拮抗剂或激动剂(参考De Magistris M.T.等人(1992)细胞68625-634，Sette A.等人(1994)免疫学综论年报12413-413，Wilson D.B.等人(1999)免疫学期刊(J.Immunity)1636424-6434，Hiemstra，H.S.等人(2000)免疫学流行观点1280-84，Abrams S.I.等人(2000)免疫学流行观点1285-91)。如文中报告，该方法可识别作用于MHC作为肽抗原以及拟抗原(激动剂)或作为所谓的经改变的肽配位子(拮抗剂)的化合物。
本发明的筛选方法特色与前述筛选方法包括前一段所述的特定筛选不同。举例说明，本发明方法系检测与识别可调节TCR与其同源性MHC抗原[包括(预先形成的)同源性肽-MHC复合物]间的交互作用。本发明方法并非囿限于识别结合空白MHC分子的肽结合沟的化合物。如此，本发明方法提供检测较宽多种(或宽广范围)化合物其可调节TCR与MHC抗原分子间的交互作用的化合物。此外，本发明的特殊优点在于，检测可与TCR及/或MHC抗原分子交互作用的化合物。如此处教示，通过本发明方法识别的化合物预期具有与通过前述方法识别的化合物不同的性质(亦即结合特异性、组合物、药力学)。
需强调虽然前文讨论若干特例，但本发明有高度弹性而适合用于不同筛选版本之一或其组合，该等筛选版本包括使用完全可溶性分子的基于细胞的版本及其组合(例如一种完全可溶性分子以及一种细胞表现分子)，且本发明适合用于TCRMHC抗原交互作用扮演某种角色的任一种疾病。
用于本发明的多项应用用途，特定筛选的组成分包括可溶性单链TCR、带有或未带有基因联结肽或超抗原的可溶单链MHC、小分子或其它潜在激动剂或拮抗剂文库、以及其它产生可检测信号所需化合物。拮抗剂化合物经筛选而识别特异性阻断TCR与MHC抗原间的交互作用的化合物。若MHC抗原为肽-MHC复合物，则筛选将识别拮抗剂化合物，阻断TCR与MHC分子提呈的肽间的交互作用的化合物；以及识别通常可抑制与MHC组成分或特定MHC家族交互作用的化合物。若MHC抗原为超抗原-MHC复合物，则筛选将识别阻断TCR与MHC分子结合的超抗原间的交互作用的拮抗剂化合物、以及识别通常可抑制与MHC组成分交互作用的化合物。若MHC抗原为同种异体反应性(异种反应性)MHC分子，则筛选将识别可阻断TCR与同种异体反应性(异种反应性)MHC组成分间的交互作用的拮抗剂化合物。
本具体实施例中，本发明提供额外优点。如此处讨论，筛选可有效选出试验化合物，该试验化合物特异性抑制TCR与载有独特肽的MHC分子间的交互作用、或抑制与特定MHC家族交互作用的试验化合物。然后该化合物用来压抑自体免疫病或过敏病，该等疾病系经过(载有TCR的)T细胞与(载有MHC关联肽的)抗原提呈细胞间的交互作用所触发。抑制性化合物提供比抑制整体免疫反应的治疗更显著的优点，抑制性化合物抑制该疾病的特异性反应，而保留其余免疫反应不受影响。
另一具体实施例中，筛选可有效选出特异性抑制TCR与载有超抗原的MHC分子间的交互作用的试验化合物。然后这种化合物用来抑制由T细胞(载有TCR)与抗原提呈细胞(载有MHC关联超抗原)间的交互作用所触发的疾病及病情。再度这种抑制性化合物比较抑制整体免疫反应的治疗的显著优点，抑制性化合物只抑制该疾病的特异性反应，留下其余免疫反应不受影响。
又另一具体实施例中，筛选可有效选出特异性抑制TCR与同种异体反应性(异种反应性)MHC分子间的交互作用的化合物。这种化合物随后用来压抑组织移植关联的免疫反应，该反应系经过T细胞(载有TCR)与抗原提呈细胞(载有同种异体反应性或异种反应性MHC)间的交互作用所触发。再度这种抑制性化合物比较抑制整体免疫反应的治疗的显著优点，抑制性化合物只抑制该疾病的特异性反应，留下其余免疫反应不受影响。
其它具体实施例中，激动剂化合物经筛选而识别可特别加强TCR与MHC抗原间的交互作用的化合物。当MHC抗原为肽-MHC复合物时，筛选将识别激动剂化合物，该激动剂化合物扩大TCR与MHC分子提呈的肽间的交互作用，以及识别概略扩大与MHC组成分或特定MHC家族间的交互作用的化合物。当MHC抗原为超抗原-MHC复合物时，筛选将识别激动剂化合物，该激动剂化合物可扩大T细胞与MHC分子结合的超抗原间的交互作用，以及识别可概略扩大与MHC组成分的交互作用的化合物。当MHC抗原为同种异体反应性MHC分子时，筛选将识别可扩大TCR与同种异体反应性MHC组成分间的交互作用的该等激动剂化合物。
本具体实施例中，本方法提供额外优势。如此处讨论，筛选可有效选出MHC特异性扩大TCR与载有独特肽的MHC分子间的交互作用的试验化合物，或选出可扩大与特定MHC家族间交互作用的化合物。然后这种化合物用来刺激免疫反应，该免疫反应系经过T细胞(载有TCR细胞)与抗原提呈细胞(载有MHC关联肽)间的交互作用所触发。这种化合物可用于治疗传染病病因及癌症。激动剂化合物经过提供刺激该疾病的特异性免疫反应的独特方法而提供显著优势。这些化合物可组合传统免疫刺激疗法例如接种疫苗使用。
其它具体实施例中，激动剂化合物可用以治疗自体免疫病及过敏病等免疫病症。这种化合物的使用可能导致免疫偏差或诱导免疫反应，而可向下调节或抑制有害免疫反应。
如此处讨论，TCR依据例如检定分析条件而定，为若干可溶性分子形式之一。前文讨论及后文实施例提供多种可溶性TCR分子。例如该分子表现为三领域单链形式(scTCR)，亦即α可变领域(Vα)透过一个20个氨基酸甘胺酸-丝胺酸连接子([G4S]4)而融合至β可变领域(Vβ)及β恒定领域(Vβ)。于TCR的单元体形式，TCR可表现为可溶性单链、或TCR可融合至κ恒定区。TCR的多元体复合物可以多种方式制造经过基因融合至Ig恒定区(CH1、CH2及CH3)而制造二聚体；经过于一个细胞共同表现scTCR-IgGκ链及scTCR-IgG重链以制造四聚体复合物；以及此处说明的其它方法。
筛选方法也可使用其它TCR分子。例如更高阶多元体可经过将IgG改变成IgA或IgM制造。功能性多元体也可经过以化学方式交联scTCR至可溶性固体载体(例如树状聚合物)制成。多元体TCR分子的形式的其它用途说明将提供于另一专利案。也参考美国专利申请案第09/422,375号。也可制造其它形式的TCR分子，其含有共同受体CD4或CD8的MHC-结合区。
筛选采用的MHC抗原分子包括基因系结(提呈)肽，依据检定分析条件而定，可为若干可溶性分子形式之一。这种特定MHC抗原分子的可溶性形式说明参考例如美国专利申请案第08/596,387号及美国专利申请案第08/960,190号。类似对TCR的说明，若有所需也可制造MHC抗原的多元体形式供检定分析。
如此处讨论，本筛选方法有弹性，例如依据本TCR/MHC抗原分子及期望结果而定，可调整适合检测、识别及选择不同的试验化合物。
例如经常偏好检测于特定免疫复合物中表现为拮抗剂的试验化合物。本具体实施例中，采用的特定试验方法相对于此处提供的至少一种适当对照，显示免疫复合物的形成及/或稳定性至少降低约10％。
此外，若相对于此处提供的至少一种适当对照，试验方法显示免疫复合物的形成及/或稳定性至少增高10％，则该试验化合物为视为免疫复合物的激动剂。
更特佳，试验化合物可抑制或消除免疫复合物的形成。又更佳，试验化合物可增或减免疫复合物的亲和常数[KA]。
亲和常数的测定方法为业界已知，包括习知热力学测定。例如参考Alam，SM等人(1999)免疫10227-237。特别，若[TCR]为未经结合的TCR分子的莫耳浓度，[MHC抗原]为未经结合的MHC抗原分子的莫耳浓度，以及[TCR/MHC抗原]为免疫复合物的莫耳浓度，则KA方便经过测量约略平衡时的免疫复合物数量决定。于适用于检测拮抗性试验化合物的具体实施例中，相对于至少一种此处提供的适当对照例如相对于无试验化合物存在下的KA，该化合物较佳显示亲和常数至少减低约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％及又更佳至少减低约75％或100％。
但于其它具体实施例中，其中检定方法对筛选免疫复合物拮抗剂为最理想，则相对于对照，试验化合物显示亲和常数K升高约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％，又更佳至少约75％或100％至高达500％至约1000％。
也较佳试验化合物可增或减免疫复合物的生成速率。
免疫复合物的生成速率可使用习知热力学办法确定。例如参考Alam，SM等人(1999)免疫10227-237。特别免疫复合物的生成速率[k1]以及解离速率[k-1]方便使用这种办法及相关技术确定。通常为了确定形成速率及解离速率，于有以及无试验化合物存在下，监视特定TCR与MHC抗原分子间形成免疫复合物经历一段时间(例如数秒至数分钟或更长)。于试验化合物被视为拮抗剂的具体实施例中，相对于此处讨论的至少一种适当对照，例如相对于无试验化合物存在下免疫复合物的生成速率，该化合物的免疫复合物生成速率[k1]至少降低约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％及又更佳至少降低约75％或100％。
另外，于试验化合物被视为可破坏免疫复合物的稳定性而提高解离速率的具体实施例中，该化合物相对于对照，较佳显示解离速率[k-1]升高约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％，及又更佳至少约75％或100％至高达500％至约1000％。
于试验化合物可增进免疫复合物解离速率的具体实施例中，试验化合物偶尔于此处称作可破坏TCR/MHC抗原交互作用的稳定性及/或破坏免疫复合物的稳定性。
也较佳为可调节免疫复合物需求的试验化合物。若有所需，需求可通过免疫技术(例如后文所述免疫技术)之一或其组合观察及定量。于特定试验化合物降低TCR及MHC抗原分子需求的具体实施例中，相对于此处提供的至少一种对照，包括于无试验化合物存在下的需求，该化合物较佳显示可降低需求至少约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％及又更佳至少降低约75％或100％。但于另一具体实施例中，其中试验化合物被视为激动剂，则该化合物较佳显示相对于对照，需求增高约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％及又更佳至少约75％或100％至高达500％至1000％。
也较佳为显示免疫复合物多元体化的调节能力的试验化合物。若有所需，多元体化可通过一种或多种技术的组合观察与定量。例如参考Alam等人(1999)免疫10227-237，Reich等人(1997)自然387617-620。于特定试验化合物可减少TCR与MHC抗原分子的多元体化的具体实施例中，相对于此处提供的至少一种适当对照，包括于无试验化合物存在下的多元体化，该化合物较佳显示需求至少降低约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％，及又更佳至少降低约75％或100％。但于另一具体实施例中，其中试验化合物被视为激动剂，该化合物相对于对照，较佳显示多元体化升高约10％，较佳至少约20％，更佳至少约50％，及又更佳至少升高约75％或100％至高达约500％至约1000％。
进一步较佳的试验化合物为相对于适当对照，显示调节(换言之增或减)至少一种细胞反应典型为T细胞或T细胞杂交瘤反应达约1.5倍至约100倍。此处揭示方法的特定具体实施例中，较佳反应为细胞因子的制造，特别为IL-2细胞因子的制造。
此外，本发明的适当试验化合物较佳调节对照免疫复合物的形成能力可忽略不计。一具体实施例中，对照免疫复合物包括TCR分子及抗体，该抗体可特异性结合TCR分子的抗原决定部位，而该抗原决定部位未被特定MHC抗原分子(例如肽结合的MHC分子)所特异性结合(抗-TCR抗体)。另外，对照免疫复合物包括至少一分化群集(CD)蛋白质结合TCR分子例如于细胞膜。较佳CD蛋白质为CD3，抗体可特异性结合TCR分子的关联CD3(抗-CD3抗体)。
如此处讨论，本发明的目的系提供有用的医药组合物，其中包括至少一种通过本方法检测的试验化合物。这种组合物可以数种方式之一投予个体。例如特定试验化合物或试验化合物的组合可作为预防性投药来防止目标免疫疾病的发作或减低发病严重性。另外，这种试验化合物或医药组合物可于目标情况之前、之中或之后投予。
本发明的医药化合物，偶尔称作治疗化合物，可单独或组合一或多种治疗剂呈混合习知赋形剂(亦即医药可接受性有机或无机载剂物质)的医药组合物形式投予个体，该赋形剂适合供肠道外、经肠道或鼻内投药，且不会与活性化合物造成不良反应，也对药物组合物接受者无害。这种医药可接受性载剂包括例如但非限于水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、戊糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性软石蜡、香精油、脂肪酸一酸甘油酯类及二酸甘油酯类、石油醚脂肪酸酯类、羟甲基纤维素、聚乙烯基咯啶酮等。医药制剂可经灭菌，以及若有所需可混合不会与活性化合物产生不良反应的辅助剂，例如润滑剂、保藏剂、安定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、矫味剂及/或芳香物质等。
这些组合物可制备供肠道外投药用，特别制备成液体溶液剂或悬浮液剂剂型；供口服投药用，特别制成锭剂或胶囊剂型；供鼻内投药，特别制成散剂、鼻用滴剂或喷雾剂剂型；供阴道投药；供局部投药例如制成乳膏剂剂型；供直肠投药例如制成栓剂剂型等。
药剂可方便以单位剂型投药，且可通过制药界众所周知的任一种方法制造，制药方法例如述于雷明顿制药科学(默克出版公司，宾州伊士顿，1980年)。肠外投药用调配剂含有常用赋形剂，例如无菌水或食盐水、聚烷二醇类例如聚乙二醇、植物油、氢化链烷烃类等。特别生物兼容的生物可分解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为有用的赋形剂可用于控制某些通过本发明方法识别的试验化合物的释放。
其它有用的肠道外药物递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、渗透压帮浦、可植入输注系统以及微脂粒。吸入投药用调配物例如含有乳糖作为赋形剂；或可为例如含有聚氧乙烯-9-月桂基醚、糖胆酸酯及去氧胆酸酯的水溶液；或呈鼻用滴剂剂型投药的油性溶液或供鼻内施用的胶浆剂。肠外投药用调配物包括供颊用投药的糖胆酸酯、供直肠投药的甲氧水杨酸酯、或供阴道投药的柠檬酸。其它药物递送系统可将治疗剂直接递送至感兴趣的身体部位。
本发明的医药组合物可用于本治疗方法作为唯一活性药剂，或可组合其它活性剂包括具有已知免疫调节效果的药剂使用。这些药剂包括但非限于环孢灵、某些细胞毒剂、淋巴细胞、免疫球蛋白、肾上腺皮质类固醇、苏法沙拉辛(sulfasalazine)、KF-506、美苏沙朗(methoxsalen)、拉帕霉素(rapamycin)及沙利窦迈(thalidomide)。用于有关这些及其它有用药剂的揭示可参考例如治疗学的药理基础(第8版)Gilman，A.等人(编辑)麦克罗西尔卫生专业分公司，1264-1276页(1993年)。
治疗组合物中一或多种治疗性化合物的浓度将依据多项因素改变，该等因素包括欲投予的特定调配物剂量、采用的组合物的化学特性(例如疏水性)以及期望的投药模式及投药途径。通常一或多种检测得的试验化合物可呈含有约0.1至10％w/v化合物的水性生理缓冲溶液剂型供肠外投药。
需了解特定治疗的活性化合物实际较佳用量将依据下列因素改变，例如使用的特定化合物、调配的特定组合物、投药模式以及个体特征，例如个体的种族、性别、体重、一般健康情况及年龄。指定投药计划的最理想投予可由业界人士使用有关前述指导原则进行的习知剂量决定试验而确定。适当剂量包括约1微克/千克至约100毫克/千克体重/日的范围。
本发明的治疗性化合物适合以质子化形式且为水溶性形式投药，例如呈医药可接受性盐投药，典型系呈酸加成盐形式，例如无机酸加成盐如盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐；或有机酸加成盐如乙酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、酒石酸盐或柠檬酸盐。本发明的治疗性化合物的医药可接受性盐也包括金属盐，特别碱金属盐如钠盐或钾盐；碱土金属盐如镁盐或钙盐；铵盐如铵盐或四甲基铵盐；或氨基酸加成盐例如离胺酸盐、甘胺酸盐或苯基丙胺酸盐。
用于本发明的多项用途，于采用完全可溶性分子的具体实施例中，使用实质上纯质的TCR及MHC抗原分子特别有用。较佳这种分子系由细胞分离，细胞天然伴随取代基故融合蛋白质存在量至少为90至95％均质(w/w)。包括至少有98至99％均质度(w/w)的重组融合蛋白质的TCR及MHC抗原分子用于本发明的多项用途为最佳，例如涉及医药、临床以及研究用途。一旦经过实质纯化后，分子实质不含这种用途的污染物。一旦经部分纯化或纯化的实质纯度，分子可供治疗用、或用于此处揭示的试管内或活体内检定分析。实质纯度可由多种标准技术例如层析术及凝胶电泳测定。概略参考Sambrook等人，分子克隆实验室手册(第2版，1989年)；以及Ausubel等人(1989年)，分子生物学的流行方案，约翰威力父子公司，纽约，有关多种标准方法的讨论；其揭示以引用方式并入此处。
如此处讨论，TCR及MHC抗原分子可通过适当已知技术组合分离及纯化。这些方法包括例如利用溶解度的方法，例如盐沉淀及溶剂沉淀法；利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法；利用电荷差异的方法，例如离子交换管柱层析术；利用特异性亲和力的方法，例如亲和层析术；利用疏水性差异方法，例如反相高效液相层析术；以及利用等电点差异的方法，例如等电聚焦电泳、金属亲和管柱如Ni-NTA。概略参考Sambrook等人及Ausubel等人(参见上文)有关这些方法的相关揭示。
「完全可溶」等词表示本TCR或MHC抗原分子于低G-力离心(例如标准离心机每分钟低于约30,000转)下，不易由水性缓冲液如细胞培养基淀积。此外，融合分子若于低或无阴离子浓度或非离子清洁剂存在下，于高于约5-37℃温度以及于或接近于中性pH留在水溶液中，则该融合分子为可溶性。这种条件下，可溶性蛋白质经常具低淀积值，例如低于约10至50史瓦伯革(svedberg)单位。
如此处使用「片段」或「功能片段」参照TCR分子使用时表示比较对应的全长分子，可特异性结合的分子部分(异二聚体或大致包含全长V链的单链)系占特定MHC抗原分子至少约70％且较佳至少约80％、90％、95％至高达100％或以上。供举例说明，全长sc-TCR被定义为有全长V-α及V-β链的分子。同理，全长TCR异二聚体被定义为有全长α及β链的分子，特别也具有对应跨膜区域及胞质领域的分子。
用于此处揭示的MHC抗原分子，「片段」或「功能片段」表示分子部分(异二聚体或大致包含全长链的单链构成体)比较对应全长分子，该部分分子可特异性结合特定TCR分子的至少约70％且较佳至少约80％、90％、95％至高达100％或以上。供举例说明，全长sc-MHC定义为带有全长α及β链的分子。同理，全长MHC或HLA异二聚体系定义为有全长α及β链的分子，特别带有对应跨膜区域及胞质领域的分子。
「片段」或「功能片段」一词用于特定CD3ζ序列时表示可诱生本发明的细胞反应的部分全长序列。较佳为比较对应全长分子，可结合至少约70％且较佳至少约80％、90％、95％至高达100％或以上特定细胞反应的片段。
所揭示的片段及功能片段的特定组合检测用检定分析讨论于此处，特别包括流动细胞计量术以及BIA核心检定分析。
实施例1-单价单链MHC/肽复合物的生成A.表现带有特定提呈肽的可溶性单链IEκMHC第I类分子的载体的构建本研究目的系发展MHC抗原分子(如MHC/肽复合物)与T细胞受体(TCR)间的交互作用的激动剂及拮抗剂检测用的筛选方法。先前证实MHC第II类/肽复合物可呈重组单链分子生成，该分子仍然保有其与TCR交互作用且刺激T细胞反应的能力(Rhode等人1996免疫学期刊(J.Immunity)1574885，WO99/21572，USSN09/204,979)。曾经说明单链(sc)鼠IAd/肽及人HLA-DR2/肽复合物的生成(WO99/21572，USSN09/204,979)。sc-第II类分子系由β1-β2片段与α1-α2片段透过弹性肽连接子间的融合组成。此外，抗原性肽序列系透过肽连接子而联结至β1领域的胺基端。例如编码鸡卵白蛋白肽，亦即OVA 323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)或HSV-1糖蛋白D肽亦即GD 246-261(APYTSTLLPPELSETP)的序列系联结至scIAd基因融合分子的β1基因片段，而分别制成scIAd/OVA及scIAd/GD分子。抗原性肽位置为其可结合至经过适当折叠α1及β1领域形成的肽结合沟。这些分子于试管内可特异性刺激T细胞反应。例如scIAd/OVA蛋白质当制动于组织培养板时，可刺激DO11.10 T细胞杂交瘤释放IL-2；而scIAd/GD蛋白质可刺激GD12 T细胞杂交瘤释放IL-2(Rhode等人1996免疫学期刊(J.Immunity)1574885)。如下实施例所述，这些T细胞检定分析经修改而识别可抑制sc-MHC/肽分子刺激T细胞反应能力的该等化合物。作为这些抑制剂的MHC特异性的对照，开发一种T细胞检定分析，该检定分析涉及使用不同鼠sc-第II类/肽复合物特异性刺激T细胞。这种鼠sc-第II类/肽，亦即键联至PCC 88-104的单链IEκ(scIEκ/PCC)的产生说明如后。
用于scIEκ/PCC构成体的MHC第II类基因系由适当APC、CH12细胞产生的cDNA经过PCR扩大分离而得。IEκα及β链基因片段的经修饰版本则系使用克隆基因作为样板DNA，通过PCR扩大产生。这些片段以附图第7A-C图所示克隆方案中组装，结果获得一种编码抗原性肽PCC 88-104键联至单链IEκ分子的嵌合体基因。
含有各别α及β链片段的多种基因构成体的发展说明于下段。α1-α2基因片段第一股cDNA系作为使用引子VW487(470)以及VW489(477)进行PCR扩大的样板。克隆使用的寡核苷酸序列示于表1。此片段经过再度使用VW487(470)以及VW485(471)放大而延长3’端，结果获得α片段系以IAd穿膜「铰链」区为端基，接着为氨基酸序列MSGGGGC。此片段克隆于pGEM T-Easy(克隆科技(Clonetech)公司，加州保罗奥图)而获得质粒pTVW406。随后使用引子VW487(470)及VW490放大此α链，获得一片段，该片段旁出XhoI以及EcoRI含有「birA」位置用于试管内进行3’端的生物素化。该片段克隆入pGEM T-Easy而获得质粒pTVW420-8。C端片段及BirA端基片段含有XhoI限制性位点于5’端以及含有EcoRI限制性位点于3’端。β1-β2基因片段第一股cDNA作为使用引子VW486(469)以及VW488(472)进行PCR扩大的样板。此片段经过使用VW484(468)以及VW486(469)再度扩大而延长5’端，结果获得β片段，始于LSSAS，此处LS字码子表示AflII限制性位点，AS字码子表示NheI限制性位点。片段经克隆入pGEM T-Easy(克隆科技公司，加州保罗奥图)而获得质粒pTVW407-1及-3。结果所得构成体有13个氨基酸位在成熟β链第一氨基酸前方亦即LS(AflII)S AS(NheI)GGGGSGGG。编码PCC肽(KAERADLIAYLKQATAK)且旁出于内聚端(匹配使用AflII及NheI消化后留下残基)的寡核苷酸引子VW482(466)及VW483(467)经配对且克隆入pTVW407-3(其已经使用AflII+NheI消化)而获得质粒pTVW410-35。
scIEκ的构建说明如后。含有scIAd/OVA融合基因的pGEM T-Easy载体构建作为scIEκ基因的克隆样板。含有scIAd/OVA融合基因的得自质粒SSC1的NcoI至EcoRI片段(参考WO99/21572，USSN09/204,979)被导入使用相同限剪酶切割基于pGEM T-Easy的载体(pTVW406)。如此所得克隆样板(pTVW408)含有β链先导子序列，带有键联肽的β链旁出限制性位点AflII+SpeI，其为20氨基酸连接子序列(G4S)4，以及α链旁出限制性位点XhoI及EcoRI。衍生自pTVW406-2的含羧基端C的α链序列被导入pTVW408作为限剪片段，由XhoI及EcoRI结合结果获得载体406+408，其含有IAdβ链及IEκα链。含有经键联的PCC肽或单一丝胺酸(分别系衍生自pTVW407-3及410-35)的IEκβ链片段于使用AflII及SpeI消化后，克隆入这种质粒骨架，结果分别获得质粒pTVW417-6及pTVW416-6。这些构成体的β链含有突变，结果导致氨基酸38由天冬酰胺(N)改成丝胺酸(S)。系经过使用得自pTVW407-1(其含有正确β链序列)的片段置换pTVW417-6及pTVW416-6的HindIII至SpeI片段加以校正，而获得质粒pTVW422-1(含有PCC肽)及pTVW423-2(含有丝胺酸)。结果所得scIEκ基因融合克隆为质粒SSC1作为AflII/EcoRI片段，结果获得质粒pTVW424-1(PCC)及pTVW425-2(S)。如此系为了结合有效转译(换言之转译成Kozak序列)重要的序列。编码BirA位置的序列系经过将得自pTVW420-8的XhoI至EcoRI片段克隆入pTVW423-2，结果获得质粒pTVW427-3，而被添加至单链构成体。
含有scIEκ基因的昆虫细胞表现载体系于质粒pBluBac4.5(因维左金(InVitrogen)公司构建，让其编码以下各β链及α链的组合β前方为PCC肽键联至带有羧基端基半胱胺酸的α(PCC/C)；β前方为丝胺酸(「空白」形式)键联至带有羧基端基的半胱胺酸的α(S/C)；β前方为PCC肽键联至带有羧基端基birA序列的α(PCC/birA)；以及β前方为丝胺酸(「空白」形式)键联至带有羧基端基birA序列的α(S/birA)。载体的PCC/C及S/C形式分别系经过将得自pTVW424-1及pTVW425-2的XmaI至EcoRI片段，克隆入使用相同酶切割的pBluBac4.5，分别获得质粒pTVW429-2及pTVW428-1。这些载体的birA形式系经过将得自pTVW427-3的SpeI至EcoRI片段克隆入pTVW429-2及pTVW428-1，获得pTVW431-1(PCC/birA)及pTVW430-1(S/birA)而制备。
表1克隆使用的寡核苷酸命名 序列VW482(466)5’-tta agt aag gca gaa cga gca gat cta ata
gct tat cta aaa caa gcc acc gcg aag g-3’VW483(467)5’-cta gcc ttc gcg gtg gct tgt ttt aga taa gctatt aga tct gct cgt tct gcc tta c-3’VW484(468)5’-ctt aag tag cgc tag cgg agg ggg cgg aagcgg cgg agg ggc aag ctt cag acc atg g-3’VW485(471)5’-ccc gaa ttc tat tag cag cct cct cca cct gacatt ggg agg agg gtt ttc tc-3’VW486(469)5’-cca cta gtc cac tcg acc gtg aca gg-3’VW487(470)5’-ggt tcc tcg agt atc aaa gag gaa cac accatc-3’VW488(472)5’-gga ggg gca agc ttc aga cca tgg-3’VW489(477)5’-tga cat tgg gag gag ggt ttt ctc ttc-3’VW490 5’-gta cga att cta tta ttc gtg cca ttc gat tttctg agc ttc gaa gat gtc gtt cag gcc tcc tccacc tga cat-3’B.昆虫细胞的可溶性scIEκ/PCC分子的制造经纯化后的质粒pTVW429-2、pTVW430-1及pTVW401-1用于转移感染Bac-N-Blue DNA(因维左金公司)，重组病毒如因维左金公司Bac-N-Blue转移感染试剂盒手册F版所述分离及富集。整个过程系使用SF9细胞。
得自孔板或制造瓶的上清液样本通过ELISA试验是否存在有重组产物(scIEκ)。ELISA涉及将100纳克14-4-4S(法明金(PharMingen)公司)抗IEκ抗体涂覆于努马西索普(Nunc Maxisorp)孔板的各孔内，置于100微升PBS(磷酸盐缓冲盐水)于4℃隔夜。阻断系使用200微升10％FBS(胎牛血清)-PBS于37℃至少进行1小时，孔板以洗涤缓冲液(经过Tris缓冲的盐水(TBS)-0.1％吞恩(Tween)20)洗3次。样本以100微升/孔添加，于室温培养1小时。然后孔板以200微升洗涤缓冲液洗4次，50纳克生物素化抗体17-7-3(法明金公司)添加于100微升10％FBS-PBS，接着于室温培养1小时。孔板以洗涤缓冲液洗5次，加入100微升的100纳克/毫升中性抗生物素辣根过氧化酶结合物(皮尔思(Pierce)公司)。于室温培养1小时后，孔板以洗涤缓冲液洗5次，每孔加入100微升3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)试剂(生物FX(BioFX)实验室)。添加100微升0.18M硫酸来终止反应，读取于450纳米的吸光比。
共同转移感染混合物如因维左金公司手册的摘述程序对各别溶菌斑进行接种，分离的蓝溶菌斑用来制备小型孔板溶解产物，用作为病毒备料，且通过前述ELISA试验IEκ反应性。使用pTVW431-1(PCC/birA)共同转移感染所得5个溶菌斑之上清液的A450值例如显示于表2。信号的特异性系由于SF9细胞分泌scIEκ/PCC至培养上清液。
表2得自共同转移感染的昆虫细胞培养上清液的IEκELISAA450值溶菌斑命名上清液微升ABCDE100 0.4950.4320.2350.4270.292500.2760.2430.1460.2800.177250.1620.1620.1100.1890.1270 0.0520.0510.0550.0530.055由小规模孔板溶解产物制备高滴度病毒备料，用以转移感染1升生长至1×106细胞/毫升的SF9细胞培养。感染所得上清液用于纯化scIEκ(说明如后)。纯化后的scIEκ带有联结PCC肽检定分析其调节2B4 T细胞杂交瘤活化的能力，容后详述。
C.于昆虫细胞表现的scIEκ/PCC分子的纯化感染可表现scIEκ/PCC蛋白质的重组杆病毒的SF9细胞所得上清液于感染后5日收获。于9,500xg、4℃离心10分钟，而由培养基分离细胞。然后澄清上清液的H调整至8，结果获得混浊白色沉淀。此沉淀经过于12,000xg、4℃离心30分钟至2小时去除。离心所得上清液通过0.2微米过滤器过滤，准备用于免疫亲和层析术。
免疫亲和层析术系将如前述制备的样本施用于与N22交联的西法罗斯(Sepharose)4B(法玛西亚(Pharmacia)公司)管柱，N22为ATCC(美国转行培养收集会)细胞系HB225产生的抗-IA及IE抗体。管柱以20mM Tris pH8.0平衡，以缓冲液洗涤至达到A280nm基准线值。然后抗体管柱于含1M氯化钠的相同缓冲液洗涤去除非特异性结合蛋白质。IEκ蛋白质通过施用PBS洗提，接着通过50mM甘氨酸-氢氧化钠pH11洗提。蛋白质系于二尖峰洗提(通过A280监视)，第一尖峰于PBS，第二尖峰于pH11。于pH11洗提的尖峰立刻以盐酸调整至pH7-8。然后得自各尖峰的样本经浓缩，且通过超滤经缓冲液交换入PBS。IEκ样本的纯度及功能分别以硫酸十二烷酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及T细胞活化检定分析(参见下文)试验。如此制备所得纯化后的scIEκ/PCC于库马西(Coomassie)染色聚丙烯酰胺凝胶未显示污染带，通过吸光比检定分析，总蛋白浓度＝0.37毫克/毫升。
D.T细胞通过scIEκ/PCC复合物活化T细胞杂交瘤2B4于IEκ第II类MHC分子，应答于PCC肽制造IL-2。IL-2的制造系于下段所述活化检定分析评比。努马西索普孔板的各孔涂覆以scIEκ/PCC与抗鼠IL-2抗体混合物(法明金公司，18161D)悬浮于100微升PBS，scIEκ分子的存在浓度为400至12.5纳克/孔，抗IL-2抗体的存在浓度为100纳克/孔。于4℃涂覆隔夜后，溶液由孔板取出，每孔添加1×1052B4细胞于100微升含10％FBS的IMDM。孔板于37℃于10％二氧化碳培养8小时，然后以洗涤缓冲液(TBS含0.1％吞恩20)洗3次。加入经生物素加标记的抗鼠IL-2抗体(法明金公司，18172D)于10％FBS-PBS，于4℃培养隔夜。然后孔板以洗涤缓冲液洗3次，加入100微升的100纳克/毫升中性抗生物素辣根过氧化酶结合物(皮尔思公司)，于室温培养15分钟至1小时。培养后，接着以洗涤缓冲液洗3次，加入100微升TMB酶基质让其显色。加入100微升0.18M硫酸终止反应，于450纳米读取吸光比。显示scIEκ/PCC活化2B4细胞的检定分析结果显示于表3。固定于孔板上的100至200纳克scIEκ/PCC间进行尖峰刺激，较高及较低浓度的吸光比值降低。
表3通过scIEκ/PCC蛋白质活化2B4 T细胞scIEκ/PCC(纳克/孔) 吸光比(450纳米)400 0.216200 0.485100 0.413500.234250.08112.5 0.0540 0.056实施例2-多价单链IAd/肽-生物素/抗生物素复合物的生成A.scIAd/肽-BirA复合物表现载体的构建实施例1说明一价单链第II类/肽分子用于刺激T细胞反应的生成及用途。一价复合物作为MHC抗原-TCR交互作用的探针的限制之一为MHC抗原分子与TCR间特有亲和力低。此项问题可透过生成多价MHC抗原复合物予以克服。多价复合物有多项用途可用于发展检测MHC抗原-TCR交互作用抑制剂的筛选方法(述于后文实施例)。本实施例以及实施例3至5说明产生多价单链MHC抗原复合物的方法。
一种产生多价MHC抗原如多价MHC/肽复合物的方法，涉及将MHC/肽分子生物素化，结合高达4个生物素化分子成为单一抗生物素分子。作为生物素接合酶目标序列的特定肽序列可添加至MHC/肽分子。这些序列允许每个MHC/肽分子添加单一生物素部分。然后生物素化MHC/肽分子可透过生物素与抗生物素间的高度亲和力交互作用而形成多价复合物(二聚体至四聚体)。
例如编码IAdα1-α2片段且使用生物素接合酶BirA目标序列编码的DNA序列，GGGSLNDIFEAQKIEWHE，由pTVW421-41作为XhoI-EcoRI片段，移转入pTVW408-1而形成pMBBir1。然后载体使用SalI切割，旁出的限制性位点经消化而形成钝端。然后载体以NcoI切割，DNA插入子片段经纯化。Blubac III载体(因维左金公司组件编号120415)以Hind III切割，旁出的限制性位点经消化而形成钝端。然后载体NcoI切割，载体骨架片段经纯化及接合至插入子片段。结果所得Blubac III载体、pMBO33、载有scIAd/OVA-BirA插入子。
B.于昆虫细胞制造可溶性scIAd/OVA-BirA分子载有scIAd/OVA-BirA插入子的Blubac III载体用于共同转移感染，通过溶菌斑纯化由野生型AcMNPv让重组病毒含量变丰富(参考D.R.O’Reilly等人，杆病毒表现载体实验室手册W.H.富利曼公司纽约(1992年)以及因维左金Bac-N-Blue转移感染试剂盒指导手册版本G型号#K855-01)。整个过程使用SF9细胞。
昆虫细胞以高度感染重复率(moi)感染TNMFH昆虫细胞培养基(JRH生科公司组件编号51942-79P)带有10％胎牛血清(海可龙(Hyclone)SH 30071.03)而制造重组scIAd/OVA-BirA蛋白质。感染后约96小时，感染上清液的pH以10N氢氧化钠调整至8.0，以高速(大于10,000Xg)离心去除颗粒物质以及经过0.2微米过滤。处理后之上清液通过IA-特异性ELISA如前文所示接受试验(Rhode等人，1996，免疫学期刊(J.Immunity)1574885)。
C.scIAd/OVA-BirA分子的纯化及多元体化pH8.0的经过滤的感染上清液施用于蛋白质A西法罗斯管柱，该西法罗斯使用M5以及抗-IAd单株抗体交联。样本施用后，免疫亲和管柱以20mM Tris-HClpH8.0洗涤至达到A280nm基准线为止。然后抗体管柱以前述含1M氯化钠的相同缓冲液洗涤去除非特异性结合蛋白质。然后scIAd/OVA-BirA蛋白质以50mM甘胺酸氢氧化钠pH11洗提。洗提出的尖峰蛋白质(通过A280nm监视)即刻使用2M甘胺酸pH2.0调整至pH8.0，经浓缩，及通过超滤进行缓冲液交换入PBS。纯化后的样本储存于4-8℃。scIAd/OVA-BirA样本的纯度及功能系通过硫酸十二烷酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试验。
BirA标记离胺酸的生物素化系通过加入大肠杆菌生物素接合酶(阿维帝(Avidity)BIRA500)以及生物混合物(Biomix)缓冲液A及B(阿维帝，连同生物素接合酶一起供应)达成。生物素化蛋白质与抗生物素共同培养而形成scIAd/OVA-BirA复合物。scIAd/OVA-BirA抗生物素＝4∶1比例时，约有80％ scIAd/OVA-BirA分子形成比单元体更大的多元体复合物，由可证SDS-PAGE。
D.通过多价scIAd/OVA-BirA复合物活化T细胞为了试验多元体活性，多元体或单元体(不含抗生物素)涂覆于努克(Nunc)微滴度孔上，加入DO11.10细胞，经24小时后，收获上清液，如前述通过ELISA测定相对IL-2含量(Rhode等人，1996，免疫学期刊(J.Immunity)1574885)。典型实验的吸光比值显示于表4。
表4通过多价scIAd/OVA-BirA复合物活化DO11.10 T细胞IL-2 ELISA值(A450)纳克复合物/孔 通过多价scIAd/OVA 通过一价scIAd/OVA
-BirA复合物刺激 -BirA复合物刺激100 1.865 1.165500 1.598 1.055125 0.916 0.51362 0.744 0.39831 0.554 0.242显示scIAd/OVA-BirA分子可经生物素化，单分子抗生物素可结合多于一分子生物素化scIAd/OVA-BirA，多元体为比单体远更强的IL-2制造刺激剂。
实施例3-多价单链IAd/肽-IgG复合物的生成A.scIAd/肽-IgG复合物表现载体的构建第二种生成多价MHC抗原复合物的策略系利用免疫球蛋白恒定领域作为分子骨架。这种办法中，构建表现载体，其编码单链MHC/肽分子呈融合分子至IgG重链及轻链恒定领域。先前曾经说明DNA构成体的生成，该DNA构成体可表现肽联结单链MHC第II类分子融合至免疫球蛋白Cκ领域(WO99/21572)。pIADK载体含有表现卡匣，该表现卡匣编码OVA 323-339肽联结至一个融合至鼠IgI Cκ领域的scIAd。pDRHK载体含有表现卡匣，该表现卡匣编码人类MBP 84-102肽联结至一个融合至人类IgI Cκ领域的scDR2(1501)。这些载体的组装细节说明如前(WO99/21572)。这些载体已经遵照布达佩斯条约寄存于ATCC。DNA载体系于1997年9月17日寄存，有存取编号209274(pDRHK)及209275(pIADK)。这些载体及其构建中间物系作为下述载体构建的起始物料以及作为实施例4的起始物料。
此外，构建载体用于哺乳类表现scIAd/GD-小鼠IgI Cκ融合分子。为了构建这种载体，含有scIAd/OVA构成体的细菌性穿梭载体pJA(参考WO99/21571)使用EcoRV及NheI消化而去除OVA肽编码序列。经过配对的编码gD 246-261的寡核苷酸(OPR225/OPR226-寡核苷酸列举于表5)次克隆入经过消化的pJA载体，结果获得pIAGK穿梭载体。然后pIAGK载体使用EcoRV及BstBI消化。含scIAd/GD基因的片段经纯化，且次克隆入经EcoRV/BstBI消化的pIADK载体，结果获得pIAGMK表现载体。这种表现载体可于哺乳类细胞表现scIAd/GD-Cκ融合分子。
已经构建出可表现scIAd/肽分子与鼠IgG2b重链的CH1-CH2-CH3领域间的融合分子的载体。对于scIAd/OVA构成体，pIADK作为使用寡核苷酸引子OPR237及OPR239进行PCR扩大的样板DNA。对于scIAd/GD构成体，pIAGMK作为使用寡核苷酸引子OPR237及OPR239进行PCR扩大的样板DNA。结果所得PCR产物载有scIAd/OVA或scIAd/GD基因融合分子，载有5’NruI位置以及3’EcoRI位置，这种位置为克隆入哺乳类表现载体pSUN7所需。这种基于pCDNA3的载体载有表现卡匣，该表现卡匣编码免疫球蛋白先导子序列及小鼠IgG2b CH1-CH2-CH3领域。这种载体中，NruI及EcoRI限制性位点分别位于接近先导子序列3’端以及CH1领域起点(5’端)。PCR产物克隆入pGEM-T Easy，产生scIAd/GD构成体用的pGEM-GD7载体、以及scIAd/OVA构成体用的pGEM-OVA3载体。于序列证实之后，于使用NruI及EcoRI消化后分离scIAd/GD及scIAd/OVA基因片段。纯化后的片段次克隆于经过NruI/EcoRI切割的pSUN7，结果获得分别供scIAd/GD-IgG重链融合分子以及scIAd/OVA-IgG重链融合分子用的pJA-IgG2b/GD及pJA-IgG2b/OVA表现载体。
表5用于scIAd/肽-IgG载体构建的寡核苷酸OPR2255’-ATC GCC CCC TAC ACC AGC ACC CTG CTGCCC CCC GAG CTG AGC GAG ACC CCC G-3’OPR2265’-CTA GCG GGG GCT TCG CTC AGC TCG GGGGGC AGC AGG GTGCTG GTG TAG GGG GCGAT-3’OPR2375’-CAC CGC GTC GCG ACA GCT ACA GGT GTCCAC TCC ATC TCT CAG GCT GTT CAC-3’OPR2385’-CAC CGC GTC GCG ACA GCT ACA GGT GTCCAC TCC GCC CCC TAC ACC AGC ACC CTGCTG CCC-3’OPR2395’-CAC CGC GAA TTC GCT CCC TGA CAT GGGGGC TGG AAT CTC AGG TTC-3’B.哺乳类细胞的制造以及多元体scIAd/肽IgG融合分子的纯化为了表现多元体scIAd/GD-IgG分子，哺乳类细胞使用pIAGMK及pJA-IgG2b/GD载体以及一种含有可提供(普罗霉素(puromycin)的载体pPUR(克隆科技公司)共同转移感染。简言之，CHO细胞混合线性化质粒DNAs，使用舒跑费特(Superfect)转移感染通过遵照制造商的指示(奎金(Qiagen)公司)转移感染。转移感染后的细胞于非选择性IMDM培养基生长隔夜。然后加入普罗霉素选择性培养基(IMDM培养基，20微克/毫升普罗霉素)，细胞移至96孔平底组织培养孔板。使用载体共同转移的细胞群落于14-21日后变显著。载有scIAd/GD-Cκ及scIAd/GD-Ig重链载体的转移感染株经扩大，通过IgG2b重链/κ链多元体特异性ELISA，筛选可溶性scIAd-Ig融合分子的表现。简言之，ELISA涉及涂覆100纳克山羊抗-小鼠IgG2b(南方生物技术协会)至努马西索普孔板的孔内，于100微升PBS(磷酸盐缓冲盐水)于4℃培养隔夜。取出涂覆溶液，200微升10％ FBS(胎牛血清)-PBS加至各孔，于室温经2-3小时时间来阻断各孔。取出阻断溶液，以100微升/孔添加样本及于室温培养1小时。然后孔板以200微升洗涤缓冲液及100微升山羊抗小鼠κ链-HRP(南方生物技术协会-备料于样本稀释剂内稀释1000倍)洗4次，于室温培养2小时。孔板以洗涤缓冲液洗6次，加入100微升TMB。显色后，添加100微升0.18M硫酸终止反应，于450纳米读取吸光比。阳性孔也使用前述IA-特异性ELISA筛选(WO99/21572，USSN09/204,979)。基于检定分析结果，选出阳性转移感染株，如前述通过限制稀释克隆而克隆(USSN 09/204,979)。克隆后的转移感染株于多个T175组织培养瓶内扩大及生长2-3周，制造2-4升含scIAd/GD-IgG多元体的培养基。进行类似操作，生成使用pIADK及pJA-IgG2b/OVA载体共同转移感染的CHO细胞系。这些转移感染株于T175烧瓶内扩大而产生2-4升含scIAd/OVA-IgG多元体的培养基。
单链第II类-IgG融合分子通过标准方法使用蛋白质A-西法罗斯通过亲和层析术纯化(USSN09/204,979)。某些情况下，加入使用抗牛IgI Ab管柱进行额外层析步骤，去除残余血清牛免疫球蛋白。纯化后scIAd/OVA-Ig及scIAd/GD-Ig分子的SDS-PAGE分析显示于第8图。
C.通过多价scIAd/OVA-IgG复合物活化T细胞经纯化的scIAd/OVA-IgG及scIAd/GD-IgG复合物通过IL-2产量，测定其活化肽-特异性T细胞杂交瘤的能力。这种方法涉及涂覆scIAd/肽-IgG蛋白质及大鼠抗小鼠IL-2单株抗体(法明金公司，组件编号18161D)于马西索普孔(NUNC组件编号469949)上，于PBS于4℃隔夜。取出涂覆溶液，每孔加入1×105T细胞(DO11.10或GD12)于200微升IMDM(媒体科技(MediaTech)赛尔葛罗(Cellgro)公司，组件编号15-016-CV)含10％FBS。于37℃含10％二氧化碳的潮湿孵育器内培养8小时后，孔板以洗涤缓冲液洗3次，以100纳克/孔于100微升10％FBS-PBS加入抗IL-2抗体结合至生物素(法明金公司，组件编号18172D)。于4℃培养隔夜后，孔以洗涤缓冲液洗3次，每孔加入250纳克抗生物素过氧化酶(西革玛(Sigma)公司，组件编号A3151)于100微升FBS-PBS。于37℃培养30分钟后，各孔以洗涤缓冲液洗5次，每孔加入100微升ABTS酶基质(科葛德及派锐(Kirkegaard and Perry)公司，组件编号5060-00)。于405纳米测量吸光比。使用DO11.10细胞进行活化检定分析结果示于表6，使用GD12细胞的活化检定分析结果示于表7。scIAd-IgG构成体的抗原肽由OVA改成GD，造成单链分子刺激DO11.10细胞制造IL-2的能力消失；对GD12细胞观察得相反特异性。scIAd/肽-IgG蛋白质活化T细胞反应的能力，进一步经过于T细胞活化检定分析，与一价scIAd/OVA分子做比较决定其特征。检定分析显示经制动的scIAd/肽-IgG分子刺激T细胞反应的活性比scIAd/肽单体高2-8倍。
表6通过scIAd/OVA复合物活化DO11.10 T细胞IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔 scIAd/OVA-IgG scIAd/GD-IgG scIAd/OVA scIAd/GD1002.90 0.166 3.06 0.15250 2.11 0.155 1.1925 0.758 0.166 0.20912.5 0.184 0.159 0.176
表7通过scIAd/GD复合物活化GD12 T细胞IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔 scIAd/OVA-IgG scIAd/GD-IgG scIAd/OVA scIAd/GD100 3.16 0.115 0.484 0.12350 1.76 0.122 0.13825 0.7510.115 0.12112.50.3470.123 0.134实施例4-多价单链DR2/MBP-IgG复合物的生成A.多元体单链DR2/MBP-IgG复合物的表现载体的构建scDR2/MBP-IgG重链融合分子的表现载体的构建进行如后。pDRHK载体系作为使用寡核苷酸引子OPR254及OPR257进行PCR扩大的样板DNA(参考表8)。结果所得PCR产物载有scDR2/MBP基因融合分子以及克隆入哺乳类表现载体pJRS355需要的5’BisWI位置以及3’EcoRI位置。这种基于pCDNA3的载体载有表现卡匣，该表现卡匣编码免疫球蛋白先导子序列及人类IgG1 CH1-CH2-CH3领域。此载体中，BisWI及EcoRI限制性位点分别系位于接近先导子序列3’端以及CH1领域起点(5’端)。PCR产物克隆入pGEM-T而产生JA-DR2-3载体。于证实序列后，于使用BisWI及EcoRI消化后，由JA-DR2-3分离scDR2/MBP基因片段。纯化后的片段次克隆于经BisWI/EcoRI切割的pJRS355，结果获得pD2MigH表现载体。
表8用于构建scDR2/MBP-IgG载体的寡核苷酸OPR2545’-CAC CGC GAA TTC GCT CCC TGG GAG AGGGCT TGG AGC ATC-3’OPR2575’-CAC CGC GCG TAC GTC TTG TCC TAC GACGAG AAC CCC GTG-3’B.哺乳类细胞的制造以及多元体scDR2/MBP-IgG融合分子的纯化为了产生可表现多元体scDR2/MBP-IgG分子的细胞系，使用事先转移感染pDRKH表现载体的CHO细胞系。这种细胞细节述于USSN09/204,979。经过pDRKH转移感染的CHO细胞混合线性化pD2MigH以及超螺旋化pMACS质粒DNAs，使用基因脉冲仪(拜雷(Biorad)公司)电穿孔。pMACS载体可暂时性表现与膜结合的CD4蛋白质。共同转移感染细胞如先前所述选择细胞表面的CD4表现(USSN09/204,979)。细胞于96孔平底组织培养孔板的非选择性IMDM培养基生长。以载体转移感染的细胞群落于14-21日后变显著。载有scDR2/MBP-Cκ及scDR2/MBP-Ig重链载体二者的转移感染株经扩大且通过重链-HLA-DR融合分子特异性ELISA，筛选可溶性scDR2-Ig融合分子的表现。简言之，ELISA涉及涂覆1微克山羊抗Fd抗血清(结合位置)至努马西索普孔板的各孔上，于100微升PBS(磷酸盐缓冲食盐水)于4℃培养隔夜。移开涂覆溶液，300微升10％FBS(胎牛血清)-PBS加至各孔，于室温经2-3小时时间来阻断各孔。阻断溶液经移开，样本以100微升/孔添加及于室温培养1小时。然后孔板以200微升洗涤缓冲液及100微升抗-HLA-DR单株抗体L234-HRP(备料于样本稀释剂稀释1000倍)洗4次，于室温培养2小时。孔板以洗涤缓冲液洗6次，加入100微升TMB。于显色后，加入100微升0.18M硫酸终止反应，读取于450纳米的吸光比。阳性转移感染株也使用前述DR-特异性ELISA筛选(WO99/21572、USSN09/204,979)。基于这些检定分析结果，如前述选出阳性转移感染株，且通过限制稀释克隆而克隆(USSN09/204,979)。克隆后的转移感染株于多个T175组织培养瓶内扩大及生长2-3周，制造2-4升含scDR2/MBP-IgG多元体的培养基。
实施例5-多价scIAd/肽-IgM分子的生成A.于昆虫细胞可溶性scIAd/肽-IgM融合分子的表现载体的构建作为使用Ig骨架来形成多价复合物的另一种办法，构建表现载体，表现载体编码单链MHC/肽分子呈与IgM CH2-CH3-CH4领域的融合分子。人类IgM重链的CH2-CH3-CH4部分使用RT/PCR由人类B淋巴瘤细胞系RL(ATCC编号CRL-2261)扩大。使用奎金总RNA试剂盒(组件编号14162)制造总RNA，使用引子MBimr(5’-GGG GGGCCA TGG CTC GAG TCA GTA GCA GGT GCC AGC TG-3’)制造cDNA。cDNA用作为使用MBimr及MBimf(5’-GGGG GGA TCC GTG ATT GCT GAG CTG CCT CC-3’)进行PCR扩大的样板。扩大后的基因片段接合入因维左金pGEM T-Easy载体(组件编号A1360)证实其序列，呈BamHI/XhoI片段转移感染入PSL1190载体(法码西亚公司)。
含有OVA 323-339或HSV 246-261抗原肽基因联结至scIAd融合分子的基因片段[如pMBSC2.1所述(USSN5,869,270)]系使用引子MB101(5’-GGG CCA TGG CTCTGC AGA TCC CCA GCC-3’)及MB100(5’-GGG GGA TCC ACT AGC CCG GGA CCA GTG-3’)通过PCR扩大。PCR产物使用NcoI及BamHI消化，且转移感染入经以NcoI/BamHI切割的IgM-PSL1190载体，结果获得载有scIAd/OVA-IgM构成体的pMB062以及载有scIAd/GD-IgM构成体的pMB062。整个基因融合分子呈NcoI/HindIII片段转移感染入得自因维左金公司(组件编号120415)的pBlubac III载体，结果获得载有scIAd/OVA-IgM构成体的pMB060以及载有scIAd/GD-IgM构成体的pMB061。
B.于昆虫细胞制造可溶性scIAd/肽-IgM融合分子带有插入子的pMB060及pMB061各别用于共同转移感染，通过溶菌斑纯化而由野生型AcMNPv重组病毒变丰富(参考D.R.O’Reilly等人，杆病毒表现载体实验室手册W.H.富利曼公司纽约(1992年)以及因维左金Bac-N-Blue转移感染试剂盒指导手册版本G型号#K855-01)。整个过程使用SF9细胞。
昆虫细胞以高度感染重复率(moi)于带有10％胎牛血清(海可龙SH 30071.03)的TNMFH昆虫细胞培养基(JRH生科公司组件编号51942-79P)感染，而制造重组scIAd/OVA-IgM蛋白质。感染后约96小时，感染上清液的pH以10N氢氧化钠调整至8.0，以高速(大于10,000Xg)离心去除粒状物质以及经过0.2微米过滤。处理后之上清液通过ELISA试验识别可溶性融合蛋白质。ELISA进行时，涂覆100纳克M5/114(ATCC TIB 120)抗-IAd于96孔微滴度孔板的各孔内，置于50微升PBS。使用125微升10％FBS-PBS进行高蛋白清洗而去除未结合的抗体。样本稀释于10％FBS-PBS，以100微升/孔添加。于37℃经1小时后，孔板以375微升洗涤缓冲液(PBS带有0.05％吞恩-20)洗3次。生物素化山羊抗人IgM(西革玛公司，组件编号B-1265)于100微升10％FBS-PBS 10％FBS稀释1∶4000添加至孔。于37℃经1小时后，孔板以洗涤缓冲液洗3次。以每孔250纳克加入抗生物素过氧化酶(西革玛公司，组件编号A3151)于100微升10％FBS-PBS，于37℃培养30分钟。然后孔板以375微升洗涤缓冲液洗5次，每孔加入100微升ABTS酶基质(科葛德及派锐公司，组件编号5060-00)。于405纳米测量吸光比。
感染方式系添加一个纯化后的溶菌斑至含有高存活率SF9细胞的50毫升生长培养基。72小时后，使用50毫升感染物中的10毫升作为病毒备料来感染400毫升SF9细胞。96小时后，如前述对得自400毫升感染物之上清液进行ELISA。重复孔所得吸光比平均值显示于下表9。观察得的信号特异性显示系由于SF9细胞分泌scIAd/OVA-IgM至感染上清液。
表9昆虫细胞感染上清液的scIAd/OVA-IgM ELISA样本稀释度 吸光比(405纳米)未经稀释1.2741∶20.9641∶40.7391∶80.4881∶16 0.3611∶32 0.279包括样本稀释剂的阴性对照(A405＝0.171)以及昆虫细胞产生不含IgM端基的scIAd/OVA(A405＝0.175)，于本检定分析显示背景结合。
使用载有scIAd/GD-IgM表现卡匣的杆病毒感染的昆虫细胞所得上清液。通过本ELISA同样显示制造scIAd/GD-IgM分子。
C.scIAd/肽-IgM融合分子的纯化pH8.0的经过滤的感染上清液施用于使用M5(一种抗-IAd单株抗体)交联的蛋白质A西法罗斯管柱上。样本施用后，免疫亲和管柱以20mM Tris-HCl pH8.0洗涤至达到A280nm基准线为止。然后抗体管柱以前述含1M氯化钠的相同缓冲液洗涤去除非特异性结合的蛋白质。然后scIAd/OVA-IgM蛋白质以50mM甘胺酸氢氧化钠pH11洗提。洗提出的尖峰蛋白质(通过A280nm监视)即刻使用2M甘胺酸pH2.0调整至pH8.0，经浓缩，通过超滤进行缓冲液交换入PBS。纯化后的样本储存于4-8℃。scIAd/OVA-IgM样本的纯度及功能分别通过SDS-PAGE及T细胞活化试验。由此制品所得纯化后的scIAd/OVA-IgM于库马西染色聚丙烯酰胺凝胶未显示污染带，通过总蛋白检定分析测得总蛋白为60毫克/毫升。当链间双硫键未经还原时分析，scIAd/OVA-IgM蛋白质显然系由较高阶(三元体以及更高)多元体组成。类似纯化方法用以由经感染的昆虫细胞培养上清液生成scIAd/GD-IgM蛋白质。
D.scIAd/肽-IgM复合物用于刺激T细胞反应的活性经纯化的scIAd/OVA-IgM复合物通过IL-2产量测量，试验其是否可活化OVA-特异性DO11.10 T细胞杂交瘤。这种方法涉及涂覆scIAd/OVA-IgM蛋白质(或scIAd/GD-IgM蛋白质作为对照)以及大鼠抗小鼠IL-2单株抗体(法明金公司组件编号18161D)于马西索普孔(NUNC组件编号469949)上，于PBS，于4℃培养隔夜。取出涂覆溶液，每孔加入1×105DO11.10细胞于200微升含10％ FBS的IMDM(媒体科技赛尔葛罗公司，组件编号15-016-CV)。于37℃含10％二氧化碳的潮湿孵育器内培养8小时后，孔板以洗涤缓冲液洗3次，结合至生物素的抗IL-2抗体(法明金公司，组件编号18172D)以每孔100纳克于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔以洗涤缓冲液洗3次，每孔加入250纳克抗生物素过氧化酶(西革玛公司，组件编号A3151)于100微升FBS-PBS。于37℃培养30分钟后，各孔以洗涤缓冲液洗5次，每孔加入100微升ABTS酶基质(科葛德及派锐公司，组件编号5060-00)。测量于405纳米的吸光比。活化检定分析结果显示于下表10。scIAd-IgM构成体中唯有抗原肽由OVA改成GD，可去除单链分子刺激DO11.10细胞制造IL-2的能力。单独带有制动抗IL-2抗体的DO11.10细胞或带有scIAd/GD-IgM及抗IL-2抗体二者的DO11.10细胞皆未能分泌IL-2。
表10通过多价scIAd/OVA-IgM复合物活化DO11.10 T细胞IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔通过scIAd/OVA-IgM刺激 通过scIAd/GD-IgM刺激300 0.853 0.248100 1.700 0.22133 1.637 0.20611 0.601 0.1884 0.230 0.1791 0.195 0.1840.3 0.192 0.189单独抗IL-2 0.214 0.200
为了进一步决定scIAd/肽-IgM蛋白质活化T细胞反应能力特征，多价scIAd/肽-IgM分子于前述T细胞活化检定分析直接与一价scIAd/肽分子作比较。使用DO11.10及GD12 T细胞进行检定分析结果分别显示于表11及12。检定分析显示制动scIAd/肽-IgM分子刺激T细胞反应活性比scIAd/肽单元体高5-10倍。对单元体及多元体scIAd/肽分子皆观察得反应的肽特异性。
表11通过scIAd/OVA复合物活化DO11.10 T细胞IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔 scIAd/OVA-IgM scIAd/GD-IgM scIAd/OVA scIAd/GD2501.475 0.193 0.665 0.1801251.610 0.180 1.059 0.17962 1.334 0.157 1.032 0.16431 1.417 0.165 0.646 0.21315 1.178 0.140 0.397 0.1527 0.838 0.148 0.236 0.1633 0.529 0.1401 0.268 0.153表12通过scIAd/GD复合物活化GD12 T细胞IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔 scIAd/OVA-IgM scIAd/GD-IgM scIAd/OVA scIAd/GD250 0.2321.4060.230 0.688125 0.2351.3240.189 0.91362 0.2011.0760.183 0.86331 0.1900.9820.181 0.45015 0.1850.8330.160 0.17470.1700.7990.178 0.15630.1880.62310.1560.404表2、3及5结果明白显示多价形式scIAd/肽复合物刺激T细胞反应比单价形式更为强而有力。这些复合物用于下述筛选方法为较佳，该方法中对MHC/肽复合物的T细胞反应要求TCRMHC肽交互作用的临限值升高。这种使用T细胞表现重组scTCR-CD3ζ融合分子的筛选方法述于如下实施例11-14。多价MHC/肽复合物用于下述筛选方法也较佳，该筛选方法系仰赖检测MHC/肽复合物与膜结合TCR(参考实施例15)或经纯化的TCR(参考实施例16及17)间的交互作用。
实施例6-多价DO11.10单链T细胞接受其复合物的生成A.DO11.10 scTCR/鼠IgG2b融合分子表现载体的构建如前述，利用一价及较佳利用多价MHC抗原复合物及TCR试剂，大为有助于发展检测MHC抗原分子与TCR间的交互作用的筛选方法。先前曾经说明生成一价及多价单链TCR(scTCR)的方法(Weidanz等人，1998免疫学期刊(J.Immunity)方法22159，美国专利申请案第08/813,731及08/943,086号)。本实施例说明使用这些方法形成多价DO11.10 scTCR分子用于筛选用途，例如实施例16及17所述。
DO11.10 scTCR的克隆已经说明于审查中的美国专利申请案第08/813,731号(「包含噬菌体膜衣蛋白及单链T细胞受体的融合蛋白质」)以及第08/943,086号(「包含单链T细胞受体及免疫球蛋白轻链恒定区的融合蛋白质」)。
哺乳类IgG2b表现载体pSUN7述于最近TCR专利申请案(「多重特异性结合分子及其用途」，参考编号48,531-P)。
用于构建DO11.10 scTCR/鼠IgG2b融合分子，pSUN7表现载体使用NruI及EcoRI消化(脱离原先克隆于载体的scFv)。DO11.10 scTCR使用特异性引子KC267(5’NruI)及KC268(3’EcoRI)再度由pSUN23扩大(参考表13)。PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体用于定序。正确DO11.10 scTCR片段通过限剪消化/凝胶纯化分离，然后接合入经NruI/EcoRI消化的pSUN7表现载体，以形成最终DO11.10scTCR/鼠IgG2b表现载体。
表13用于克隆的寡核苷酸KC2675’-GAG GTG TCG CGA GAG CAG GTG GAG CAGCTT CC-3’KC2685’-GTG GAG GAA TTC GTC TGC TCG GCC CCA G-3’KC3035’-GAG GTG GTT AAC GAT CCC AAA CTC TGCTAC-3’KC3045’-GAG GTG ATC GAT AAG TGT ACT TAC GTT TTTAGC GAG GGG GCA GGG C-3’KC3125’-GAG GTG GTT AAC GAT CCC AAA CTC TGC TACTTG CTA GAT GGA ATC CTC-3’B.哺乳类表现DO11.10 scTCR/鼠IgG2b融合分子CHO分子以冷DPBS洗涤准备用于转移感染。约107细胞再度悬浮于DPBS，混合20微克经PvuI-线性化的DO11.10 scTCR/鼠IgG2b DNA。于冰上经5分钟后，细胞使用基因脉冲仪(拜雷公司)电穿孔，仪器设定为传输250伏特、0.25微法拉第脉冲。经施加脉冲的细胞置于冰上5分钟。细胞稀释入10毫升IMDM(含10％ FBS)，于T-25平方厘米烧瓶内于37℃含5％二氧化碳生长隔夜。
转移感染细胞稀释1∶200，次日接种于96孔板至选择性培养基(换言之10％FBS-IMDM含0.75毫克/毫升G-418硫酸盐)。
约二周后，群落通过ELISA试验蛋白质的表现。96孔孔板(努马西索普孔板)涂覆以KJ-1 mAb(这种mAb可识别正确折叠的DO11.10 TCR)于PBS，于4℃隔夜。使用10％FBS-PBS阻断1小时后，加入群落上清液，于室温培养30分钟。洗涤后，加入抗鼠IgG2b-HRP结合多株抗体(卡尔标记(Caltag))经历30分钟时间。ELISA使用TMB基质显色，以及使用0.1N硫酸终止。读取于450纳米的吸光比。
接受试验的群落中唯有10％呈ELISA阳性。三个候选群落选用于扩大以及通过限制性稀释作初步克隆。
约10日后，通过ELISA试验一次纯株，选出蛋白质产量最高的细胞系。ELISA类似前述检定分析，但使用F23.1 mAb(这种mAb检测部分TCR Vβ8链)用于替代KJ-1 mAb。四个候选细胞系经扩大，选出TCR表现程度最高的纯株(#13-1)接受进一步特征化研究。
C.多价DO11.10 scTCR融合分子的生成DO11.10 scTCR/鼠IgG2b融合分子于哺乳类细胞表现，产生TCR的单元体及二聚体，如第9图所示。添加κ链融合分子来互补IgG2b重链融合分子，结果导致生成四聚体分子。为了测试此项假说，首先需确定scTCR/IgG2b融合分子可与scTCR/κ融合分子有效配对。
DO11.10 scTCR/鼠κ融合分子的克隆已经述于审查中的美国专利申请案第08/943,086号。为了验证重链/κ链的配对，遵照奎金公司的超完美转移感染试剂用于一过性转移感染黏着分子的方案，建立一过性转移感染实验。简言之，2.5×105Cos-7细胞播种(每孔)于6孔孔板。次日，2微克DNA(1微克DO11.10 scTCR/κ加1微克DO11.10 scTCR/IgG2b)添加至100微升IMDM培养基。然后加入10微升超完美试剂(奎金公司)及混合。于室温培养10分钟形成DNA/树状聚合物后，600微升含10％FBS的IMDM添加至复合物。COS细胞以DPBS洗涤，复合物吸量至细胞上。于37℃经2小时后，细胞再度经洗涤，将含10％FBS的新鲜IMDM添加至各孔。转移感染于37℃于5％二氧化碳培养3日，随后进行检定分析。
得自一过性转移感染的上清液通过ELISA试验scTCR/IgG2b融合分子与scTCR/κ融合分子的配对。96孔孔板(努马西索普)涂覆以山羊抗-鼠κ多株抗体(南方生技公司)于PBS，于4℃隔夜。使用10％ FBS-PBS阻断1小时后，加入一过性上清液，于室温培育30分钟。洗涤后，加入抗鼠IgG2b-HRP结合多株抗体(卡尔标记)经历30分钟时间。ELISA使用TMB酶基质显色，使用0.1N硫酸终止。吸光比(于450纳米读取)比阴性对照高40倍，明白指示scTCR/κ与scTCR/IgG2b可成功地配对。
下列实施例说明可表现重组T细胞受体的细胞系的生成实施例7-载有重组T细胞受体的鼠T细胞杂交瘤的生成利用可表现适当TCR的制动T细胞系，大为有助于发展出基于细胞的筛选方法，用以检测MHC抗原分子与TCR间的交互作用。进行离体T细胞与胸腺瘤细胞(亦即BW5147)间的融合，而生成鼠T细胞杂交瘤。但该方法不易应用于生成制动人类T细胞系。至于更为概括方法，制动T细胞系系经过转移感染表现重组TCRs于细胞表面生成(参考Engel等人，1992，科学2561318；Hastings等人，1996，免疫学期刊(J.Immunity)1573460；Brawley，J.V.及P.Concannon，1999，免疫学期刊(J.Immunity)1634946)。类似办法述于本例及其次二例。各例中，介于TCR的胞外抗原识别领域与CD3-ζ链的胞内发讯领域间达成融合。转移感染入T细胞时，融合分子使用MHC-肽复合物刺激，显示功能活性。本实施例中，用于转移感染的T细胞系为可于表面表现内生性TCR的杂交瘤。实施例8及9中，使用的T细胞系于表面并未表现功能内生性TCRs。
A.DO11.10 scTCR/CD3ζ融合分子的构建DO11.10 scTCR的克隆述于审查中的美国申请案08/813,731(「包含噬菌体膜衣蛋白及单链T细胞受体的融合蛋白质」)以及08/943,086(「包含T细胞受体及免疫」)。
最近专利申请案(「多重特异性结合分子及其用途」，参考编号48，531-P)中叙述构建基于pGEM T-Easy的「穿梭载体」。该载体系由scTCR扩大为5’AgeI-3’HpaI/BspEI/NruI/ClaI DNA片段克隆入pGEM T-Easy载体组成。然后3’端作为多连接子区，用以添加连接子、scFv、及纯化标记而形成双重特异性分子。
用于构建DO11.10 scTCR/CD3ζ的融合分子，DO11.10 scTCR/连接子/scFv/标记/pGEM T-Easy「穿梭载体」以HpaI及ClaI消化去除多重连接子区，只留下DO11.10 scTCR作为5’Agel-3’HpaI片段于pGEM T-Easy。
CD3ζ链系由cDNA(鼠cDNA系由2B4 T细胞杂交瘤RNA制造；人类CD3ζcDNA为Linda Sherman’s博士实验室捐赠)，扩大时使用鼠特异性引子KC312(5’HpaI)及KC304(3’ClaI)或人特异性引子KC303(5’HpaI)及KC304(3’ClaI)。KC304引子也编码5’中止字码子及剪接位置。PCR产物克隆入pGEM载体(得自普罗麦加公司的原始载体)进行定序。通过限剪消化/凝胶纯化分离正确CD3ζ片段，然后接合于经HpaI/ClaI消化的DO11.10/pGEM载体(前述)而于pGEM T-Easy形成DO11.10scTCR/鼠CD3ζ或DO11.10 scTCR/人类CD3ζ融合构成体，显示于第10图。
哺乳类IgGκ载体pSUN9(述于审查中的美国申请案第08/943,086)选用于表现scTCR/CD3ζ融合分子。表现载体及融合构成体(于pGEM T-Easy的融合构成体)皆使用AgeI及ClaI消化。scTCR/CD3ζDNA片段经分离及接合于经过切割的pSUN9载体而形成最终哺乳类细胞表现载体，亦即DO11.10 scTCR/鼠CD3ζ及DO11.10scTCR/人类CD3ζ。
B.可表现膜结合DO11.10 scTCR/鼠CD3ζ融合分子的2B4细胞的生成2B4 T细胞杂交瘤系由于得自B10.A小鼠的T细胞与BW5147细胞系融合所得结果。2B4细胞当提呈于IEκ时可识别鸽胞色素C(PCC)。
2B4细胞使用冷DPBS洗涤而准备进行转移感染。约107细胞再度悬浮于DPBS，且混合20微克经PvuI-线性化的DO11.10 scTCR/鼠CD3ζDNA。于冰上经5分钟后，细胞使用基因脉冲仪(拜雷公司)电穿孔，仪器设定为传送250伏特960微法拉第脉冲。经过施加脉冲的细胞置于冰上5分钟。细胞稀释于10毫升10％ IMDM，于37℃含5％二氧化碳于T-25平方厘米烧瓶生长隔夜。
24小时后，细胞移入T-75平方厘米烧瓶，加入40毫升选择性培养基(换言之10％FBS-IMDM含1毫克/毫升G418)。3日后，「本体」2B4转移感染株以每孔10、100或1000个细胞接种于96孔孔板的选择性培养基。约二周后，经过接种的转移感染株使用流动细胞计筛选DO11.10的表现。细胞于冰上使用生物素化的F23.1mAb染色30分钟。F23.1 mAb检测得部分TCR Vβ8链；因此系结合至DO11.10 TCR而非结合至2B4 TCR。细胞经温和离心，上清液经抽取，加入链丝菌抗生物素标记的胞色素。于冰上经15分钟后，细胞以1％FBS/DPBS洗二次，再度悬浮。于贝克顿迪更生FACScan仪器获得细胞染色结果。
约90％试验群落为DO11.10 scTCR表现阳性。选出二候选株准备通过有限稀释进行一次克隆。
二周后，一次纯株如先前所述通过流动细胞计量学筛选。选出六个纯株准备进一步作特征化研究，六个纯株各自有CD4及DO11.10 scTCR表现程度。这些纯株用于使用重组株scIAd/OVA复合物进行的T细胞活化研究述于实施例11。
实施例8-载有重组T细胞受体及重组CD4分子的鼠T细胞系的生成A.可表现膜结合QDO11.10 scTCR/CD3ζ融合分子的BW5147细胞的生成BW5147(BW)细胞系为小鼠胸腺瘤，缺TCRα链及β链的表面表现(这种细胞系常用作为T细胞的融合伴侣用来生成T细胞杂交瘤)。
BW细胞以冷DPBS洗涤准备进行转移感染。约107细胞再度悬浮于DPBS，且混合20微克经PvuI-线性化的DO11.10 scTCR/鼠CD3ζDNA。另一根分开试管中，107细胞混合20微克经PvuI-线性化的DO11.10 scTCR/人CD3ζDNA。于冰上经5分钟后，细胞使用基因脉冲仪(拜雷公司)电穿孔，仪器设定于一脉冲，250伏特，960微法拉第。经施加脉冲的细胞置于冰上5分钟。细胞稀释于10毫升10％ IMDM，于T-25平方厘米烧瓶于37℃含5％二氧化碳生长隔夜。
24小时后，细胞移入T-75平方厘米烧瓶内，各别加入40毫升选择性培养基(换言之10％FBS-IMDM含1毫克/毫升G418)。3日后，「本体」BW转移感染株以每孔10、100或1000个细胞接种于96孔孔板的选择性培养基。也对各别转移感染株维持「本体」转移感染培养。
约二周后，使用流动细胞计量术筛选「本体」转移感染培养的阳性转移感染株。细胞于冰上使用FITC结合的H57-597 mAb染色30分钟。H57-597 mAb检测得TCR Cβ链的线性抗原决定部位。以1％FBS/DPBS洗二次后，细胞再度悬浮于相同缓冲液。于贝克顿迪更生FACScan仪器获得细胞染色结果。「本体」转移感染培养皆显示宽广范围的TCR表现，如第11图所示。
「本体」转移感染培养也使用制动的H57-597 mAb于活化检定分析进行试验。96孔孔板涂覆以30纳克/孔mAb隔夜。次日105细胞加至各孔，检定分析于37℃于5％二氧化碳共同培育隔夜。检定分析的上清液系如前述于鼠IL-2夹层ELISA试验(WO99/21572，USSN09/204,979)。「本体」转移感染培养基于本检定分析特别刺激而产生IL-2。
生长于1000细胞/孔上的转移感染株，如实施例7所述通过流动细胞计筛选DO11.10 scTCR/鼠CD3ζ分子的表现。1/3至2/3接受试验的候选细胞对TCR表现呈阳性反应。有最高度表现程度的DO11.10 scTCR/鼠CD3ζ转移感染株(BW/D-Z#8)经一次克隆、扩大然后进一步决定特征。
得自BW/D-Z#8之一次纯株通过流动细胞计量术筛选。选出一纯株(#8-39)为用于另外特征化研究的最佳细胞系。
BW/D-Z细胞系与scTCR基因由其中克隆的原始T细胞杂交瘤DO11.10比较。当二细胞系并排染色时，显然经过转移感染BW细胞的TCR表现程度系高于天然T细胞杂交瘤，如H57-597 mAb的揭示。二细胞系经刺激而于载荷OVA肽的APCs(A20细胞)存在下制造IL-2。但当经纯化的单链IAd/OVA制动于孔板时，DO11.10 T细胞杂交瘤经活化，但BW/D-Z细胞系未能产生可检测浓度的IL-2。相信涉及稳定MHC抗原/TCR交互作用的辅助分子可能是活化检定分析中漏掉的组成分。CD4分子是最合逻辑的选择，原因在于CD4分子直接涉及TCR结合至MHC分子，而BW/D-Z细胞未表现CD4于其表面。
B.膜结合CD4受体表现载体的构建用于本构成体的CD4受体原先系通过PCR扩大由小鼠T细胞杂交瘤GD12产生的cDNA分离(Grammer，S.F.等人，免疫学期刊(J.Immunity)145249(1990))。
构成两种不同CD4受体基因于全长基因含有胞外穿膜(TM)及胞质(CM)领域，以及缺胞质领域的截头受体。后者构成体用来说明CD4胞外受体领域对TCRMHC/肽交互作用的贡献以及经过胞质领域扩大这种交互作用。
两种CD4受体基因皆系通过PCR产生，且克隆于表现载体pCDNA3.1Hypro-。
为了生成全长CD4基因，设计两种寡核苷酸引子(参考表14)来扩大1550bp含CD4受体基因全部开放读取架构的PCR片段以及169bp上游序列。寡核苷酸CDF1及CDF3用于PCR，扩大全长CD4基因；而CDF1及CDF4用于扩大CD4δCM基因。DNA片段系使用旁出HindIII及XhoI限制性位点构成。因XhoI位置系位于CD4起点蛋胺酸上游95bp，为了克隆全长基因，生成1480bp XhoI片段且接合至经XhoI消化的pCDNA3.1 Hygro+载体(克隆科技公司)。结果所得质粒使用BglII线性化，且用于转移感染BW/D-Z细胞(如实施例7所述)。
制定类似策略来产生截头CD4基因。寡核苷酸引子CDF1及CDF4用来放大1497bp PCR片段其含有CD4受体基因的开放读取架构，缺胞质领域但含有169bp上游序列。此片段旁出HindIII及XhoI限制性位点。XhoI位在起点蛋胺酸上游95bp。1427bp XhoI片段接合至经XhoI消化的pCDNA3.1 Hygro+载体(克隆科技公司)，结果所得质粒使用BglII线性化，且用于转移感染BW/D-Z细胞。
表14用于鼠CD4及CD4δCM克隆的寡核苷酸引子命名序列CDF15’-GGG GAA GCT TTT TTC ATT TAC GAA CATCTG TGA AGG C-3’CDF35’-GGG GTC GAG TTA TCA GAT GAG ATT ATGGCT CTT CTG C-3’CDF45’-GGG GCT CGA GTT ATC AGC GCT GTT GGTGCC GGC ACC TGA CAC AGC AGA GGA TGCAGA G-3’C.可表现膜结合CD4受体的BWD-Z细胞的生成以全长或截头CD4基因转移感染的BW/D-Z细胞生长于IMDM培养基，培养基含有10％胎牛血清(FBS)及1毫克/毫升吸湿霉素(Hygromycin)。抗药性群落经过有限吸湿克隆，通过FACS分析检验CD4受体的表现。约105细胞混合经FITC标记的大鼠抗鼠CD4抗体(法明金公司)于50微升含1％血清的PBS。重组CD4受体的细胞表面表现系如第12A图所示通过流动细胞计量术分析。
阳性纯株也通过FACS分析检验DO11.10 scTCR的膜结合表现。约105细胞混合抗-TCRβ-链生物素化抗体H57。细胞经洗涤及混合链丝菌抗生物素-FITC，如第12B图所示通过流动细胞计量术分析。检验的双重阳性细胞系中，选出BWDZCD4+(2E11)及BWDZδCM(D6)，使用同源OVA肽提呈细胞(APCs)进行进一步TCRMHC/肽交互作用研究。相同T细胞系用于使用实施例12所述经制动的重组scIAd/OVA分子进行刺激研究。
D.通过经肽载荷的APCs刺激BWDZCD4+T细胞为了验证BWDZCD4+细胞系以同源APCs刺激，A20细胞混合OVA细胞。制作APCs的二倍连续稀释液且混合105T细胞。细胞混合物于37℃于含10％FBS的200微升IMDM培养基培养隔夜。培养基中IL-2的产量系通过前述IL-2特异性ELISA测定。IL-2产量指示T细胞刺激程度，如第13图所示。DO11.10细胞用作为阳性对照，而BW细胞用作为阴性对照。可表现CD4的二细胞系的IL-2产量与2B4/DZ的IL-2产量比较。添加全长CD4辅助分子，可将BW/DZ细胞的IL-2产量回复至DO11.10细胞的IL-2产量的75％-80％。相较于此，缺胞质领域的截头CD4分子只能回复10％。如所预期，CD4胞质领域经过其募集lck而于扩大TCRMHC/肽交互作用上扮演要角。
实施例9-可表现重组人类T细胞受体的人类T细胞系的生成A.含有得自人类MBP-再度活化细胞系E11的TCR&及β链的cDNA纯株的载体的构建人类T细胞系E11识别人类MHC II蛋白质HLA-DR2(DRB1*1501)的髓磷脂碱性蛋白质(MBP 83-102，YDENPVVHFFKNIVTPRTPP)，且与得自该蛋白质的肽反应。人类T细胞系E11原先系由多发性硬化症病人分离而得，由科立萨(Corixa)公司以冻结细胞丸粒供应。
全RNA系使用得自奎金公司的RNeasy试剂盒由1×108细胞制备。于RLT(溶解)缓冲液内稀释后，制剂再分成多份等于1×107细胞进行进一步处理。终RNA浓度系通过分光光谱术测定。第一股cDNA系使用5’RACE cDNA合成引子及得自克隆科技公司(加州盟洛公园市)的SMART II oligo如其使用者手册(PT3269-1，1999年3月)的摘述制备。使用的寡核苷酸列举于表15。第一股(RACE)的PCR扩大系根据指示进行，但有如下例外反应容积加倍成100微升，以及使用ExTaq酶及缓冲液(潘维拉(Panvera)公司)。反应使用的基因特异性引子系于α链及β链的恒定区引发，可接近可变区(「N端」)或位于或接近末端(「C端」)。RACE反应对四种组合皆获得具有预期大小的产物，然后产物克隆入pGEM T-Easy(普罗麦加公司，威斯康辛州麦迪逊)进行序列分析。12纯株β链候选者分析获得两种可变区基因序列；12纯株中的11株为TRVB12-4，12纯株中的1株为TRVB14(IGMT命名，参考ImMunoGeneTics数据库http//imgt.cnusc.fr8104)。14纯株α链分析获得约略相等频率的二序列；14纯株中的5株为TRAV9s1，14纯株中的7株为TRAV22s1以及其余2株为TRAV1s3及TRAV4s1(IGMT命名)。
表15用于克隆得自E11细胞系的TCRα及β链的寡核苷酸引子命名序列SMART II5’-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTACGC GGG-3’第一股cDNA(克隆科技公司)5’-RACE5’(T)25N-1N-3’(N＝A，C，G或T；N-1＝A，G或T)第一股cDNA(克隆科技公司)通用引子长(0.2μM)混合物 5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATG GGC AAG CAGTGG TAA CAA CGC AGA GT-3’短(0.1μM)5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATG GGC-3’RACE5’引子(克隆科技公司)VW510 5’-ATC CTT TCT CTT GAC CAT GGC CATC-3’RACE3’，β链，C端VW511 5’-CAC AGC GAC CTC GGG TGG GAA CAC-3’RACE3’，β链，N端VW512 5’-GCT GGA CCA CAG CCG CAG CGT CAT G-3’RACE3’，α链，C端VW513 5’-CAG CTG GTA CAC GGC AGG GTC AGG-3’RACE3’，α链，N端B.含有得自人类MBP反应性细胞系E11的TCRα及β链的cDNA纯株呈与人类CD3ζ的的哺乳类表现载体的构建以及哺乳类细胞的转移感染构建嵌合体分子，其含有得自E11细胞系的TCRα或β链基因融合至人类CD3ζ的跨膜区域及胞质领域。类似后文对人类构成体所述，Engel、Ottenhoff及Klausner(科学2561318-1321，1992)证实鼠构成体当于大鼠嗜碱性白血病细胞系表现时，产生的细胞可通过特定MHC抗原分子活化。
E11纯株含有β链TRVB12-4可变区以及α链TRVA22s1及9s1，其对应恒定区系作为使用引子扩大的样板，以引进起始蛋胺酸5’的限剪核酸内切酶位置且位于穿膜区前方的恒定领域末端。用于扩大的α链纯株为pTVW443-1及-7(分别为α9s1及22s1)，用于扩大的寡核苷酸引子列举于表16。简言之，5’引子含有限制性位点SalI及KpnI。3’引子含有HpaI限制性位点，其允许于消化及接合时与人类CD3ζ片段做架构内融合(换言之于实施例7所述的DO11.10 scTCR/人CD3ζpGEMT-Easy载体)。用于扩大的β链纯株为pTVW441-2(β12-4)。此构成体的5’引子含有限制性位点SalI及HindIII，3’引子含有HpaI位置用于架构内融合至人CD3ζ。使用所述寡核苷酸通过PCR扩大，生成适当片段，其随后克隆入pGEM T-Easy来制造质粒pTVW450-1、pTVW451-1及pTVW449-1(分别含有编码α9s1、α22s1及β12-4片段)。这些质粒使用SalI及HpaI消化获得克隆入DO11.10 scTCR/人CD3ζpGEM T-Easy载体需要的片段，该载体系使用相同酶切割，结果所得质粒pTVW455-1、pTVW454-1及pTVW453-1(分别编码α9s1、α22s1及β12-4)含有架构内与人CD3ζ穿膜融合的TCRα或β链的胞外领域及胞质领域。然后融合片段转移入得自因维左金(加州卡斯贝得)的载体用于哺乳类细胞表现，pcDNA3.1(-)(G418选择)用于β链、或pcDNA3.1(+)/hygro(吸湿霉素抗生素抗药性)用于α链。其它抗药性标记允许选择经过转移感染的哺乳类细胞是否存在两种质粒。α9s1/hCD3ζ片段克隆入pcDNA3.1(+)/hygro成为KpnI至NotI片段。α22s1/hCD3ζ片段克隆入pcDNA3.1(+)/hygro作为含有钝端(使用限剪酶SalI切割以及使用T4聚合酶填补制成)以及NotI末端的片段。对应pcDNA3.1(+)/hygro载体的制法系使用限剪酶HindIII切割，使用T4聚合酶填补，然后使用NotI切割。β12-4/hCD3ζ片段克隆入pcDNA3.1(+)作为HindIII至NotI片段。由这种克隆步骤所得的载体分别命名为pTVW456-1、pTVW459-1及pTVW457-1且分别含有α9s1/hCD3ζ、α22s1/hCD3ζ及β12-4/hCD3ζ。
表16用于克隆TCRα及β链呈CD3ζ融合分子使用的寡核苷酸引子命名 序列VW5355’-TAT GGT CGA CAA GCT TCA CAG AGG GCCTGG TCT GG-3’(β12-4的5’引子，插入子HindII及SalI位在先导子ATG前方47核苷酸)VW5375’-TAT GGT CGA CGG TAC CCC AGA AAA GACCTC CAG AAA ATA GC-3’(α9s1的5’引子，插入子SalI及KpnI位置位在先导子ATG前方49核苷酸)VW5365’-GGT GGT TAA CGT CTG CTC TAC CCC AGGCCT C-3’(β恒定区的3’引子，插入子HpaI位置位在恒定区的第3个半胱胺酸正前方)VW5395’-GGT GGT TAA CGG AAC TTT CTG GGC TGGGGA AGA AGG-3’(α恒定区的3’引子，插入子HpaI位置位在恒定区的第3个半胱胺酸正前方)VW5405’-TAT GGT CGA CGG TAC CCT TCA TGT TAAGGA TCA AGA CCA TTA TTT GG-3’(α22s1的5’引子，插入子SalI及KpnI位置位在先导子ATG前方45核苷酸)。
选用于使用TCR-hCD3ζ融合分子转移感染的人T细胞系J.RT3(ATCC编号TIB-153)为朱卡特淋巴母细胞系(未表现TCRβ链)的衍生物。这些细胞单独使用质粒pTVW456-1、pTVW459-1及pTVW457-1或呈α+β链对(换言之pTVW456-1+pTVW457-1或pTVW459-1+pTVW457-1)通过电穿孔转移感染。转移感染株的选择系使用适当抗生素亦即G418或吸湿霉素或二者达成。双重选择(使用两种抗生素)分成二阶段进行。细胞经转移感染，让其于不含抗生素的培养基内生长1-2日。然后转移感染株的生长使用含G418的培养基选择。7日后，吸湿霉素添加至生长培养基。TCR融合分子的表现系通过FACS分析使用抗体染色的细胞评比，该抗体可检测T细胞受体复合物的人类α/β链的单形态定子(纯株BMA031，贝克曼库特公司，佛罗里达州迈阿密)、或检测复合物的特异性β链可变区(纯株56C5，贝克曼库特公司)。这些细胞检定分析其通过经过DR2限剪抗原提呈细胞[得自约翰霍普金司实验室(马里兰州巴尔地摩)的DO208915，其已经使用人类MBP肽含氨基酸残基83-102(氨基酸序列YDENPVVHFFKNIVTPRTPP)加脉冲]检定分析其活化，验证α链与β链组合可获得功能性TCR。重组T细胞用于筛选检定分析的用途述于实施例13。
下列实施例涉及本发明的使用MHC/肽复合物组成的MHC抗原的多种筛选方法。
实施例10-使用基于细胞的T细胞活化检定分析识别可抑制TCRMHC/肽交互作用的化合物发展出基于T细胞的筛选检定分析来检测TCRMHC/肽交互作用抑制剂。通常T细胞当接触表面上载有特异性MHC/肽复合物的抗原提呈分子(APCs)时将变成活化。例如于与IAd阳性A20 APCs(以OVA肽加脉冲)共同培养后，DO11.10 T细胞变活化而制造IL-2。虽然多种不同细胞表面受体间的交互作用可促成T细胞反应，但DO11.10 TCR与OVA/IAd复合物间的特异性交互作用为引发反应所必需。为了分开单纯由于TCR与MHC/肽复合物间交互作用引发的反应、与其它表面受体贡献的反应，发展一种检定分析方法用来使用经纯化的重组单链MHC/肽复合物刺激T细胞反应。这种方法可用于监控如前述，T细胞应答于不同MHC/肽复合物的能力(USSN09/204,979)。这种方法特别可用于检测可抑制或刺激T细胞对MHC/肽复合物的反应能力的化合物。
其中特别令人感兴趣者系检测小分子量化合物(例如有机化合物、肽及核酸)其抑制或拮抗T细胞对MHC/肽复合物的反应。特别检测小分子量化合物，其可拮抗TCR与MHC/肽复合物间的交互作用令人极感兴趣。这种化合物可用于发展免疫病症治疗用的免疫抑制用药的候选药物。刺激T细胞对MHC/肽复合物的反应能力的化合物则可用于发展疫苗策略。
为了有助于分析大量化合物，发展一种「双重」检定分析模式，其中T细胞的刺激与T细胞反应的测量可于微滴度孔板的单孔内进行，如第5B图所示。本检定分析中，抗细胞因子抗体以及刺激作用sc-MHC/肽复合物制动于孔。MHC/肽限剪T细胞连同可溶性试验化合物或化合物稀释剂一起添加至孔。活化后T细胞产生的细胞因子通过抗细胞因子抗体捕捉。于一段培养期后，取出T细胞及化合物，孔经洗涤，加入二次抗细胞因子mAb，以允许检测T细胞制造的细胞因子产量。可抑制T细胞被制动Sc-MHC/肽复合物刺激的化合物，结果导致细胞因子产量少于接纳化合物稀释剂的孔的细胞因子产量。
例如50纳克经纯化的scIAd/OVA蛋白质以及100纳克大鼠抗小鼠IL-2mAb(法明金组件编号18161D)同时涂覆于96孔微滴度孔板(努马西索普公司)孔的50微升PBS(赛尔葛罗公司，型号21-031-cv)。24小时后，移出涂覆溶液，各孔接纳100微升培养基(IMDM含10％FBS)含2.5％二甲亚(DMSO，西革玛公司，组件编号2650)或100微升培养基含试验化合物于2.5％ DMSO。然后加入DO11.10 T细胞(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，细胞经移出，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(法明金公司，组件编号18172D)(100纳克于100微升PBS含10％FBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶(西革玛组件编号A3151)于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤及加入100微升TMB酶基质(BioFX实验室，目录编号TMBW-0100-01)。酶基质反应使用1M硫酸中止，于450纳米读取TMB发色基团产物的吸光比。本检定分析中，吸光比读数系对应细胞的IL-2产量。
经过滴定检定分析的各个组成分，获得信号对噪声比大于5。得自化学文库的二千种小分子于前述检定分析中试验其对IL-2制造的抑制作用。各个孔板中，操作含化合物稀释剂(DMSO)的多个孔来确定经scIAd/OVA刺激的DO11.10 T细胞的IL-2产量。任何可显著降低IL-2产量，换言之本检定分析中，显示IL-2吸光比读数低于稀释剂孔吸光比读数3个标准差以上的化合物进一步决定其特征。
例如于检定分析孔板5-2，DO11.10 T细胞刺激系于八孔检定分析，如前述使用DMSO作为对照化合物稀释剂。八孔的平均IL-2吸光比读数为2.198，标准差0.248。本微滴度孔板上共40种试验化合物重复二次进行分析。两种化合物(5E11及5F6)显示比对照(平均-3SD＝1.454)显著更低的IL-2吸光比读数(分别为1.256及0.136)，指示这些化合物可抑制经scIAd/OVA刺激的DO11.10 T细胞的IL-2产量。容纳其余38种化合物各孔的平均IL-2吸光比读数不低于1.454，指示抑制反应范围。2000种试验化合物中，于本检定分析，发现46种重复抑制经scIAd/OVA刺激的DO11.10 T细胞的IL-2产量。
为了测定抑制是否特别起因于scIAd/OVADO11.10 TCR交互作用的干扰而非起因于其它非特异性抑制来源，评比抑制性化合物对通过抗CD3 mAb刺激T细胞的效应。抗CD3抗体可结合至TCR/CD3复合物的与MHC/肽复合物识别位置的不同位置。这种抗体当制动于孔时可刺激DO11.10 T细胞制造IL-2。用于本检定分析，96孔微滴度孔板的各孔同时涂覆以25纳克抗CD3抗体(法明金组件编号01511D)及100纳克大鼠抗小鼠IL-2 mAb于50微升PBS。24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳100微升含2.5％二甲亚 的培养基(IMDM含10％FBS)、或100微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入DO11.10 T细胞(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，移开细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(100纳克于100微升PBS含10％的FBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤，加入100微升TMB酶基质。酶基质反应使用1M硫酸中止，于450纳米读取TMB产物的吸光比。代表性检定分析结果显示于第14图。发现30种可抑制scIAd/OVA媒介刺激作用的化合物于抗CD3检定分析中对IL-2产量的抑制不显著。这些结果指示虽然MHC/肽相依性刺激作用受到抑制，但这些化合物不影响T细胞应答于透过TCR/CD3复合物刺激的能力。因此这些化合物显然无法透过抑制细胞间机转导致IL-2的制造或释放。
然后30种抑制性化合物于前述scIAd/OVA及抗CD3 Ab检定分析滴定，且显示对scIAd/OVA媒介的刺激具有剂量相依性抑制作用。滴定曲线范例显示于第15A及15B图，30种抑制性化合物的代表例显示于第16图。
为了测定抑制是否与scIAd/OVA复合物的OVA肽间的交互作用具有特异性，评比抑制性化合物对T细胞通过scIAd/GD刺激的影响。先前已经显示经制动的scIAd/GD可刺激GD12 T细胞杂交瘤制造IL-2。为了试验抑制性化合物是否也对GD12细胞有影响，100纳克经纯化的scIAd/GD蛋白质及100纳克大鼠抗小鼠IL-2mAb同时涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS。经24小时后，涂覆溶液经移出，各孔接纳100微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或100微升含试验化合物于2.5％ DMSO的培养基。然后加入GD12 T细胞(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，取出细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(100纳克于100微升含10％的FBS的PBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤，加入100微升TMB酶基质。使用1M硫酸中止酶基质反应，读取于450纳米的吸光比。全部可抑制由scIAd/OVA媒介的DO11.10刺激作用的化合物，也可抑制经scIAd/GD刺激的GD12细胞的IL-2产量，指示该等化合物并非以复合物特异性方式抑制刺激。
抑制性化合物的特异性进一步使用不同的MHC/肽T细胞组合检验。如实施例1所述，IEκ/PCC构建成单链MHC第II类分子，且发现可活化2B4 T细胞分泌IL-2。如前述使用2B4细胞及scIEκ/PCC蛋白质发展出双版本检定分析。这种检定分析中，200纳克经纯化的scIEκ/PCC蛋白质以及100纳克大鼠抗小鼠IL-2 mAb同时涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS。经24小时后，涂覆溶液经移出，各孔接纳100微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或100微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入2B4 T细胞(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，取出细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(100纳克于100微升含10％的FBS的PBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤，加入100微升TMB酶基质。使用1M硫酸中止酶基质反应，读取于450纳米的吸光比。22种小分子，其使用经制动的scIAd/OVA比抗CD3 Ab可显示IL-2分泌的较大抑制作用，此22种小分子于scIEκ/PCC2B4检定分析试验。其中一种小分子(427-F8)通过IL-2分泌测定，显示对scIAd/OVADO11.10 T细胞交互作用比对scIEκ/PCC2B4 T细胞交互作用有更高抑制效果。典型滴定曲线显示多种剂量427-F8于两种检定分析的抑制百分比，滴定曲线显示于表17。三个独立检定分析观察得类似结果。结果提示试验化合物用于抑制TCRMHC/肽交互作用显现某种程度的特异性。
表17化合物427-F8于抑制经MHC/肽刺激的T细胞分泌IL-2的选择性活性
IL-2分泌的抑制百分比检定分析版本scIAd/OVA scIEκ/PCC427-F8浓度(μM) DO11.10 T细胞2B4 T细胞16.683 865.5 85 861.8 85 830.6 57 110.2 040.0603进一步于刺激检定分析检验抑制性化合物的活性，其中表面携带有适当MHC的抗原提呈细胞(APC)载荷外生性肽，用来于试管试验刺激T细胞反应。本检定分析中，100纳克抗-IL-2抗体涂覆于96孔微滴度孔板之一孔。经24小时后，去除涂覆溶液，各孔容纳1×105A20细胞(携带IAd分子的APCs)于100微升培养基(IMDM含10％FBS)、5微克OVA肽于10微升培养基、1×105DO11.10 T细胞于100微升培养基以及5微升试验化合物于PBS。于37℃于10％二氧化碳孵育器内培养3小时后，移出细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2mAb(法明金组件编号18172D)(100纳克于100微升含10％FBS的PBS)添加至各孔。于37℃经1小时后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶(西革玛组件编号A3151)于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤及加入100微升ABTS酶基质(BioFX实验室)。显色酶基质反应，于450纳米读取吸光比。吸光比读值系与A20细胞的经OVA肽载荷IAd分子与DO11.10 TCR交互作用以及刺激IL-2产量的能力有交互关联。化合物拮抗MHC/肽复合物与TCR间的交互作用的能力系以于405纳米读取的吸光比数量减低测定。候选抑制性化合物进行研究所得典型结果显示于表18，指示化合物可阻断载荷有肽的APC刺激T细胞反应的能力。
表18试验化合物对DO11.10 T细胞通过经OVA肽载荷的A20细胞刺激的抑制效应IL-2 ELISA值211-C3211-C9 12G9 211B9μM A-405μM A-405μM A-405μM A-40502.0240 2.0240 1.90601.9202.3 2.1281 2.1011.5 2.0471.8 1.60871.9843 1.9475 1.9405.5 1.15420 1.437101.28914 1.79516.7 1.12762 0.262310.23542 1.63050 0.944
要言之，发展出一种筛选可干扰TCRMHC抗原交互作用的物质的实用方法。
实施例11-使用经基因工程处理可表现表面DO11.10 scTCR-CD3ζ融合蛋白质的T细胞杂交瘤发展筛选检定分析目的是为了进一步发展一种基于细胞蛋白质的方法用以识别可干扰TCR与MHC抗原分子间的交互作用的激动剂及拮抗剂。如本例所述，使用可表现重组单链T细胞受体的制动T细胞系发展检定分析版本。这种办法的优势为可产生足量细胞来进行大量化合物的筛选。如实施例7所述，使用2B4鼠T细胞杂交瘤来形成新颖细胞系，其可于表面表现DO11.10 TCR呈三领域scTCR-CD3ζ融合蛋白质。2B4 T细胞与使用OVA肽加脉冲的A20细胞共同培养后，对以DO11.10 scTCR-CD3ζ编码DNA转移感染的2B4T细胞观察特异性刺激，如第17A图所示。此外，该细胞暴露于以GD肽加脉冲的A20细胞时未经刺激。另一项实验，使用可表现表面结合scIAd/OVA的NSO骨髓瘤细胞(NDO细胞)，观察经DO11.10 scTCR转移感染的T杂交瘤细胞的刺激，如第18图所示。于NDO细胞存在下培养的野生型2B4 T细胞(表面表现2B4 TCR)为非反应性。资料证实宣称scTCR-CD3ζ融合分子可用于重构带有新颖抗原特异性的T细胞。
如前文讨论，筛选化学文库的理想办法系发展出一种细胞系，该细胞系可通过经纯化的重组MHC/肽复合物刺激。为了试验使用经纯化的MHC/肽分子刺激经过基因工程处理可表现表面scTCR-CD3ζ融合蛋白质的T细胞系的构想，各孔涂覆以1000或160纳克scIAd/OVA-IgM融合蛋白质，然后加入适当T细胞。细胞的刺激作用系经过检定分析分泌于培养上清液的IL-2蛋白质测定。IL-2的检测系使用购自法明金公司之一对抗鼠IL-2抗体测定，如前述用于夹层ELISA方法(Rhode等人，1996，免疫学期刊(J.Immunity)1574885)。对照孔涂覆以相等浓度蛋白质但使用重组scIAd/GD-IgM蛋白质。1052B4细胞或2B4转移感染株于各孔内于37℃于5％二氧化碳下培养14小时后，收集100微升上清液检定分析IL-2。第19图显示一次实验结果。如所预期，涂覆以scIAd/GD-IgM的对照孔无法刺激DO11.10 scTCR 2B4转移感染株或野生型2B4 T细胞。更重要地，当存在有制动scIAd/OVA-IgM蛋白质时唯有转移感染株产生IL-2，相反地，该蛋白质未能刺激野生型2B4 T细胞。结果显示表面表现重组DO11.10 scTCR-CD3ζ的T细胞可于制动IAd/OVA复合物存在下被有效刺激，但无法通过scIAd/GD-IgM复合物有效刺激。
为了进一步发展使用转移感染细胞系的筛选检定分析，使用不等浓度制动scIAd分子建立双重版本检定分析。检定分析条件同实施例10所述。本检定分析结果显示于表19。结果指出scIAd/OVA及scIAd/OVA-IgM可刺激DO11.10 scTCR转移感染株。如同先前的观察，制动scIAd/OVA-IgM分子刺激反应的能力比制动scIAd/OVA分子更强。也观察到转移感染株的肽特异性。使用MHC抗原复合物的IgM版本，显示使用多价版本如何提高检定分析敏感度。
表19
通过scIAd/OVA复合物活化DO11.10 scTCR 2B4转移感染株IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔 scIAd/OVA-IgM scIAd/GD-IgM scIAd/OVA scIAd/GD2502.274 0.224 1.063 0.2271252.325 0.233 1.059 0.17962 1.822 0.224 1.032 0.16431 1.324 0.226 0.646 0.21315 0.273 0.199 0.397 0.1527 0.264 0.213 0.236 0.1633 0.234 0.1901 0.214 0.196基于前述结果，使用经过TCR转移感染的T细胞系以及制动MHC抗原分子可发展出一种筛选方法。例如经纯化的scIAd/OVA-IgM蛋白质及大鼠抗小鼠IL-2 mAb同时涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS。经24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳100微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或100微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入DO11.10 scTCR 2B4转移感染株(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，取出细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(100纳克于100微升含10％FBS的PBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤，加入100微升TMB酶基质。酶基质反应使用1M硫酸中止，读取反应产物于450纳米的吸光比。化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以T细胞转移感染株分泌于培养基的细胞因子数量的减低测定。也将进行检定分析，其中使用抗TCR Ab替代MHC/肽复合物来刺激T细胞，以决定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽复合物交互作用发挥作用，或系透过不同的机转发挥作用。可抑制T细胞通过MHC/肽复合物刺激但不会抑制T细胞通过抗TCR抗体刺激的化合物将作为领先化合物研究。
实施例12-使用经基因工程处理可表现表面DO11.10 scTCR-CD3ζ融合蛋白质及重组CD4受体的T细胞杂交瘤的筛选方法的发展次一目的系进一步精致基于细胞的筛选方法。重组T细胞经基因工程处理而可表现单链TCR-CD3ζ融合分子及CD4受体于细胞表面。这些操作让细胞可被MHC/肽复合物刺激。这种办法的优势为细胞经设计并调整为最理想化以适合特定检定分析参数。例如可表现高度重组scTCR及/或CD4受体的细胞显示对于被MHC/肽复合物刺激较为敏感。如实施例8所述，生成稳定BWDZ-CD4+T细胞转移感染株，其于细胞表面表现DO11.10 scTCR-CD3ζ融合蛋白质以及重组CD4受体。为了试验使用经纯化的MHC/肽分子刺激BWDZ-CD4+T细胞系的构想，各孔涂覆以不等浓度的scIAd/OVA-IgM融合蛋白质。各孔也如实施例10所述涂覆以大鼠抗小鼠IL-2抗体。然后加入BWDZCD4+T细胞，T细胞刺激系如实施例10所述检定分析分泌入培养上清液的IL-2做测定。对照孔系涂覆以相等浓度蛋白质，但使用重组scIAd/GD-IgM蛋白质。本检定分析结果显示于表20。结果指出可表现表面DO11.10scTCR及CD4受体的重组BWDZCD4+T细胞可通过制动scIAd/OVA-IgM的特异性刺激，且可使用重组T细胞系及制动MHC/肽分子发展出一种筛选方法。
表20通过scIAd/OVA-IgM复合物活化BWDZCD4+转移感染株IL-2 ELISA值(A405)纳克复合物/孔scIAd/OVA-IgM scIAd/GD-IgM1000 1.2770.375200 0.3400.30940 0.3050.282例如经纯化的scIAd/OVA-IgM蛋白质及大鼠抗小鼠IL-2 mAb同时涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS。经24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳100微升含2.5％二甲亚 的培养基(IMDM含10％FBS)、或100微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入BWDZCD4+转移感染株(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，取出细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(100纳克于100微升含10％FBS的PBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤，加入100微升TMB酶基质。酶基质反应使用1M硫酸中止，读取反应产物于450纳米的吸光比。化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以T细胞转移感染株分泌于培养基的细胞因子数量的减低测定。也将进行检定分析，其中使用抗TCR Ab替代MHC/肽复合物来刺激T细胞，以决定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽复合物交互作用发挥作用，或系透过不同的机转发挥作用。可抑制T细胞通过MHC/肽复合物刺激但不会抑制T细胞通过抗TCR抗体刺激的化合物将作为领先化合物研究。
实施例13-发展基于细胞的筛选检定分析以检测自体免疫TCRMHC/肽交互作用抑制剂发明人的目的系进一步发展一种基于细胞蛋白质的办法，用来识别可干扰TCR与人类自体免疫病相关MHC抗原分子间的交互作用的拮抗剂。如本实施例所述，设计一种检定分析版本，使用可表现重组T细胞受体的永生T细胞系，该T细胞系系衍生自由多发性硬化症病人分离的T细胞。人类T细胞系或纯株极为难以大量培养生长，经长时间生长后经常丧失对其抗原的特异性。重组T细胞办法的优点为可生成足量细胞进行大量试验化合物的筛选。如实施例9所述，TCRα及β链基因系由经MBP限剪人类MS T细胞系E11克隆获得。生成表现载体，该表现载体可表现TCRα或β链于架构内与人类CD3ζ穿膜融合的胞外领域以及胞质领域，且将该表现载体转移感染入永生T细胞。被转移感染的细胞用于使用经MBP肽载荷的DR2+APCs进行刺激检定分析。然后E11 TCR经转移感染的细胞系用来发展使用制动scDR2/MBP蛋白质的筛选检定分析。
例如经纯化的scDR2/MBP-IgG蛋白质(参考实施例4)及抗人IL-2 mAb同时涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS。由重组T细胞产生线性反应的scDR2/MBP-IgG需要量将经实验测定。经24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳100微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或100微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入E11 TCR T细胞转移感染株(1×105细胞于100微升培养基)。于37℃于10％二氧化碳培养8小时后，取出细胞，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。生物素化抗IL-2 mAb(100纳克于100微升含10％FBS的PBS)添加至各孔。于4℃培养隔夜后，各孔经洗涤，250纳克抗生物素过氧化酶于100微升10％FBS-PBS添加至各孔。于37℃经30分钟后，各孔经洗涤，加入100微升TMB酶基质。酶基质反应使用1M硫酸中止，读取反应产物于450纳米的吸光比。化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以T细胞转移感染株分泌于培养基的细胞因子数量的减低测定。也将进行检定分析，其中使用抗TCR Ab替代MHC/肽复合物来刺激T细胞，以决定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽复合物交互作用发挥作用，或系透过不同的机转发挥作用。可抑制T细胞通过MHC/肽复合物刺激但不会抑制T细胞通过抗TCR抗体刺激的化合物将作为领先化合物研究。
实施例14-基于模式细胞筛选方法的发展用以识别可调节TCRMHC抗原交互作用的化合物本实施例说明一种基于模式细胞的筛选系统，该系统用以筛选化学文库找出可特异性调节TCR与MHC抗原分子间的交互作用的激动剂及拮抗剂。本模式系基于永生T细胞系(例如T细胞杂交瘤)来表现两种或多种不同抗原特异性T细胞受体于其表面。例如T细胞可表现内生性TCR，也表现具有独特抗原特异性的重组单链TCR。筛选检定分析的目的系识别化合物其对多种TCR之一比另一TCR显示促效或拮抗TCRMHC/肽交互作用的差异效果。这些细胞可用于孔板检定分析，孔板的各孔内预先涂覆前述经制动的MHC/肽分子(例如单链单体、IgG或IgM)。MHC/肽可刺激T细胞分泌IL-2。筛选细胞的扩大或抑制T细胞分泌IL-2的能力。由于TCR与MHC/肽复合物间的交互作用通常微弱，且因IL-2制造/分泌过程有多个步骤，将通过IL-2产量减低证据来预测识别干扰(特异性或非特异性干扰)T细胞刺激的化合物。使用可表现两种独特目标的TCRs的T细胞，经过对通过非特异性(TCRMHC肽非相干性)机转抑制T细胞刺激的化合物，提供内部对照将有助于筛选过程。例如多种欲筛选的化合物可能系延着发讯路径于TCR触发后的各点阻断IL-2的制造，但不一定系于TCR与MHC/肽交互作用该点阻断IL-2的制造。一般具有胞毒性效应的化合物也可阻断IL-2的制造。经过使用不同MHC/肽复合物试验刺激，双重TCR细胞系用来决定抑制性化合物系经过干扰TCRMHC/肽交互作用而发挥作用、或于IL-2制造/分泌过程的某一点发挥作用方面极为有用。
由本例，如实施例7所述，生成一种可表现内生性2B4 TCR及重组DO11.10scTCR的模式细胞系。为了评比T细胞系对于透过2B4及DO11.10 TCR的刺激的反应，细胞于含有经以抗原提呈细胞(APC)加脉冲的肽的孔内培养。例如2B4转移感染株与使用OVA或PCC加脉冲的A20(IAd)细胞、或于使用OVA或PCC加脉冲的CH12(IEκ)细胞共同培养。实验结果(第17A图及第17B图)显示2B4转移感染株及野生型2B4细胞对以PCC加脉冲的CH12细胞有反应，但对以OVA加脉冲的CH12细胞或对以PCC加脉冲的A20无反应。但于以OVA加脉冲的A20细胞存在下，2B4转移感染株有反应且制造IL-2，但野生型2B4细胞则否。资料提示T细胞可经基因工程处理而表现至少二种功能不同的抗原特异性TCRs。下个实验系试验2B4转移感染株对制动MHC/肽分子的反应。进行此项研究的基本原理解释于实施例10，而结果显示于实施例11。
将发展出模式检定分析系统来识别可阻断DO11.10 scTCR与制动scIAd/OVA间的交互作用的化合物。使用DO11.10 scTCR 2B4转移感染株的检定分析将如实施例11所述进行。可经过阻断DO11.10 TCR与IAd/OVA间的交互作用而抑制细胞的刺激的该等化合物随后于刺激检定分析，使用相同DO11.10 scTCR 2B4转移感染株及制动scIEκ/PCC筛选。若2B4 TCR结合scIEκ/PCC结果获得细胞刺激，则抑制剂化合物可能经过锁定特异性阻断DO11.10 TCR与scIAd/OVA间的交互作用作目标发挥效果。但若发现细胞刺激的抑制与使用的MHC/肽复合物独立无关，则化合物可归类为T细胞刺激的非特异性抑制剂。
长期目的系形成一种细胞系，其系使用两种或两种以上通过不同MHC家族限剪的TCRs重新构成。这种办法的优点为可免除各次筛选实验中处理与操作多个细胞系带来的变化。
实施例15-识别TCRMHC/肽交互作用抑制剂的基于细胞表面受体检测检定分析的发展多价MHC/肽复合物及TCRs用于萤光染色表面携带有同源受体的细胞(Altman J.D.等人(1996)科学27494-96)。例如T细胞杂交瘤可使用多元体单链第II类Ig分子特异性染色。此项研究中，GD12或DO11.10 T细胞杂交瘤(5×105细胞/孔)与10微克/孔scIAd/GD-Ig分子于37℃共同培育隔夜。GD12 TCR对IAd的gD 246-261肽有特异性，而DO11.10 TCR对IAd的OVA 323-339肽有特异性。经隔夜培养后，细胞以PBS洗涤，以抗小鼠IgG2b mAb-生物素及链丝菌抗生物素-胞色素于4℃共同培养1小时。然后细胞以PBS、含1％甲醛的PBS及PBS洗涤。染色细胞的流动细胞计量术指出，scIAd/GD-Ig分子特异性染色GD12 T细胞杂交瘤，但未能染色DO11.10 T细胞(第20图)。于与抗小鼠IgG2b mAb-生物素及链丝菌抗生物素-胞色素单独培养的GD12 T细胞内，未观察得细胞染色。结果证实本检定分析使用多价MHC/肽复合物作为探针，可检测细胞表面TCRs。
检测T细胞表面抗原用的单纯基于孔板的细胞ELISAs也述于参考文献(参考Grunow，R.等人(1994)免疫学方法期刊17193-102)。虽然这些检定分析可检测单株抗体的结合，但也可发展类似检定分析版本来检测下述化合物，该化合物系抑制多价MHC/肽复合物与细胞表面TCR间的交互作用。例如GD12 T细胞添加于经过聚离胺酸涂覆的96孔微滴度孔板的生长培养基。孔板于37℃及10％二氧化碳培养，让T细胞杂交瘤附着于涂覆孔。多价scIAd/GD-Ig分子添加至细胞与试验化合物(化合物稀释剂作为对照)。培育后，移开未结合的scIAd/GD-Ig分子，附着的细胞经洗涤。多种市售探针，包括酶联结及萤光发色基团联结抗体可用以揭示scIAd/GD-Ig分子与GD12 TCR间的交互作用。例如可添加抗-IgG2b mAb-HPR探针来检测与TCR结合的scIAd/GD-Ig分子。移开未结合的抗体，各孔与TMB酶基质共同培育来检测TCRscIAd/GD-Iganti-IgG2b mAb-HPR复合物。显色后，以1M硫酸中止反应，测定于450纳米的吸光比。初期研究决定适当数目的T细胞及多价单链第II类Ig分子数量，以及揭露敏感及线性检测MHC/肽-TCR交互作用所需抗体探针。对照的操作方式为，不同MHC多元体例如scIAd/OVA-Ig添加至其中，替代scIAd/GD-Ig来建立检定分析背景值。试验化合物抑制特异性MHC/肽-TCR交互作用的能力系以信号的丧失作测量。例如可抑制细胞表面GD12 TCR与scIAd/GD-Ig多元体间的交互作用的试验化合物将导致吸光比读数低于对照孔观察得的吸光比读数，对照孔含有化合物稀释剂及细胞与MHC/肽探针。抑制性化合物的特异性于其它基于细胞的ELISAs使用携带不同TCRs及其对应多价MHC/肽探针的细胞检验。
实施例16-发展基于蛋白质的筛选方法用以识别可扩大与抑制TCRMHC抗原交互作用的化合物本例目的系发展使用重组TCR及MHC抗原反应剂的蛋白质-蛋白质结合检定分析。经过建立基于蛋白质的检定分析，可发展出一种高产出量筛选方法用来识别直接促效或直接拮抗目标TCRMHC/肽交互作用的化合物。这种筛选检定分析比基于细胞的检定分析的优势为检测得的胞毒性或非特异性影响细胞反应的「伪阳性」化合物数目减少。采行的办法系使用经纯化的重组TCR及MHC抗原复合物来建立ELISA。
简言之，264 TCR的cDNA(得自野生型人肿瘤阻遏子蛋白质p53且经HLA-A2限剪的肽片段264-272)系由Linda Sherman博士提供(史奎普(Scripps)研究所，加州拉荷拉市)。Vα3.1及Vβ3.0基因的放大系如审查中的美国专利申请案第08/813,731号，名称「包含噬菌体膜衣蛋白质及单链T细胞受体的融合蛋白质」)及第08/943,086号(「包含单链T细胞受体及免疫球蛋白轻链恒定区的融合蛋白质」)所述进行，但使用的寡核苷酸对264 TCR有特异性。264 TCR呈三领域scTCR-Cκ融合蛋白质的克隆系以对DO11.10 TCR所述方式进行(如前文审查中的美国专利申请案所述)。264 scTCR-Cκ融合载体转移感染CHO细胞用以表现可溶性蛋白质于培养基。然后264 scTCR蛋白质于亲和管柱上纯化至均质，如SDS-PAGE分析可证。
另外，用以制造HLA-A2及β2免疫球蛋白分子的载体系统系由John Altman博士提供(艾莫利(Emory)大学，乔治亚州亚特兰大)且述于Altman等人(Altman，J.D.，P.A.H.Moss，P.J.R.Goulder，D.H.Barouch，M.G.McHeyzer-Williams，J.I.Bell，A.J.McMichael&M.M.Davis，1996，科学27494-96)。为了制造载荷感兴趣的肽的HLA-A2分子，遵照Mark Davis博士(史丹福大学加州保罗奥图)提出的计划(参考Altman等人，1996，科学27494-96)，结果导致形成功能分子。于西法雷司(Sephadex)-200尺寸排除管柱上分离正确折叠的肽/HLA-A2复合物，呈单峰于50kD迁移。然后蛋白质复合物使用生物素接合酶(阿维帝公司，科罗拉多州丹佛市)生物素化，附接单一生物素部分至C端BirA序列。生物素化A2复合物使用链丝菌抗生物素多元体化，生物素特异性蛋白质相对于每分子链丝菌抗生物素可结合高达4个生物素残基。使用HLA-A2及链丝菌抗生物素蛋白质的莫耳比＝4∶1，生成四聚体HLA-A2/肽复合物。使用四聚体(比较单体)的优势为当以TCR交互作用时，四聚体显示较高结合作用。为证实此点，使用BIAcore仪器进行蛋白质结合研究，显示可溶性四聚体HLA-A2/264肽复合物结合至制动264 scTCR-Cκ融合蛋白质的程度至比单元体HLA-A2/264肽复合物结合制动融合蛋白质更高的程度。
基于此项发现，发展出使用HLA-A2/264四聚体技术来验证TCRMHC/肽交互作用的ELISA。本检定分析中264 scTCR-Cκ融合蛋白质以2、1及0.5微克/孔涂覆于96孔孔板。然后孔板经洗涤及以264/HLA-A2四聚体探测。结果显示于第21图，提示HLA-A2四聚体含有264肽(而非149肽)以肽特异性方式结合至制动264scTCR-Cκ蛋白质。此项研究证明使用基于蛋白质的ELISA来检测TCR与MHC/肽分子间的交互作用的「原理证明」。此处所述结果提示本检定分析可应用于其它TCRMHC/肽对，建立基于蛋白质的检定分析办法，来通过高产出量筛选方法识别激动剂及拮抗剂化合物。
例如经纯化的264 scTCR-Cκ融合蛋白质涂覆于96孔孔板各孔的50微升PBS。产生线性反应的264 scTCR-Cκ融合蛋白质需要量将通过实验决定。24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳50微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或50微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入HLA-A2/264四聚体(于50微升培养基)。于室温经30分钟培养后，移开蛋白质溶液，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。兔抗链丝菌抗生物素抗血清添加至各孔。于室温经20分钟培养后，各孔经洗涤及加入山羊抗兔Ig抗血清结合至HRP。于室温经30分钟后，各孔经洗涤，加入ABTS酶基质。酶基质溶液经显色且读取于405纳米的吸光比。吸光比读数与结合至264 scTCR-涂覆孔的HLA-A2/264四聚体数量有交互关联。
化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以于405纳米的吸光比读数的降低测量。其中使用抗TCR Ab替代MHC/肽复合物的检定分析系进行用来测定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽复合物交互作用、抑或经过全面抑制蛋白质蛋白质交互作用而发挥功能。可抑制MHC/肽复合物结合、但不会变更抗TCR抗体结合的化合物将作领先化合物继续研究。此外其它成对TCR及MHC/肽分子的检定分析系用来测定抑制性化合物的特异性。
化合物提升MHC/肽复合物与重组TCR间交互作用的能力将以于405纳米的吸光比读数数量增高测量。如前述，进行使用其它成对TCR与MHC/肽分子或抗TCR抗体的检定分析来测定刺激性化合物的特异性。因HLA-A2/p52 264-272肽复合物表示肿瘤抗原，可特异性刺激TCR与这种抗原间的交互作用的化合物证实可用于发展抗癌药剂。类似筛选方法可发展用来识别可刺激TCR与MHC抗原复合物间的特异性交互作用的化合物，其中该肽系衍生自传染病病原。这种方法的最终目的系分离抗感染剂。
实施例17-发展基于蛋白质的筛选方法用来识别可抑制人类自体免疫病相关TCRMHC/肽交互作用的化合物本例目的系使用人类自体免疫病相关重组人类TCR及人类MHC抗原反应剂，发展一种蛋白质-蛋白质结合检定分析。经过建立基于蛋白质的检定分析，可发展出高产出量的筛选方法来识别直接拮抗自体免疫TCRMHC/肽交互作用的化合物。这些化合物可能引导开发选择性免疫抑制剂。
衍生自E11人类T细胞纯株的TCR将于哺乳类细胞表现为重组三领域单链可溶性TCR。该方法用于构建适当表现载体；哺乳类细胞转移感染及选择；以及sc-TCR的制造与纯化等方法述于实施例6以及述于Weidanz等人，1998免疫学期刊(J.Immunity)方法22159，美国专利申请案第08/813,731及08/943,086号。
使用E11 scTCR及scDR2/MBP-Ig(参考实施例4)发展出ELISA来验证自体免疫TCRMHC/肽交互作用。本检定分析中，E11 scTCR蛋白质涂覆于96孔孔板。然后孔板使用scDR2/MBP-Ig涤与探测。洗涤步骤后结合的scDR2/MBP-Ig使用山羊抗人IgG-HRP探测，且使用TMB酶基质显色检测。于450纳米的吸光比用来测定E11 scTCR涂覆孔的scDR2/MBP-Ig结合量。本研究验证使用基于蛋白质的ELISA检测自体免疫TCR与MHC/肽间的交互作用的「原理证明」，此项研究确立一种基于蛋白质的检定分析办法，通过高产出量筛选方法识别拮抗剂化合物。
例如经纯化的E11 scTCR蛋白质涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS。于实验决定产生线性反应的E11 scTCR融合蛋白质需要量。24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳50微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或50微升含试验化合物于2.5％DMSO的培养基。然后加入scDR2/MBP-Ig(于50微升培养基)。于室温培养后，移开蛋白质溶液，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。加入结合至HRP的山羊抗人Ig抗血清。于室温经30分钟后，各孔经洗涤，加入TMB酶基质。酶基质反应以0.18M硫酸终止，于450纳米读取吸光比。吸光比读数将与结合至经E11 scTCR-涂覆孔的scDR2/MBP-Ig数量有交互关联。
化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以于450纳米读取的吸光比数量的降低测定。进行检定分析，其中使用抗-TCR Ab替代MHC/肽复合物，来决定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽交互作用、抑或经过全面性抑制蛋白质蛋白质交互作用发挥效果。可抑制MHC/肽复合物的结合、但不会变更抗-TCR抗体的结合的化合物将作为领先化合物继续追踪研究。使用其它成对TCR与MHC/肽分子的检定分析将进行用来测定抑制性化合物的特异性。特异性抑制自体免疫TCR与其同源MHC/肽复合物交互作用的化合物证实可用于发展具有治疗效果的免疫抑制剂。
实施例18-发展均质筛选方法用来识别可抑制人类自体免疫病关联的TCRMHC/肽交互作用的化合物本例目的系发展使用与人类自体免疫病关联的人类TCR及人类MHC/肽反应剂的蛋白质-蛋白质结合均质检定分析。均质检定分析的优点为无需分离未结合组成分的步骤或洗涤步骤。多种不同系统让均质检定分析可呈基于细胞的检定分析或基于蛋白质的检定分析进行。
本例所述检定分析版本系采用特化珠粒或微球。基于珠粒的反应剂于市面上可以多种不同形式获得，允许高度结合/捕捉重组蛋白质，有效检测及使用不同分离及均质检定分析方法。用于多种高产出量筛选方法，以基于珠粒的反应剂为佳。
例如基于α筛选(AlphaScreen)反应剂(派克(Packard)生科公司)的均质发光邻近检定分析可使用E11 TCR及DR2/MBP分子发展出来验证自体免疫TCRMHC/肽交互作用。本检定分析版本中，二小珠粒以TCR及MHC/肽复合物标记，通过TCRMHC/肽交互作用调整至邻近。雷射激发时，「施体」珠粒产生的化学信号将不被检测，且无「受体」珠粒于紧邻附近。当TCRMHC/肽交互作用将二珠粒结合在一起时，进行化学反应串级用来产生大为放大的信号。化合物试验其调节(增或减)TCRMHC/肽交互作用产生信号的能力。
衍生自E11人类T细胞纯株的TCR将如所述，于哺乳类细胞表现为重组三领域单链可溶性TCR。BirA目标序列也使用实施例1及2的方法结合于E11 scTCR C端。纯化后的E11 scTCR蛋白质将如实施例1及2所述使用生物素接合酶进行生物素化。
用于本检定分析，E11 scTCR-生物素蛋白质结合至经链丝菌抗生物素涂覆的施体珠粒。scDR2/MBP-Ig(参考实施例4)系由经抗人IgG涂覆的受体珠粒结合。珠粒经混合，让E11 scTCR蛋白质与scDR2/MBP复合物间关联。这种交互作用将施体珠粒与受体珠粒调整于邻近范围以内(＜200纳米)，以允许出现光诱生化学反应而产生可检测的信号。最理想的涂覆施体及受体珠粒的条件以及经蛋白质涂覆的珠粒间发生交互作用的条件可经实验决定。施体珠粒的化学反应系通过680纳米的光线诱发。于能量移转至位在邻近的受体珠粒后，可于520-620纳米测得产生的信号。这种测量可以时间分割模式进行以将检定分析中萤光化合物的背景影响降至最低。本研究验证使用基于均质蛋白质的均质检定分析来检测自体免疫TCR与MHC/肽间的交互作用的「原理的证明」，将建立一种均质检定分析办法，通过高产出量筛选方法识别拮抗剂化合物。
例如E11 scTCR施体珠粒与scDR2/MBP受体珠粒于微滴度孔内混合产生可检测的信号。产生线性反应所需反应条件将以实验决定。含2.5％二甲亚的培养基或含试验化合物于2.5％ DMSO的培养基添加至各孔。于680纳米雷射激发后，使用阿法奎司特(AlphaQuest)HST微孔板分析仪(派克公司)以时间分割模式(20毫秒衰变)检测于550纳米的萤光信号。萤光信号将以结合至E11 scTCR施体珠粒的scDR2/MBP受体珠粒数量交互关联。
化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以于550纳米的萤光信号量的降低测定。进行检定分析，其中使用抗-TCR Ab替代MHC/肽复合物，来决定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽交互作用、抑或经过全面性抑制蛋白质蛋白质交互作用发挥效果。可抑制MHC/肽复合物的结合、但不会变更抗-TCR抗体的结合的化合物将作为领先化合物继续追踪研究。使用其它成对TCR与MHC/肽分子的检定分析将进行用来测定抑制性化合物的特异性。特异性抑制自体免疫TCR与其同源MHC/肽复合物交互作用的化合物证实可用于发展具有治疗效果的免疫抑制剂。
实施例19-发展基于蛋白质的筛选方法用以识别可扩大与抑制TCRMHC抗原交互作用的化合物本例目的系发展使用重组TCR及MHC抗原反应剂的蛋白质-蛋白质结合检定分析。经过建立基于蛋白质的检定分析，可发展出一种高产出量筛选方法用来识别直接促效或直接拮抗目标TCRMHC/肽交互作用的化合物。这种筛选检定分析比基于细胞的检定分析的优势为检测得的胞毒性或非特异性影响细胞反应的「伪阳性」化合物数目减少。采行的办法系使用经纯化的重组TCR及MHC抗原复合物来建立ELISA。
简言之，264 TCR的cDNA(得自野生型人肿瘤阻遏子蛋白质p53且经HLA-A2限剪的肽片段264-272)系由Linda Sherman博士提供(史奎普研究所，加州拉荷拉市)。Vα3.1及Vβ3.0基因的放大系如审查中的美国专利申请案第08/813,731号，名称「包含噬菌体膜衣蛋白质及单链T细胞受体的融合蛋白质」)及第08/943,086号(「包含单链T细胞受体及免疫球蛋白轻链恒定区的融合蛋白质」)所述进行，但使用的寡核苷酸对264 TCR有特异性。264 TCR呈三领域scTCR-Cκ融合蛋白质的克隆系以对DO11.10 TCR所述方式进行(如前文审查中的美国专利申请案所述)。264 scTCR-Cκ融合载体转移感染CHO细胞用以表现可溶性蛋白质于培养基。然后264 scTCR蛋白质于亲和管柱上纯化至均质，如SDS-PAGE分析可证。
另外，用以制造HLA-A2及β2免疫球蛋白分子的载体系统系由John Altman博士提供(艾莫利大学，乔治亚州亚特兰大)且述于Altman等人(Altman，J.D.，P.A.H.Moss，P.J.R.Goulder，D.H.Barouch，M.G.McHeyzer-Williams，J.I.Bell，A.J.McMichael&M.M.Davis，1996，科学27494-96)。为了制造载荷感兴趣的肽的HLA-A2分子，遵照Mark Davis博士(史丹福大学加州保罗奥图)提出的计划(参考Altman等人，1996，科学27494-96)，结果导致形成功能分子。于西法雷司-200尺寸排除管柱上分离正确折叠的肽/HLA-A2复合物，呈单峰于50kD迁移。然后蛋白质复合物使用生物素接合酶(阿维帝公司，科罗拉多州丹佛市)生物素化，附接单一生物素部分至C端BirA序列。生物素化A2复合物使用链丝菌抗生物素多元体化，生物素特异性蛋白质相对于每分子链丝菌抗生物素可结合高达4个生物素残基。使用HLA-A2及链丝菌抗生物素蛋白质的莫耳比＝4∶1，生成四聚体HLA-A2/肽复合物。使用四聚体(比较单体)的优势为当以TCR交互作用时，四聚体显示较高结合作用。为证实此点，使用BIAcore仪器进行蛋白质结合研究，显示可溶性四聚体HLA-A2/264肽复合物结合至制动264 scTCR-Cκ融合蛋白质的程度至比单元体HLA-A2/264肽复合物结合制动融合蛋白质更高的程度。
基于此项发现，发展出使用HLA-A2/264四聚体技术来验证TCRMHC/肽交互作用的ELISA。本检定分析中264 scTCR-Cκ融合蛋白质以2、1及0.5微克/孔涂覆于96孔孔板。然后孔板经洗涤及以264/HLA-A2四聚体探测。结果显示于第21图，提示HLA-A2四聚体含有264肽(而非149肽)以肽特异性方式结合至制动264scTCR-Cκ蛋白质。
使用HLA-A2/264或HLA-A2/149四聚体技术发展第二ELISA。用于本检定分析，四聚体系如前述制备，但生物素化HLA-A2复合物系使用链丝菌抗生物素过氧化酶(科葛德及派锐实验室)进行多元体化而形成HLA-A2/264-HRP或HLA-A2/149-HRP四聚体。然后加标记的四聚体用作为探针来检测与孔板结合的TCR。为了制动TCR，抗-TCRβ恒定领域特异性抗体H57(BD法明金公司)以250纳克/孔涂覆于96孔微滴度孔板各孔的50微升PBS，于4℃培养隔夜。去除抗体，各孔使用10％血清于PBS阻断1小时。然后各孔以200微升含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗3次。经纯化的264 scTCR-Cκ融合蛋白质添加于含1％血清的50微升PBS。于室温经1小时后，各孔经洗涤，HLA-A2/264-HRP或(对照HLA-A2/149-HRP)四聚体添加于50微升含1％血清的PBS。于室温经2小时后，各孔经洗涤，加入100微升ABTS酶基质，让色彩显色20分钟。酶基质反应系以405纳米的吸光比读取，表示通过TCR融合蛋白质结合的经标记MHC/肽含量。研究结果显示264 scTCR与HLA-A2/264-HRP探针间产生特异性交互作用，但264 scTCR与对照HLA-A2/149-HRP探针间并无交互作用(第22A及22B图)。产生线性反应的264 scTCR-Cκ融合蛋白质及HLA-A2/264-HRP探针的需要用量可经实验决定。也进行提高264 scTCR浓度相对于提升HLA-A2/264-HRP浓度的矩阵研究，以决定反应的线性范围(第23A及23B图)。另一项研究对经纯化的264 scTCR-IgG1融合蛋白质与264 scTCR-Cκ融合蛋白质作比较。发现两种蛋白质与HLA-A2/264-HRP探针交互作用的能力相等(第24A-D图)。
此项研究证明使用基于蛋白质的ELISA来检测TCR与MHC/肽分子间的交互作用的「原理证明」。此处所述结果提示本检定分析可应用于其它TCRMHC/肽对，建立基于蛋白质的检定分析办法，来通过高产出量筛选方法识别激动剂及拮抗剂化合物。
例如264 scTCR-CκHLA-A2/264-HRP ELISA用于筛选化学文库有关可抑制TCRMHC/肽交互作用的化合物。实验中，80种不同化合物于50μM通过加入HLA-A2/264-HRP探针至264 scTCR涂覆孔各别进行试验。如前述进行ELISA。测定各化合物抑制ELISA反应的能力。发现一种化合物于50μM可抑制酶基质反应达80％，且具有ID50＝2μM。结果指示这种基于蛋白质的检定分析可用于识别可拮抗TCR与MHC抗原间的交互作用的化合物。
另一范例中，经纯化的264 scTCR-Cκ融合蛋白质涂覆于96孔孔板各孔的50微升PBS。产生线性反应的264 scTCR-Cκ融合蛋白质需要量将通过实验决定。24小时后，移开涂覆溶液，各孔接纳50微升含2.5％二甲亚的培养基(IMDM含10％FBS)、或50微升含试验化合物于2.5％ DMSO的培养基。然后加入HLA-A2/264四聚体(于50微升培养基)。于室温经30分钟培养后，移开蛋白质溶液，各孔以含1％崔顿X-100的Tris缓冲食盐水洗涤。兔抗链丝菌抗生物素抗血清添加至各孔。于室温经20分钟培养后，各孔经洗涤及加入山羊抗兔Ig抗血清结合至HRP。于室温经30分钟后，各孔经洗涤，加入ABTS酶基质。酶基质溶液经显色且读取于405纳米的吸光比。吸光比读数与结合至264 scTCR-涂覆孔的HLA-A2/264四聚体数量有交互关联。
化合物拮抗MHC/肽复合物与重组TCR间的交互作用的能力将以于405纳米的吸光比读数的降低测量。其中使用抗TCR Ab替代MHC/肽复合物的检定分析系进行用来测定抑制性化合物系经过拮抗TCRMHC/肽复合物交互作用、抑或经过全面抑制蛋白质蛋白质交互作用而发挥功能。可抑制MHC/肽复合物结合、但不会变更抗TCR抗体结合的化合物将作领先化合物继续研究。此外其它成对TCR及MHC/肽分子的检定分析系用来测定抑制性化合物的特异性。
化合物提升MHC/肽复合物与重组TCR间交互作用的能力将以于405纳米的吸光比读数数量增高测量。如前述，进行使用其它成对TCR与MHC/肽分子或抗TCR抗体的检定分析来测定刺激性化合物的特异性。因HLA-A2/p52 264-272肽复合物表示肿瘤抗原，可特异性刺激TCR与这种抗原间的交互作用的化合物证实可用于发展抗癌药剂。类似筛选方法可发展用来识别可刺激TCR与MHC抗原复合物间的特异性交互作用的化合物，其中该肽系衍生自传染病病原。这种方法的最终目的系分离抗感染剂。
文中揭示的参考文献皆以引用方式并入此处。
虽然已经参照特定具体实施例说明本发明，但可未悖离例如如下申请权利要求界定的本发明的范围，做出本发明的修改及变化。
权利要求
1.一种识别调节一种免疫复合物的化合物的方法，该免疫复合物包含一种T细胞受体(TCR)以及一种主要组织相容复合物(MHC)抗原，该方法包含a)在有或无试验化合物存在下，第一TCR分子接受MHC抗原分子，接触是在足够让TCR与MHC抗原分子特异性结合成为一种免疫复合物的条件下进行，b)在有以及无试验化合物存在下，检测该免疫复合物的存在，c)选出一种可变更TCR与MHC抗原分子间的特异性结合的试验化合物；以及d)识别该被选定的化合物为可调节该免疫复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该MHC抗原为一种基于MHC的分子包含MHC/肽复合物、MHC/超抗原复合物、MHC/脂质(或糖脂质)复合物、或同种异体反应性或异种反应性MHC分子。
3.根据权利要求1及2所述的方法，其中该TCR或MHC组成分中的至少一个为异二聚体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该异二聚体为天然或重组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该TCR分子为重组单链(sc-)分子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该TCR分子为完全可溶。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该TCR分子系通过细胞表现为表面分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该TCR分子包含一个跨膜区域。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该TCR分子为多价。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该TCR分子为包含至少部分哺乳类免疫球蛋白分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该融合免疫球蛋白分子包含一恒定领域或其功能片段。
12.根据权利要求11所述的方法，其中该恒定领域包含至少部分κ或λ轻链恒定领域(CL)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中该恒定领域为重链恒定领域。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中该免疫球蛋白分子具有IgG、IgM、IgA或嵌合同型体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中该哺乳类重链具有IgG同型体且包含至少一个CH2-CH3领域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中该哺乳类IgG重链包含一个CH1-CH2-CH3领域。
17.根据权利要求14所述的方法，其中该哺乳类重链具有IgG同型体且包含至少一个CH2-CH3-CH4领域。
18.根据权利要求10所述的方法，其中该哺乳类免疫球蛋白分子包含鼠或人序列或由鼠或人序列组成。
19.根据权利要求9-18中任一项所述的方法，其中该TCR分子进一步包含至少一标记用以将二或多个TCR分子结合在一起。
20.根据权利要求19所述的方法，其中该TCR分子可形成二聚体、三元体、四聚体或更高级复合物。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该TCR分子包含至少部分融合哺乳类CD3ζ序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中该融合哺乳类CD3ζ序列包含一个跨膜区域以及一个胞质领域；或其功能片段。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中该MHC抗原的MHC组成分为第I类、第II类或其组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该MHC抗原的MHC组成分为异二聚体或重组单链分子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中该MHC抗原分子为一种MHC/肽复合物，各个MHC抗原分子包含一个融合提呈肽。
26.根据权利要求24所述的方法，其中该MHC抗原分子为一种MHC/肽复合物，该方法进一步包含以适当提呈肽载荷MHC组成分。
27.根据权利要求26所述的方法，其中该提呈肽的载荷系于接触步骤之前或之中进行。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子为完全可溶。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子系通过细胞表现为表面分子。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该MHC抗原分子包含至少部分跨膜区域。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子为多价。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子包含至少部分融合哺乳类免疫球蛋白分子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中该MHC抗原分子的融合免疫球蛋白分子包含一个恒定领域；或其功能片段。
34.根据权利要求33所述的方法，其中该恒定领域包含至少部分κ或λ轻链恒定领域(CL)。
35.根据权利要求33所述的方法，其中该恒定领域为重链恒定领域。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中该免疫球蛋白分子具有IgG、IgM、IgA或嵌合同型体。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中该哺乳类重链具有IgG同型体且包含至少一个CH2-CH3领域。
38.根据权利要求37所述的方法，其中该哺乳类IgG重链包含一个CH1-CH2-CH3领域。
39.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中该哺乳类重链具有IgG同型体且包含至少一个CH2-CH3-CH4领域。
40.根据权利要求32所述的方法，其中该哺乳类免疫球蛋白分子包含鼠或人序列或由鼠或人序列组成。
41.根据权利要求31-40中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子进一步包含至少一标记用以将二或多个MHC抗原分子结合在一起。
42.根据权利要求41所述的方法，其中该MHC抗原分子可形成二聚体、三元体、四聚体或更高级复合物。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子包含至少部分融合哺乳类CD3ζ序列。
44.根据权利要求43所述的方法，其中该融合哺乳类CD3ζ序列包含一个跨膜区域以及一个胞质领域；或其功能片段。
45.根据权利要求1-5及7-44中任一项所述的方法，其中该TCR分子系通过细胞表现为一种包含至少一个跨膜区域的表面分子；或其功能片段。
46.根据权利要求45所述的方法，其中该同源MHC抗原分子系结合至固体载体。
47.根据权利要求1-27项及第29-46中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子系通过细胞表现为一种包含至少一个跨膜区域的表面分子。
48.根据权利要求47所述的方法，其中该TCR分子系结合至固体载体。
49.根据权利要求46或48所述的方法，其中该结合MHC抗原或TCR分子中的至少一个系结合至树状聚合物、合成或半合成聚合物中的至少一个。
50.根据权利要求49所述的方法，其中该固体载体为组织培养孔或孔板、试验长条、层析术基体、电泳基体或珠粒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中该珠粒为磁性珠粒。
52.根据权利要求45及47所述的方法，其中该检测步骤包含检测至少一种得自可表现TCR分子的细胞、可表现MHC抗原分子的细胞中的至少一种反应；或二者，该反应系经过稳定形成免疫复合物产生。
53.根据权利要求52所述的方法，其中通过该方法检测的细胞反应为细胞黏着、膜电位、胞内或胞外离子浓度、胞内激酶活性、磷酸酶活性、胞内蛋白质输送、内生性或非同系基因表现、蛋白质的制造或分泌包括至少一种细胞因子的制造、细胞增殖、细胞凋亡程序、RNA合成或DNA合成中的至少一个。
54.根据权利要求53所述的方法，其中该方法进一步包含通过细胞表现TCR分子测定至少一种细胞因子的产量。
55.根据权利要求54所述的方法，其中由表现细胞制造的细胞因子为介白质-2(IL-2)。
56.根据权利要求54及55所述的方法，其中该制造系经过细胞因子接触可特异性结合细胞因子的第一抗体，形成一种包含第一抗体及细胞因子的复合物而测定。
57.根据权利要求56所述的方法，其中该第一抗体系结合至固体载体。
58.根据权利要求56及57所述的方法，其中该细胞因子的制造系经过该复合物接触可特异性结合细胞因子的加可检测标记的第二抗体测定。
59.根据权利要求58所述的方法，其中该加可检测标记的第二抗体的存在表示于有及无试验化合物存在下形成免疫复合物。
60.根据权利要求53所述的方法，其中该检测得的细胞反应为T细胞活化或增殖。
61.根据权利要求60所述的方法，其中该T细胞活化系于标准T细胞活化检定分析测定。
62.根据权利要求45所述的方法，其中该TCR表现细胞表现至少另一型细胞表面TCR分子。
63.根据权利要求62所述的方法，其中该另一型细胞表面TCR分子包含第二TCR分子或由第二TCR分子组成，该第二TCR分子具有与第一TCR分子不同的MHC抗原结合特异性。
64.根据权利要求63所述的方法，其中该第二细胞表面TCR分子用于该方法作为对照。
65.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中该第二TCR分子为表现细胞内生的天然TCR受体。
66.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中该第二TCR分子为重组异二聚体或单链(sc-)分子。
67.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中该试验化合物具有一种可忽略的能力，该能力可调节包含第二TCR分子与其同源MHC抗原的对照免疫复合物的形成。
68.根据权利要求62-67中任一项所述的方法，其中该试验化合物具有一种可忽略的能力，该能力可调节包含第二TCR分子与其同源MHC抗原的对照免疫复合物的安定性。
69.根据权利要求45-68中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含与TCR分子共同表现至少一差异群集(CD)分子。
70.根据权利要求69所述的方法，其中该CD分子可加强其中至少一种细胞反应。
71.根据权利要求70所述的方法，其中该CD分子为重组分子。
72.根据权利要求71所述的方法，其中该由细胞共同表现的重组CD分子为CD4。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中该T细胞为T细胞杂交瘤。
74.根据权利要求73所述的方法，其中该T细胞杂交瘤可制造至少一种细胞因子。
75.根据权利要求74所述的方法，其中该细胞因子为介白质-2(IL-2)。
76.根据权利要求19-20项及第41-42中任一项所述的方法，其中该标记包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含至少一个生物素接合酶目标序列。
77.根据权利要求76所述的方法，其中该生物素接合酶目标序列包含至少BirA序列。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中该TCR或MHC抗原分子中的至少一个系以可检测方式加标记。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法，其中该标记可经直接或间接检测。
80.根据权利要求79所述的方法，其中该标记系经直接检测，且包括萤光、磷光、发光、产色或化学发光标记或其前驱物中的至少一个。
81.根据权利要求79所述的方法，其中该标记为放射性核种。
82.根据权利要求79所述的方法，其中该标记可经键结检测且包括标记或酶中的至少一个。
83.根据权利要求82所述的方法，其中该标记系特异性结合抗体、细胞受体、蛋白质A、蛋白质G、抗生物素、链丝菌抗生物素或其功能片段；或为通过蛋白质分解酶、蛋白质激酶、生物素接合酶或其功能片段特异性修饰的标记。
84.根据权利要求82所述的方法，其中该酶为辣根过氧化酶(HRP)、β-半乳糖甘酶(b-gal)或碱性磷酸酶(AP)。
85.根据权利要求78-84中任一项所述的方法，其中该项检测系使用ELISA检测版本达成。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中该选择步骤进一步包含识别试验化合物具有调节对照免疫复合物形成的可忽略的能力。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中该选择步骤进一步包含识别试验化合物具有调节对照免疫复合物安定性的可忽略的能力。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中该对照免疫复合物包含一种第一TCR以及可特异性结合第一TCR的抗体。
89.根据权利要求86或87所述的方法，其中该对照免疫复合物包含一种CD3分子以及一种可特异性结合CD3蛋白质的抗体。
90.根据权利要求86或87所述的方法，其中该对照免疫复合物包含一种第二TCR及其同源MHC抗原分子。
91.根据权利要求90所述的方法，其中该第二TCR分子具有与第一TCR分子不同的MHC抗原结合特异性。
92.根据权利要求90及91所述的方法，其中该第二TCR及其同源MHC抗原分子为天然或重组分子。
93.根据权利要求86-92中任一项所述的方法，其中该对照免疫复合物的形成或安定性系经过测量可表现TCR分子或CD3分子的细胞制造至少一种细胞因子的产量检测。
94.根据权利要求1-93中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子的MHC组成分为sc-MHC或HLA分子、或MHC或HLA异二聚体。
95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法，其中该MHC抗原为一种超抗原-MHC复合物，包含Mls抗原、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、SPE-A、SPE-B、SPEC、ExFT或TSST超抗原。
96.一种识别可调节免疫复合物的化合物的方法，该免疫复合物包括一T细胞受体(TCR)以及一主要组织相容复合物(MHC)抗原，该方法包含a)于有或无试验化合物存在下，可表现第一TCR分子的细胞接触结合至固体载体的MHC抗原分子，该项接触系于足以让TCR与经结合的MHC抗原分子特异性结合成为一种免疫复合物的条件下进行，b)经过测定一种来自该细胞的反应，而检测于有及无试验化合物存在下是否存在有免疫复合物，c)选出一种试验化合物，其可变更第一TCR与经结合的MHC抗原分子间的特异性结合；以及d)识别经选定的化合物为可调节免疫复合物。
97.根据权利要求96所述的方法，其中于检测步骤测定的细胞反应为细胞因子的制造或T细胞的增殖。
98.根据权利要求97所述的方法，其中该测量的细胞反应为细胞因子介白质-2(IL-2)的制造。
99.根据权利要求98所述的方法，其中该方法进一步包含于固体载体结合可特异性结合IL-2的第一抗体或其功能片段；以及形成一种抗体复合物。
100.根据权利要求95所述的方法，其中该方法进一步包含该抗体复合物与可特异性结合IL-2的加可检测标记的抗体或其功能片段接触。
101.根据权利要求100所述的方法，其中该方法进一步包含直接或间接定量可检测标记。
102.根据权利要求101所述的方法，其中该方法包含ELISA检测版本。
103.根据权利要求96-102中任一项所述的方法，其中该表现TCR分子的细胞进一步表现第二(对照)TCR分子或CD蛋白质中的至少一个。
104.根据权利要求103所述的方法，其中该CD蛋白质为CD4。
105.根据权利要求96-104中任一项所述的方法，其中该选择步骤进一步包含识别试验化合物为可减少或消除第一TCR与MHC抗原分子间的免疫复合物的形成。
106.根据权利要求96-105中任一项所述的方法，其中该选择步骤进一步包含识别试验化合物具有可忽略的能力用来调节包含第二TCR分子及其同源MHC抗原的对照免疫复合物的形成。
107.根据权利要求96-106中任一项所述的方法，其中该T细胞表现一种多发性硬化症(MS)TCR分子，该同源MHC抗原分子为包含髓磷脂碱性蛋白质(MBP)肽的MHC/肽复合物。
108.根据权利要求107所述的方法，其中该MS TCR分子包含得自经MBP限剪的MS T细胞系的TCRα链及β链。
109.根据权利要求108所述的方法，其中该MS TCR为异二聚体或重组单链分子。
110.根据权利要求108及109所述的方法，其中该MS T细胞系为E11。
111.根据权利要求96-110中任一项所述的方法，其中该MS T细胞分子包含共价结合的CD3ζ序列或其功能片段。
112.根据权利要求96-111中任一项所述的方法，其中该同源MHC抗原分子为单链(sc-)DR2/MBP蛋白质或其功能片段。
113.根据权利要求96-112中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子的MHC组成分为空白MHC第II类HLA-DR2(DRB1*1501)或其功能片段。
114.根据权利要求113所述的方法，其中该方法进一步包含MHC组成分接触MBP(氨基酸83-102)肽，以及以MBP肽载荷MHC组成分而形成MHC抗原分子。
115.根据权利要求114所述的方法，其中该载荷步骤系于结合至固体载体之前、之后或同时进行。
116.根据权利要求96-113中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子为一种包含融合MBP(氨基酸83-102)肽的MHC第II类HLA-DR2(DRB1*1501)复合物。
117.根据权利要求112-116中任一项所述的方法，其中该DR2/MBP蛋白质进一步包含一个共价结合的IgG重链恒定区或其功能片段。
118.根据权利要求113-116中任一项所述的方法，其中该DR2/MBP分子的MHC组成分为异二聚体或重组单链。
119.根据权利要求96-118中任一项所述的方法，其中该足够特异性结合TCR与MHC分子的条件，包括于适当生长培养基于37℃以及约10％二氧化碳的大气压下稳定培养经历约8小时时间。
120.根据权利要求1-119中任一项所述的方法，其中该试验化合物系溶解于适当溶剂。
121.根据权利要求120所述的方法，其中该溶剂为水、食盐水、组织培养基、约2.5％二甲亚 或生理可接受性缓冲液或载剂中的至少一个。
122.根据权利要求1-121中任一项所述的方法，其中该TCR或MHC分子为多价，且包含融合免疫球蛋白领域。
123.根据权利要求21、22、43、44及111中任一项所述的方法，其中该融合CD3ζ链包含鼠或人序列。
124.根据权利要求1所述的方法，其中该第一TCR分子为完全可溶；以及该MHC抗原分子为MHC/肽复合物。
125.根据权利要求124所述的方法，其中该第一TCR分子为重组单链(sc-)TCR分子；以及该MHC抗原为包含第I类重链以及β-2微球蛋白的重组第I类/肽复合物。
126.根据权利要求124及125所述的方法，其中该第一TCR分子系结合至固体载体。
127.根据权利要求124-126中任一项所述的方法，其中该MHC抗原分子系结合至固体载体。
128.根据权利要求124-127中任一项所述的方法，其中该第一TCR分子及MHC抗原分子系结合至固体载体。
129.根据权利要求46-128中任一项所述的方法，其中于TCR或MHC抗原分子中的至少一个结合至固体载体之前、之中、之后或同时，固体载体接触试验化合物。
130.根据权利要求124-129中任一项所述的方法，其中TCR或MHC分子中的至少一个系以可检测的方式加标记。
131.根据权利要求130所述的方法，其中该可检测标记为生物素。
132.根据权利要求131所述的方法，其中该方法进一步包含让固体载体接触可特异性结合生物素的链丝菌抗生物素或抗生物素，以及形成包含该生物素的复合物。
133.根据权利要求132所述的方法，其中该复合物的形成系经过该复合物接触可特异性结合复合物之一种经以可检测方式加标记的抗体接触而检测。
134.根据权利要求130-133中任一项所述的方法，其中该检测系使用ELISA版本达成。
135.根据权利要求1-134中任一项所述的方法，其中该检测系使用非同质检定分析版本达成。
136.根据权利要求1-135中任一项所述的方法，其中该检测系利用光学、萤光或发光测量达成。
137.根据权利要求1-136中任一项所述的方法，其中该试验化合物具有可忽略的能力，可调节包含可特异性结合的TCR分子及抗体的对照免疫复合物的形成a)未被MHC抗原分子(抗-TCR抗体)特异性结合的TCR分子上的同位素，或b)差异群集(CD)蛋白质系与细胞膜的TCR分子相关。
138.根据权利要求137所述的方法，其中该CD蛋白质为CD3，以及该抗体为可特异性结合关联TCR分子的CD3(抗-CD3抗体)。
139.根据权利要求1-138中任一项所述的方法，其中于第一TCR与MHC抗原分子接触之前、之中、之后或同时，第一TCR或MHC抗原分子中的至少一个系接触试验化合物。
140.一种试验化合物，它是经过根据权利要求1-139中任一项所述的方法识别。
141.根据权利要求140项的试验化合物，其中该试验化合物可调节TCR分子与其同源MHC抗原分子间的免疫复合物的形成。
142.根据权利要求140及141项的试验化合物，其中该试验化合物可减少或增加TCR与MHC抗原分子间的免疫复合物的形成速率。
143.根据权利要求140及141项的试验化合物，其中该试验化合物可减少或增高TCR与MHC抗原分子间的解离速率。
144.根据权利要求140至143中任一项的试验化合物，其中该试验化合物可减少或增加TCR与MHC抗原分子间的免疫复合物的需求。
145.根据权利要求140至144中任一项的试验化合物，其中该试验化合物可减少或增加TCR与MHC抗原分子间的免疫复合物的多元体化。
146.根据权利要求140至145中任一项的试验化合物，其中该试验化合物相对于适当对照，可减少或增加至少一种细胞反应达约1.5至约100倍。
147.根据权利要求140项的试验化合物，其中该细胞反应为细胞因子的制造。
148.根据权利要求147项的试验化合物，其中该制造的细胞因子为介白质-2(IL-2)。
149.根据权利要求146至148中任一项的试验化合物，其中该适当对照为于抗-TCR或抗-CD3抗体存在下制造的细胞因子。
150.一种医药组合物，包含至少一种根据权利要求140-149中任一项的化合物。
151.一种抑制哺乳类免疫反应的方法，该方法包含投予治疗有效量的根据权利要求150项的医药组合物。
152.一种刺激哺乳类免疫反应的方法，该方法包含投予治疗有效量的根据权利要求150项的医药组合物。
153.一种试剂盒，它是用于执行至少一种根据权利要求1-139、151及152中任一项所述的方法。
154.一种重组TCR分子，包含哺乳类CD3ζ序列或其功能片段。
155.根据权利要求154项的重组TCR分子，其中该CD3ζ序列或其功能片段包含鼠或人序列。
全文摘要
本发明公开包括T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合物(MHC)抗原的免疫复合物的调节化合物的识别方法。本发明有多项有用用途，包括提供免疫反应调节组合物检测用的高产出量筛选检定分析。
文档编号G01N33/53GK1430728SQ01810020
公开日2003年7月16日 申请日期2001年5月16日 优先权日2000年5月25日
发明者P·罗德, V·威特曼, J·A·韦达兹, M·布克哈特, K·F·卡德, R·托尔, J·阿塞韦多, 黄庆祥 申请人:苏诺尔分子公司