专利名称：一种含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的酶联免疫吸附检测方法
一种含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的酶联免疫吸附检测方法 技术领域一种含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的酶联免疫吸附检测方法，具体地说，涉及一种适用于含氰基拟除虫菊酯(a-Cyano-Pyrethroid)农药多残留分析的酶联免疫吸附检测方法，属于免疫分析技术领域。
背景技术：
拟除虫菊酯(Pyrethroid)是一类在天然除虫菊酯化学结构研究基础上发展 而来的仿生药物。天然除虫菊的应用已有悠久的历史，由于其具有击倒力强， 杀虫作用快，广谱性，易降解，对高等动物及鸟类低毒性，使用安全，对环境 污染小等特点，被广泛用于茶园、果园、农田等害虫的防治，尤其含氰基拟除 虫菊酯(a-Cyano-Pyrethroid)应用更为广泛。随着国际标准的提高，我国贸易 的国际化，绿色壁垒森严，我国农副产品特别是纺织品、茶叶、水果中的农药 残留问题成为出口贸易的主要障碍，要求开发应用快速残留检测技术来加强产 地农副产品中多种农药残留的监控。而传统的农药残留分析主要依靠气相色谱、 液相色谱、气质联用、液质联用等，这些方法需要有昂贵的仪器，而且需要经 过繁琐的前处理，很难达到快速简便的现场检测要求。因此，有必要研究更有 效快捷的检测方法，即适用于含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的酶联免疫吸 附检测方法。 发明内容(一) 要解决的技术问题本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确 度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于含氰基拟除虫菊酯农药多残 留的批量、快速检测。(二) 技术方案为实现上述目的，本发明建立了一种含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的 酶联免疫吸附检测方法，该方法包括对检测方法的优化。(1) 抗原的包被用半抗原间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯与卵清蛋白OVA的偶联复合物作为包 被抗原，以0.05M、 pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释包被抗原1:100 1:200，浓度为 4 8pg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100pL包被液，4'C孵育过夜， 用含2 % OVA的上述碳酸钠缓冲液作为封闭液封闭；(2) 竞争反应将免疫制备的间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗体用抗体稀释液含 1%明胶、含0.5%吐温-20、 pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1:100 1:200 比例稀释后，加入酶标板中，每孔加5(HiL;同时每孔分别加入用标准品稀 释液稀释的0ng/mL， 0.1ng/mL， 1.0ng/mL， 10ng/mL， 100ng/mL， 1000ng/mL， 10000 ng/mL， 100000 ng/mL—系列浓度之一的含氰基拟除虫菊酯农药标准品， 每孔加50pL， 37"C孵育lh后以PBST洗涤液洗涤3 5次；(3) 加酶标二抗加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液稀释为1:5000， 每孔加100nL, 37。C温育lh后以PBST洗涤液洗涤3~5次；(4) 显色每孔加入100 显色液，暗处37i:反应15 min，取出后每孔加入100 ^L、 2mol/L的硫酸终止液，用酶标仪测定吸光值A450，与所作的标准曲线对比算出 待测含氰基拟除虫菊酯的浓度。标准品稀释液的配方为在体积含量30。/。甲醇的pH-6.5的PBS中加入质量比 为5%的氯化钠。PBST洗涤液的配方为1000 mL蒸馏水中加入氯化钠4 6 g、磷酸二氢钾 0.1 0.3g、磷酸氢二钠2 4g、氯化钾3 6g、吐温-20 0.5 3mL。显色液包括A液和B液，A液配方为每100 mL水中加入0.933 g柠檬酸， 3.68gNa2HP04'12H20， 18 nL30%H2O2; B液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于 100 mL乙二醇；使用时按A : B=l : 1的比例使用。含氰基拟除虫菊酯多克隆抗体是用间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯与牛血清白 蛋白(BSA)的偶联复合物免疫新西兰大白兔制备。本发明方法的检测分析原理是酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测含氰基拟除虫菊酯样 品和间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗体后，固相包被抗原和待测含氰基拟 除虫菊酯相互竞争与抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均 一致，所以当待测样品的含氰基拟除虫菊酯浓度高时，则被结合在固相抗原上 的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物 液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低， 表明抑制率高；反之，当待测样品的含氰基拟除虫菊酯浓度低时，则所测的OD 值高，抑制率低。根据所作的标准曲线，可以推算出待测含氰基拟除虫菊酯的 浓度。(三)有益效果本发明提供的含氰基拟除虫菊酯多残留检检测方法采用了间苯氧基苯甲氰 醇丁二酸酯多克隆抗体，能准确灵敏地检测待测样品中含氰基拟除虫菊酯类农药残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，而且本发明方法稳定性好，无放射性污染。本发明对解决大批量样品的含氰基拟除虫菊酯残留现场监控技术具有重要的现实意义。
图1间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯的标准抑制曲线。
具体实施方式
实施例l:检测方法的操作及结果计算(1) 抗原的包被用半抗原间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯与卵清蛋白(OVA)的偶联复合物作为包被抗原，以0.05M、 pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释包被抗原1:100 1:200，浓度 为4~8ng/ml作为包被液，在酶标板的每孔中加入100|iL包被液，4'C孵育过夜， 用含2 % OVA的上述碳酸钠缓冲液作为封闭液封闭；(2) 竞争反应将免疫制备的间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗体用抗体稀释液(含 1%明胶、含0.5%吐温-20、 pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液PBST)按1:100 1:200 比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50hL，同时分别加入一系列浓度0 ng/mL， 0.1ng/mL， 1.0ng/mL， 10ng/mL， 100ng/mL， 1000ng/mL， 10000 ng/mL， 100000 ng/mL的含氰基拟除虫菊酯农药标准品，每孔50(iL， 37。C孵育lh后 以PBST洗涤液洗涤3~5次；(3) 加酶标二抗加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，以抗体稀释液稀释为 1:5000，每孔加100^iL， 37。C温育lh后以PBST洗涤液洗涤3~5次;(4) 显色每孔加入100 显色液，暗处37 。C反应15 min，取出后每孔加入100 终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。将含0 ng/mL标准品孔的OD值减去含最大浓度100000 ng/mL标准品孔的 OD值定为Bo，其余各孔经同样方法校正后的OD值(0 ng/mL标准品孔的OD 值减去各孔测定的OD值)定为B;以B/B。值为纵坐标，相应标准品浓度为 横坐标，绘制间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯标准抑制曲线。根据曲线的回归方程 可以求出对应样品的浓度，也可以求出间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯IC5o(B/Bo-50 %)及最小检测限IC9o(B/Bo=90%)。 IC5Q为70.12 ng/mL， LOD (90%抑制率对应 的浓度)为4.31ng/mL，线性范围(20% 80%)抑制率对应的浓度为5~1000 ng/mL。实施例2:检测方法的特异性实验选择含氰基拟除虫菊酯作为待测物，测得各种物质的抑制中浓度(IC5。)，再用下式计算抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈大，则抗体对含氰基 拟除虫菊酯的亲和性愈强，反之则抗体的亲和性差。交叉反应率(CR^)气iC5。(间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯yiC5C)(:含氰基拟除虫菊酯)]><100%。实验测定结果见表l，采用间接ELISA法，含间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯 多克隆抗体对含氰基拟除虫菊酯的中间体衍生物间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯， 和8种含氰基拟除虫菊酯都具有交叉反应。但对不含氰基拟除虫菊酯如氯菊酯 等交叉反应率均在0.1%以下。总的来说，对含氰基拟除虫菊酯农药具有一定的 群选择性。表1交叉反应_反应物质_交叉反应率(％)间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯氟胺氰菊酯 94.5氯氟氰菊酯 82甲氰菊酯 74氟氯氰菊酯 54.4苯醚氰菊酯 42.3氰戊菊酯 27.1溴氰菊酯 24.5氟氰戊菊酯 17.8氯菊酯 <0.1生物丙烯菊酯 <0.1苯醚菊酯 <0.1胺菊酯 <0.1_咔呋菊酯_<0.1实施例3 :添加回收实验:(1) 样品的添加:5.0ng/g、 10,0ng/g、 50.0ng/g、 100.0ng/g的水平加入含 氰基拟除虫菊酯样品到剪碎的棉花中，在室温下至少静置15min。(2) 样品的提取净化分别取lg已经添加不同浓度标准品的棉花样品， 于50mL离心管中。再加入30mL含饱和乙腈的乙酸乙酯，超声提取30分钟， 用玻璃注射器挤压出提取液，重复三次后合并提取液，氮气吹干，加入lmL的 标准品稀释液，作为试样供分析。各浓度分别制备样品五份，测定其含量，将 实测浓度与添加浓度进行比较。回收率的计算根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根 据相应的抑制率从标准曲线上査到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。结果见表2，可以看出，含氰基拟除虫菊酯在棉花中的回收率在61.32% 80.20%之间。该分析方法重复性良好，相对标准偏差低于3.30%。表2添加回收率的测定添加浓度(ng/g)实观'J浓度(ng/g)回收率(％)5.03.133.082.89 2.973.2661.32±3.3010.06.726.196.47 6.746.3064.84±2.4650.034.836.135.7 37.335.771.84±1.81100.081.379.878.5 77.183.480.20±2.4权利要求
1.一种含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于(1)抗原的包被用半抗原间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯与卵清蛋白OVA的偶联复合物作为包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释包被抗原1∶100～1∶200，浓度为4～8μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL包被液，4℃孵育过夜，用含2％OVA的上述碳酸钠缓冲液作为封闭液封闭；(2)竞争反应将免疫制备的间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗体用抗体稀释液含1％明胶、含0.5％吐温-20、pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1∶100～1∶200比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL；同时每孔分别加入用标准品稀释液稀释的0ng/mL，0.1ng/mL，1.0ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10000ng/mL，100000ng/mL一系列浓度之一的含氰基拟除虫菊酯农药标准品，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(3)加酶标二抗加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液稀释为1∶5000，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(4)显色每孔加入100μL显色液，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸终止液，用酶标仪测定吸光值A450，与所作的标准曲线对比算出待测样品的含氰基拟除虫菊酯浓度。
2. 根据权利要求1所述的酶联免疫吸附检测方法，其特征是标准品稀释液 的配方为在体积含量30。/。甲醇的p1^6.5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠。
3. 根据权利要求1所述的酶联免疫吸附检测方法，其特征是PBST洗涤液 的配方为1000 mL蒸馏水中加入氯化钠4~6 g、磷酸二氢钾0.1 0.3 g、磷酸氢二 钠2 4g、氯化钾3 6g、吐温-20 0.5 3mL。
4. 根据权利要求1所述的酶联免疫吸附检测方法，其特征是显色液包括A 液和B液，A液配方为每100 mL水中加入0.933 g柠檬酸，3.68 g Na2HP04'12H20， 18 pL30%H2O2; B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100 mL 乙二醇；使用时按A : B=l : 1的比例使用。
全文摘要
一种含氰基拟除虫菊酯农药多残留分析的酶联免疫吸附检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明用半抗原间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯与卵清蛋白偶联复合物作包被抗原，加入待测含氰基拟除虫菊酯样品和间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗体后，包被抗原和待测含氰基拟除虫菊酯竞争与抗体反应，加入酶标二抗与被固定抗体结合，用洗涤液洗涤后加入显色液，用酶标仪检测OD值，与含氰基拟除虫菊酯标准品所作标准曲线对比，算出待测样品的含氰基拟除虫菊酯浓度。本发明能准确灵敏地检测待测样品中含氰基拟除虫菊酯类农药残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，而且本发明方法稳定性好，无放射性污染。
文档编号G01N21/77GK101334408SQ20081002122
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月22日 优先权日2008年7月22日
发明者李雅丽, 殷祥刚, 胥传来, 媛 袁, 郝晓蕾 申请人:江南大学