专利名称：功能化的量子点及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种功能化的量子点和其被功能化的方法以及用途。具体涉及一种N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点和其被N-羟基琥珀酰亚胺酯化的方法及用途。
背景技术：
近年来，纳米技术已逐渐融合渗透至分析科学，极大地促进了生物分析的发展。
量子点(quantum dots，QDs)，又称半导体纳米微晶体，是一种由II-VI族或III-V族元素组成，直径约为2nm～6nm，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，具有优良的光谱特征和光化学稳定性。单独的量子点颗粒易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低。如果以其为核心，用另一种半导体材料包覆形成核壳结构后，如包覆CdSe/ZnS后，量子产率可提高约50％甚至更高，消光系数数倍增加，能发射很强的荧光，可大大提高检测灵敏度，十分有利于信号的检测。
通过修饰量子点的表面结构，可使量子点具有水溶性，能与生物分子结合，不影响生物分子正常的生理功能，通过光致发光被检测出等特点。故被用于生物分子的标记。目前，已经有商品化的量子点和量子点偶联物。
生物分析中常用的标记物主要有酶或底物、化学或生物发光体系和荧光物质。早期应用的放射性同位素，其放射性污染对环境和人体的损害较大。酶免疫分析法，因酶本身容易失活，应用的局限性较大。化学和生物发光分析法，易受外部环境影响，稳定性较差，瞬间化学反应后，样品的发光无法再现，结果的重现性差。荧光探针，因其有机荧光染料激发光谱窄，发射光谱宽且不对称，荧光稳定性差，实现多组分同时检测较困难。
量子点荧光探针。优点是(1)不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点。(2)被激发的量子点所发射的荧光谱峰狭窄而对称，半高峰宽通常只有40nm甚至更小，这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，且发射光谱不出现交叠。(3)量子点荧光探针的荧光强度比最常用的罗丹明6G染料高20倍，稳定性是它的100倍以上，可经受反复多次激发，能够进行定量检测。所以，量子点荧光探针是一种理想的应用于分子生物学和生物工程学的超灵敏、多色和多组分检测的荧光探针。目前，量子点荧光探针已广泛用于细胞成像、免疫荧光检测、活体成像等生物学方面的研究。(1)细胞成像。量子点纳米晶体用作细胞内的荧光标记物，可进行长时间、多分子同时检测。可进行从几分钟到几小时长时间细胞内过程的实时监测、跟踪。可用不同颜色的量子点同时观测活细胞内或其表面的多个靶分子的生物功能。(2)免疫荧光检测。将量子点与抗体结合用于荧光免疫分析、检测。用交联生物素的量子点对葡萄球菌肠毒素B进行免疫色谱检测，检测限最低可达10ng/mL。(3)病理组织检测。用于病理组织标本的多重标记和分子水平的分析。用于检测组织切片中的细胞内抗原时，荧光稳定性、灵敏度显著增强。在分析不同的疾病或相同疾病的不同亚型的分子构像方面作用重大，且可将组织的形态结构同光谱的定量检测联系起来。(4)体内成像。量子点作为荧光探针可追踪活体，用于活体方面的研究。有试验将不同的量子点表面经不同的多肽修饰后，注射到小鼠的体内，对活体切片后进行分析。有试验将磷脂胶囊包覆单个量子点，注入非洲蟾蜍胚胎中，观察蟾蜍胚胎发育过程。试验将量子点聚合物注入大鼠体内，于不同的时间剖检表明，量子点在肝脏、淋巴结、骨髓中至少可以保留1个月。量子点注射24h后，对脾脏、淋巴组织进行切片，证明量子点没有蓄积在生发中心，而是集中在巨噬细胞的囊泡当中。试验用QDs作为荧光探针观察小鼠的淋巴瘤细胞成像，结果证明量子点标记物很稳定并且不会影响细胞活动和功能。(5)微生物学。有将量子点用于大肠杆菌竞争机制的研究。有将量子点用于环境微生物的检测。
现有量子点标记技术主要存在如下缺点1.用量子点标记生物大分子的方法局限于实验室研究阶段，所用的试剂较为昂贵，无法大规模推广应用。
2.采用静电作用和配位作用实现量子点与生物大分子的偶联，是一种物理吸附。外部环境变化时，量子点与生物大分子很容易脱离，标记率低。例如，缓冲液pH值变化时，即会影响至量子点与生物大分子的偶联。
3.在水相中用碳二亚胺(EDC)和Sulfo-NHS对量子点进行功能化，然后再对生物大分子进行标记的方法，不仅所的试剂昂贵，而且功能化后的量子点不能长时间保存，易降解。
4.已商品化的用链亲合素包被量子点的方法，所标记的生物大分子须经生物素化后，才能进行标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种功能化的量子点和其制备方法及用途，其解决了背景技术中标记率低，功能化后的量子点不能长时间保存，及无法大规模推广应用的技术问题。
本发明的技术解决方案是一种功能化的量子点，其特殊之处在于该功能化量子点的结构式如下 其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8…。
n＝1，2，3使较多用；n＝4，5，6使用较少，n＝6，7，8…使用更少。
一种上述功能化量子点的方法，其特殊之处在于该方法的实现步骤如下1)对稳定剂中合成的量子点进行预处理(1)在水溶液中加入稳定剂HS-(CH2)nCOOH，合成量子点，得水相合成的量子点；(2)将水相合成的量子点置于离心管中，加入丙酮，使量子点聚集；(3)离心分离，使量子点沉淀于离心管底部；(4)去掉上清，留取沉淀的量子点；(5)再加入水，使量子点微溶，得到经预处理的量子点；2)取离心管，加入有机溶剂，再加入N-羟基琥珀酰亚胺；振荡，使N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解，备用；3)另取离心管，加入有机溶剂，再加入二环己基碳二亚胺，振荡，使二环己基碳二亚胺充分溶解，备用；4)按溶质比例经预处理的量子点∶N-羟基琥珀酰亚胺∶二环己基碳二亚胺＝1∶1∶1～2，向溶解的N-羟基琥珀酰亚胺中加入经预处理的量子点，同时向液面充入氮气或惰性气体；再加入溶解的二环己基碳二亚胺，同时继续在液面上充入氮气或惰性气体；旋紧离心管盖子，振荡，得混合反应溶液；5)将混合反应溶液用避光纸包好，在振荡器上避光反应至少12小时；6)用离心管分装，置于冷冻真空浓缩仪中抽真空、干燥，得N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点；7)将装有N-羟基琥珀酰亚胺酯化量子点的离心管用避光纸包装，在2-8℃冰箱中避光保存。
上述使量子点微溶加入的水以采用高纯水为佳，也可采用双蒸水、去离子水或纯水；稳定剂为HS-(CH2)nCOOH或巯基异丙酸等。
上述有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈等。
上述量子点可以是CdS、CdTe、CdSe或ZnSe及CdSe/CdS或CdSe/ZnS等公知量子点。
上述稳定剂可采用巯基乙酸、巯基丙酸或巯基丁酸等。
上述功能化量子点的用途，其特殊之处在于N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点用于标记带氨基的生物大分子。
上述带氨基的生物大分子可为蛋白质或氨基化修饰的核酸、多糖、脂类等。
本发明具有以下优点1.N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点能长期保存，而其化学性质、物理性质不受影响。
2.N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点，具有水溶性，标记生物大分子的方法简单，标记效率高。
3.用N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点标记蛋白质、氨基化修饰的核酸、多糖、脂类等带氨基的生物大分子，稳定性好。
4.用N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点标记生物大分子后，量子点的荧光量子产率不受影响。
5.用N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点标记的生物大分子，作为核酸、蛋白质等生物大分子分析检测中使用的荧光探针，即荧光标示剂，可应用于生物芯片、分子信标等方面。通用性好。
6.生物相容性强，适合于生物分子的标记，但又不影响正常的生理功能。
图1为本发明功能化量子点的制备原理示意图。
图2为本发明功能化的量子点与牛血清白蛋白偶联的结构图。
图3为本发明功能化的量子点与牛血清白蛋白共价偶联的SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式
本发明功能化的量子点主要指N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点。本发明以HS-(CH2)nCOOH或巯基异丙酸等为稳定剂，将水溶液中合成的量子点转到有机溶剂中，在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，与N-羟基琥珀酰亚胺反应，生成活泼酯衍生物，再与带氨基的生物大分子上的氨基反应，形成以酰胺键共价连接的偶合物，通过光致发光可以检测出量子点，可用作带氨基的生物大分子分析检测中的荧光探针，即荧光标示剂，应用于生物芯片、分子信标等方面。
本发明功能化量子点的结构式如下 其中，n＝1，2，3，4，5，6…n＝1，2，3使较多用；n＝4，5，6使用已较少，n＝6，7，8…使用更少。
本发明功能化量子点被功能化的方法如下1.先对稳定剂中合成的量子点进行预处理1)在水溶液中加入稳定剂HS-(CH2)nCOOH，合成量子点，得水相合成的量子点。
2)将水相合成的量子点400μl置于离心管中，加入丙酮500μl，使量子点聚集。
3)进行离心分离，使量子点沉淀到离心管底部。
4)去掉上清，留取沉淀下来的量子点。
5)再加入高纯水50μl，使量子点微溶，得到经预处理的量子点。稳定剂可采用HS-(CH2)nCOOH，其中n＝1、2、3时分别为巯基乙酸、巯基丙酸、巯基丁酸。稳定剂还可采用巯基异丙酸。量子点可以是公知的CdS、CdTe、CdSe、ZnSe及CdSe/CdS、CdSe/ZnS等。
2.取离心管，加入有机溶剂乙酸乙酯5ml，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)10mg；振荡，使N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)充分溶解，备用。有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈等。
3.另取50ml离心管，加入有机溶剂乙酸乙酯10ml，再加入二环己基碳二亚胺(DCC)15mg，振荡，使二环己基碳二亚胺(DCC)充分溶解，备用。有机溶剂可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈等。
4.向溶解的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中加入经预处理的量子点，同时向液面充入氮气或惰性气体；再加入溶解的二环己基碳二亚胺(DCC)，同时继续在液面上充入氮气或惰性气体5分钟左右；旋紧离心管盖子，振荡，充分混合反应溶液。该反应中，
经预处理的量子点Cd2+∶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)∶二环己基碳二亚胺(DCC)＝1∶1∶1～2。
液面所充气体可防反应物被氧化，一般取成本较低且易得的氮气为宜，也可取氩气。
5.将混合的反应溶液用锡箔纸包好，在振荡器上避光反应至少12小时。
6.将15ml经避光振荡反应的混合反应溶液分为15份，用1.5ml离心管进行分装，置于冷冻真空浓缩仪中抽真空、干燥，得到N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点，即功能化的量子点。参见图1。
7.将装有N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点的离心管用锡箔纸包装，在2-8℃冰箱中避光保存。
本发明N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点用于标记带氨基的生物大分子。带氨基的生物大分子可以是蛋白质或氨基化修饰的核酸、多糖、脂类等。
图2所示是用N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点标记牛血清白蛋白BSA，得到cDNA荧光探针。
取制备好的N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点6只，向6个离心管中分别加入200μl、400μl、600μl、800μl及1000μl的牛血清白蛋白BSA溶液。向各离心管中分别加入硼砂缓冲液，使离心管中反应液体积为1ml。静置1小时，加入250μl羟氨进行封闭。进行荧光扫描检测，可以检测出量子点。
图3为本发明功能化的量子点与牛血清白蛋白BSA共价偶联的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1、8为1mg/mL BSA；泳道2、7为子点与BSA的物理吸附；泳道3、6是用不同量功能化的量子点标记BSA。
用N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点标记氨基化修饰的核酸，标记步骤是将一个化学活性核苷酸类似物，在链合成中掺入到荧光探针cDNA的第一链中，得到探针。化学活性核苷酸类似物为氨基烯丙基-dUTP或氨基己基-dATP。用N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点进行标记，采用间接cDNA荧光探针标记的方法可以产生高通量、标记均一的cDNA的标记系统，在微阵列实验中展示了较高的敏感性和重复性。
权利要求
1.一种功能化的量子点，其特征在于该功能化量子点的结构式如下 其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8…。
2.根据权利要求1所述的功能化量子点，其特征在于所述功能化量子点的结构式如下 其中，n＝1、2、3、4、5或6。
3.根据权利要求1或2所述的功能化量子点，其特征在于所述功能化量子点的结构式如下 其中，n＝1、2或3。
4.一种制备权利要求1所述功能化量子点的方法，其特征在于该方法的实现步骤如下1)对稳定剂中合成的量子点进行预处理(1)在水溶液中加入稳定剂HS-(CH2)nCOOH，合成量子点，得水相合成的量子点；(2)将水相合成的量子点置于离心管中，加入丙酮，使量子点聚集；(3)离心分离，使量子点沉淀于离心管底部；(4)去掉上清，留取沉淀的量子点；(5)再加入水，使量子点微溶，得到经预处理的量子点；2)取离心管，加入有机溶剂，再加入N-羟基琥珀酰亚胺；振荡，使N-羟基琥珀酰亚胺充分溶解，备用；3)另取离心管，加入有机溶剂，再加入二环已基碳二亚胺，振荡，使二环已基碳二亚胺充分溶解，备用；4)按比例经预处理的量子点∶N-羟基琥珀酰亚胺∶二环已基碳二亚胺＝1∶1∶1～2，向溶解的N-羟基琥珀酰亚胺中加入经预处理的量子点，同时向液面充入氮气或惰性气体；再加入溶解的二环已基碳二亚胺，同时继续在液面上充入氮气或惰性气体；旋紧离心管盖子，振荡，得混合反应溶液；5)将混合反应溶液用避光纸包好，在振荡器上避光反应至少12小时；6)用离心管分装，置于冷冻真空浓缩仪中抽真空、干燥，得N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点；7)将装有N-羟基琥珀酰亚胺酯化量子点的离心管用避光纸包装，在2-8℃冰箱中避光保存。
5.根据权利要求4所述的制备功能化量子点的方法，其特征在于所述使量子点微溶加入的水为高纯水、双蒸水或纯水；所述的稳定剂为HS-(CH2)nCOOH或巯基异丙酸。
6.根据权利要求4或5所述的制备功能化量子点的方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈。
7.根据权利要求6所述的制备功能化量子点的方法，其特征在于所述的量子点是CdS、CdTe、CdSe或ZnSe及CdSe/CdS或CdSe/ZnS。
8.根据权利要求7所述的制备功能化量子点的方法，其特征在于所述稳定剂为巯基乙酸、巯基丙酸或巯基丁酸。
9.一种权利要求1所述功能化量子点的用途，其特征在于N-羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点用于标记带氨基的生物大分子。
10.根据权利要求9所述的制备功能化量子点的方法，其特征在于所述的带氨基的生物大分子为蛋白质或氨基化修饰的核酸、多糖、脂类。
全文摘要
一种功能化的量子点，其实现步骤是对稳定剂中合成的量子点进行预处理；向溶解的N－羟基琥珀酰亚胺中加入经预处理的量子点，再加入溶解的二环己基碳二亚胺，得混合反应溶液；将混合反应溶液用避光纸包好，在振荡器上避光反应至少12小时；分装，置于冷冻真空浓缩仪中抽真空、干燥，得N－羟基琥珀酰亚胺酯化的量子点；本发明解决了背景技术中标记率低、功能化后的量子点不能长时间保存及无法大规模推广应用的技术问题。本发明功能化的量子点具有水溶性，标记生物大分子的方法简单，标记效率高；稳定性好，通用性好，能长期保存，且化学、物理性质不受影响。
文档编号G01N33/533GK1952037SQ200510096210
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者李铮, 陈超, 任挺立, 颜桦 申请人:陕西西大北美基因股份有限公司