专利名称：纳米CaCO的制作方法
技术领域：
本发明属于以无机材料纳米CaCO3为载体固定蛋白质等生物分子制备生物传感器的方法。
背景技术：
生物传感器是由固定化的生物材料(包括酶，抗体，微生物等生物活性物质)与适当的转换器件密切接触而构成的分析工具或系统。它利用的是生物活性物质的亲和性，如酶-底物，酶-辅基，抗原-抗体，激素-受体等的分子识别功能，可以有选择地测量另一方，这种敏感元件又称分子识别元件。由于生物活性物质具有专一识别功能，使得生物传感器具有较高的选择性，能直接应用于复杂样品进行检测。生物传感器以灵敏度高，选择性高，分离过程和检测技术合为一体，不需要样品制备等特点而受到广泛重视，目前发展很快，已应用于临床医学检测、工业过程控制、环境检测、化学物质安全性评价以及食品、制药等许多领域。
现有的固定酶等生物活性分子的方法主要有吸附、交联、共价键合、包埋等，固定材料有无机材料、高分子材料、各种复合材料等，这些方法和固定材料都各有其优缺点。因此寻找新的载体材料来提高生物传感器测量的准确度、灵敏度、操作稳定性、使用寿命、选择性等是科研工作者的主要目标之一。
纳米CaCO3是一种非常重要的无机材料，也是纳米材料的一种，因其具有原料易得、价格便宜成本低、优良的化学和物理性质等众多优点，而被广泛应用于橡胶、塑料、医药等工业应用中，而且纳米CaCO3表现出远胜于普通碳酸钙的特性，已经引起了广泛的研究兴趣。纳米CaCO3在工业上的广泛应用，表现出较好的补强性、优异的分散性及特殊的透明性。同时纳米CaCO3具有较好的生物相容性和很高的比表面积，这对生物分子的固定有着非常有利的条件，但至今纳米CaCO3还从来没有在生物传感器方面有过实验和应用，若将纳米CaCO3用于生物传感器的制备中可望构筑性能优良的生物活性膜和高稳定、高灵敏度的生物传感器。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好、灵敏度高的无机纳米材料纳米CaCO3固定蛋白质等生物分子制备生物传感器的新方法。
本发明的技术方案是将纳米CaCO3用二次蒸馏水配成胶体溶液，再将生物分子加入到胶体溶液中形成混合液，然后将混合液滴涂于基底电极表面，待溶剂80～95％被蒸发后，用戊二醛蒸气交联方法制备出纳米CaCO3-生物分子复合生物膜，即制得所述的生物传感器。
采用本发明方法制备出的生物传感器稳定性好、灵敏度高、重现性好，而所需的生物分子的量少。由于制作方法也较为简单，所以投入市场的可能性较大。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器，适合多种物质的检测，可广泛用于医学、食品、环境等领域，具有较高的经济效益。
本发明所采用的电极为本领域公知的各种基底电极。
上述胶体溶液的浓度为2～5mg/ml。合适的胶体浓度目的是有利于控制修饰膜厚度，使传感器具有高灵敏度和快速响应。
混合液中，生物分子与纳米CaCO3的质量比为1∶1～3∶1。合适的质量比目的是使传感器具有最高的响应。
滴涂在电极表面的生物分子和纳米CaCO3混合溶的体积为20～50μl。滴涂量过少传感器的灵敏度将降低。滴涂量过大，传感器响应时间将延长，膜的渗透性将降低。
为了使纳米CaCO3既具有较大的比表面积，同时防止其团聚，本发明选用的纳米CaCO3的粒径为5～100nm。
所述生物分子为含有可变价金属的蛋白质或酶。
酶可以为葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。
本发明所述戊二醛交联方法是将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，再放在冰箱中冷藏。
具体实施例方式
实施例一固定血红蛋白制备H2O2传感器步骤1将基底电极在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤2用二次蒸馏水配制浓度为5mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤3用0.01mol/l的磷酸缓冲溶液配制15mg/ml的血红蛋白溶液。
步骤4将胶体溶液和血红蛋白溶液等体积混合(血红蛋白与纳米CaCO3的质量比为3∶1)，轻轻摇匀，形成混合液。
步骤5在混合液中加入浓度为2mg/ml壳聚糖溶液，壳聚糖溶液与混合液体积比为1∶6。取15μl该混合溶液均匀滴涂于面积为10mm2的玻碳电极表面，在室温下干燥约3小时，测定溶剂80～95％已被蒸发，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放入4℃的冰箱中冷藏待用。
固定的血红蛋白体现了其直接电化学行为，并具有较好的可逆性。该生物电极对过氧化氢的还原具有电催化作用，可用于过氧化氢的检测。该生物传感器检测过氧化氢的下限为8.3μM；测量过氧化氢的线性范围为8.3μM～2.08mM，电极使用寿命为两个月。
实施例二制备葡萄糖氧化酶传感器步骤1将圆盘铂电极(面积为3mm2)在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤2用二次蒸馏水配制浓度为2mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤3制备浓度为2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液。
步骤4以葡萄糖氧化酶和纳米CaCO3的质量比为2∶1混合，形成混合液。
步骤5取45μl该混合液均匀滴涂于圆盘铂电极表面，待溶剂约90％被蒸发后，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放在冰箱中冷藏，即形成了基于纳米CaCO3-葡萄糖氧化酶复合物生物膜的葡萄糖传感器。
该生物传感器对葡萄糖溶液的响应时间小于6秒；测量葡萄糖溶液的线性范围为1μM～12mM；使用寿命为四个多月；检测下限为0.1μM；电极制备的重现性好(7支酶电极同时制备，用于同一测量的相对标准偏差为5.56％)；传感器具有较高的操作稳定性，传感器在1mM葡萄糖溶液中连续测量140次后，响应电流基本保持不变，相对标准偏差(RSD)仅为3.0％。
实施例三制备多酚氧化酶传感器步骤1用二次蒸馏水配制2mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤2制备浓度为4mg/ml的多酚氧化酶溶液。
步骤3将圆盘玻碳电极(面积为7mm2)在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤4以多酚氧化酶和纳米CaCO3的质量比为1∶1混合，形成混合液。
步骤5取20μl混合液均匀滴涂于圆盘玻碳电极表面，待溶剂约85％被蒸发后，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放在冰箱中冷藏，即形成了基于纳米CaCO3-多酚氧化酶复合物生物膜的酚传感器。
该生物传感器可测定儿茶酚、苯酚等物质，生物传感器对儿茶酚溶液的响应时间为8秒；测量儿茶酚溶液的线性范围为6～20000nM；使用寿命为两个多月；检测下限为0.6nM。电极制备的重现性好(7支酶电极同时制备，用于同一测量的相对标准偏差为5.63％)；传感器具有好的操作稳定性，传感器在5μM儿茶酚溶液中连续测量44次后，响应电流基本保持不变。
实施例四制备黄嘌呤氧化酶传感器步骤1用二次蒸馏水配制2mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤2制备浓度为4mg/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。
步骤3将圆盘铂电极(面积为20mm2)在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤4以黄嘌呤氧化酶和纳米CaCO3的质量比为1∶1混合，形成混合液。
步骤5取50μl混合液均匀滴涂于圆盘铂电极表面，待溶剂约90％被蒸发后，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放在冰箱中冷藏，即形成了基于纳米CaCO3-黄嘌呤氧化酶复合物生物膜的黄嘌呤氧化酶传感器。
该生物传感器可测定黄嘌呤、次黄嘌呤等物质，生物传感器对黄嘌呤溶液的响应时间为6秒；测量黄嘌呤溶液的线性范围为1～200μM；使用寿命为一个多月；检测下限为0.1μM。电极制备的重现性好(9支酶电极同时制备，用于同一测量的相对标准偏差为3.38％)；传感器具有较好的操作稳定性，传感器在200μM黄嘌呤溶液中连续测量70次后，响应电流基本保持不变。
采用类同的方法，可分别制备成酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶传感器，用于相应底物的测定。
权利要求
1.纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于将纳米CaCO3用二次蒸馏水配成胶体溶液，再将生物分子溶液加入到胶体溶液中形成混合液，然后将混合液滴涂于基底电极表面，待溶剂80～95％被蒸发后，用戊二醛蒸气交联方法制备生物传感器。
2.根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于胶体溶液的浓度为2～5mg/ml。
3.根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于生物分子与纳米CaCO3的质量比为1∶1～3∶1。
4.根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于滴涂在电极表面的生物分子和纳米CaCO3混合液的体积为20～50μl。
5.根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于所述纳米CaCO3的粒径为5～100nm。
6.根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于所述生物分子为含有可变价金属的蛋白质或酶。
7.根据权利要求7所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于所述酶为葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。
8.根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于所述戊二醛交联方法是将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，再放在冰箱中冷藏。
全文摘要
纳米CaCO
文档编号G01N27/30GK1945327SQ200610096189
公开日2007年4月11日 申请日期2006年9月25日 优先权日2006年9月25日
发明者薛怀国, 朱明娟, 单丹, 王善霞 申请人:扬州大学