专利名称：葡萄球菌蛋白a活性比较试剂盒及活性比较方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种比较葡萄球菌蛋白A 活性的ELISA试剂盒，以及一种葡萄球菌蛋白A的活性比较方法。
背景技术：
葡萄球菌蛋白A的发现从一开始就与IgG (免疫球蛋白G)相关联，早在 1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种在双向扩散试验中能 与正常人血清形成沉淀的物质。Jensen (1959)也发现类似现象，并将其命名为 A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与 糖相区别，Grov (1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称葡萄球菌蛋白A或 葡萄球菌蛋白A。 1978年，有研究者将加热灭活并经福尔马林固定的金黄色葡 萄球菌用于一种癌症的治疗，显示出一定的疗效，这是世界上第一次利用葡萄球 菌蛋白A的抗体吸附性治疗相关疾病的报道。UWen等在1984年阐明了葡萄球 菌蛋白A的全基因序列和相应的氨基酸序列。2003年，L.Yang等应用表面张力 探针证明每个葡萄球菌蛋白A分子可结合两个IgG分子。葡萄球菌蛋白A的基因编码序列由1464个碱基组成(若加上氨基端信号肽 序列则为1572个碱基)，共编码488个氨基酸，分子量约42KD。整个葡萄球菌 蛋白A分子包含六个结构域E、 D、 A、 B、 C和X (从氨基端至羧基端)，其 中，E、 D、 A、 B、 C这五个结构域均具备结合IgG的能力。X结构域的作用是 将葡萄球菌蛋白A嵌合入金黄色葡萄球菌的细胞壁。葡萄球菌蛋白A可与人类和哺乳动物血清中的免疫球蛋白分子Fc段结合， 特别是IgG和含IgG的免疫复合物，这是一种非免疫反应性结合，具有高度的 亲和力。葡萄球菌蛋白A的应用主要基于其抗体结合能力。将葡萄球菌蛋白A 通过化学方法交联至各种支架结构上，如与琼脂糖凝胶共价耦合，能耐受温度、 pH变化和变性剂的作用而不脱失。这种由葡萄球菌蛋白A和琼脂糖凝胶合成的填料可用于抗体的分离纯化。随着免疫吸附血液净化治疗技术的快速发展，这种 合成填料逐渐被应用于自身免疫疾病、恶性肿瘤、移植排斥等疾病的治疗，当患 者血浆通过时，基质中葡萄球菌蛋白A可与血浆中致病性抗体，特别是IgG型 抗体结合，这是一种可逆性、pH敏感的结合，将pH降至2.3 2.5时，葡萄球 菌蛋白A与所结合抗体解离，抗体被洗脱清除，将pH恢复至7.0时，葡萄球菌 蛋白A又恢复吸附能力，这样可不断重复循环吸附致病性抗体，从而达到治疗 疾病的目的，这种免疫吸附的方法称为葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Protein A Immunoadsorption ， PAIA)。由于金黄色葡萄球菌是致病菌，且葡萄球菌蛋白A在该菌体的含量并不高(约占细胞壁蛋白成分的6.7%)，因此，从发酵培养的金黄色葡萄球菌中提纯葡 萄球菌蛋白A的方法风险较大且难以满足大规模生产的需要。近年来，人们开 始转向采用基因工程法来生产葡萄球菌蛋白A，寻求既能避免致病菌的危险，又 能大规模生产葡萄球菌蛋白A的可行而有效的途径。由于利用基因工程的方法 可制备出不同结构的重组葡萄球菌蛋白A，它们与IgG结合的活性也不同，因此， 比较不同葡萄球菌蛋白A的活性，从而选择具有高活性的重组葡萄球菌蛋白A， 并确保作为原料的葡萄球菌蛋白A符合活性质量要求，对高性能的免疫吸附血 液净化治疗产品的生产至关重要。本发明利用ELISA技术建立了比较葡萄球菌蛋白A活性的试剂盒，该试剂 盒将待比较活性的葡萄球菌蛋白A样品包被于ELISA板，再使人IgG与葡萄球 菌蛋白A结合，由于在相同用量的条件下，葡萄球菌蛋白A的活性越强，与之 结合的人IgG越多，与HRP标记的二抗结合并经显色反应后，颜色的深浅程度(以A45。表示)与葡萄球菌蛋白A的活性成正比，这样即可以比较不同葡萄球 菌蛋白A的活性大小。另外，在一定范围内根据葡萄球菌蛋白A的不同浓度的 及相应的A450值作一曲线，则该曲线的斜率可以相对的表示该葡萄球菌蛋白A 活性的大小，这样即可以将活性差异定量化。本发明的葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒适用于比较不同结构葡萄球菌蛋 白A的活性并能将活性差异定量化，操作简便快捷，结果可信度高。发明内容本发明的目的是提供一种葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒，该试剂盒性能 稳定，检测准确，使用方便。本发明所述的一种葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒，包括人IgG，辣根 过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG，包被缓冲液，封闭液，样品稀释液，洗 涤液，四甲基联苯胺(TMB)显色液和终止液。本发明的另一个目的是提供一种葡萄球菌蛋白A的活性比较方法。该方法包括以下步骤1) 包被葡萄球菌蛋白A:用包被缓冲液将待比较的葡萄球菌蛋白A样品稀释至合适浓度，在ELISA板中每孔加入100pL， 37'C60min;根据一般情况下ELISA板的每个板孔能吸附的蛋白量，并保证葡萄球菌蛋 白A的用量与显色的深浅程度(A450)成正比关系，经实验确定，葡萄球菌蛋白 A的合适浓度为0~100ng/mL。2) 封闭甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入封闭液，200pL/孔， 37°C 2hr;3) 加人IgG:甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好的人IgG， 100pL/孔，37。C 60min;由于人IgG的用量必须使其与葡萄球菌蛋白A的结合达到饱和或过量，人 IgG的工作浓度为20吗/mL。4) 加酶标羊抗人IgG:甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好 的HRP标记的羊抗人IgG， 10(^L/孔，37。C60min;5) 加底物显色甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入TMB底物， 100nL/孔，37。C孵育15-30min;6) 读数加入终止液终止反应，在酶标仪上测定OD450值。本发明利用葡萄球菌蛋白A与IgG结合的特性，采用间接ELISA方法建立 了一种有效的比较不同葡萄球菌蛋白A与IgG结合活性的试剂盒。所述试剂盒 可适用于不同来源的葡萄球菌蛋白A活性差异的比较，具有快速性、客观性和 准确性等优点。本发明的有益效果在于本发明提供了不同葡萄球菌蛋白A活性的比较方 法。目前比较不同结构或来源的葡萄球菌蛋白A活性多采用将葡萄球菌蛋白A5偶联于琼脂载体上制成吸附柱，测其吸附IgG的含量，此法步骤繁琐、技术复杂、 耗时长，而本发明利用ELISA方法比较不同葡萄球菌蛋白A的活性，简便快捷，准确性高。
图1是本发明的原理示意图。图中1.酶联反应板，2.包被葡萄球菌蛋白 A， 3.人IgG， 4. HRP标记羊抗人IgG。图2是利用本发明的试剂盒比较不同葡萄球菌蛋白A与IgG结合活性差异 的结果图。
具体实施方式
以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发 明的保护范围。实施例一葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒的制备本发明所述的一种葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒，如图1所示，包括人IgG,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG，包被缓冲液，封闭液，样 品稀释液，洗涤液，四甲基联苯胺(TMB)显色液和终止液。 1 ) 制备人IgG:用本发明申请人制备的葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶吸附填料 从人血浆中分离纯化人IgG，纯度在90%以上。2) HRP标记的羊抗人IgG和TMB显色液，购自武汉博士德生物工程有限 公司。3) 制备以下溶液包被缓冲液35mmol/LNaHC03， 15mmol/L Na2C03， pH 9.6 封闭液lxPBS， 1%BSA样品稀释液lxPBS， 0.1%BSA， 0.05%Tween-20， pH 7.2±0.2 洗涤液lxPBS， 0.05% Tween-20 终止液2mol/LH2S04葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒由上述试剂组成。实施例二利用本发明的试剂盒比较不同葡萄球菌蛋白A与IgG结合活性的差 异1) 用包被缓冲液将待比较的葡萄球菌蛋白A配成浓度依次为50ng/mL， 25ng/mL， 12.5ng/mL， 6.25ng/mL， 3.125ng/mL的溶液。2) 各取上述溶液1004L加入96孔板，阴性对照以包被缓冲液代替样品， 空白对照除底物外，其余反应成分均不加入，每个浓度做2个重复。置于37QC lh。3) 甩掉板孔中溶液，每孔加入洗涤液200pL，振荡3min，甩干，重复 洗漆4次，最后一次彻底甩干液体。4) 每孔加入封闭液lOO(aL，置于37Gcih。5) 洗涤，步骤同3)。6) 每孔加入人IgG溶液(用样品稀释液配至20pg/mL) 100pL，置于 370C lh。7) 洗涤，步骤同3)。8) 每孔加入羊抗人IgG-HRP溶液(稀释20000倍)10(VL，置于3,C lh。9) 洗涤，步骤同3)。10) 每孔加入TMB显色液100pL，置于37QC15min。11) 每孔加入终止液(2mol/LH2S04) lOOpL，终止反应。12) 于酶标仪中测定A450。本发明人通过基因工程法制备了不同的重组葡萄球菌蛋白A: SPA-B3、 SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6，其所包含的IgG结合结构域依次增加。基于分子结 构和功能关系的分析，预期上述葡萄球菌蛋白A的活性依次增强，且SPA-B4的 活性略低于天然葡萄球菌蛋白A (SigmaSPA，美国Sigma公司)，SPA-B5的活 性与天然葡萄球菌蛋白A相当，SPA-B6的活性则高于天然葡萄球菌蛋白A。利 用本发明的试剂盒对上述不同葡萄球菌蛋白A的活性比较结果(图2)显示1) 仅从图2中各曲线的发展趋势(即不同葡萄球菌蛋白A的A450随浓度增 加而上升的趋势)就可以看出，活性比较结果符合预期。2) 通过计算，各曲线的斜率依次为0.0244 (SPA-B3)、 0.0291 (SPA-B4)、 0,0316 (SPA-B5)、 0.0325 (SigmaSPA)、 0.0366 (SPA-B6)，以SPA-B3的活性为1，则SPA-B4、SPA-B5、SigmaSPA、SPA-B6的活性依次为1.193、 1.295、 1.332禾卩1.5。可以看出，SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6的活性分别 比SPA-B3高19.3%、 29.5%、 50%; SPA-B4的活性比SigmaSPA低10.5%， SPA-B5的活性仅比SigmaSPA低2.77%， SPA-B6的活性则比SigmaSPA 高12.6%。以上结果也符合预期。 3) 分别将SPA-B3、 SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6通过化学方法与琼脂糖凝胶 交联，合成葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶吸附填料，并进行抗体吸附试验， 结果显示，每毫升填料的抗体吸附量依次约为20mg (SPA-B3)、 24mg (SPA-B4)、27mg(SPA-B5)、30mg(SPA-B6)，据此计算，SPA-B4、 SPA-B5、 SPA-B6的活性分别比SPA-B3高20%、 35%、 50%，此结果很好地验证了 利用本发明的试剂盒对上述不同葡萄球菌蛋白A的活性比较结果的正确 性。
权利要求
1.一种葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒，包括人IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，包被缓冲液，封闭液，样品稀释液，洗涤液，四甲基联苯胺显色液和终止液。
2. —种葡萄球菌蛋白A的活性比较方法，包括以下步骤1) 包被葡萄球菌蛋白A:用包被缓冲液将待比较的葡萄球菌蛋白A样品稀释至合适浓度0~100ng/mL，在ELISA板中每孔加入100pL， 37°C 60min;2) 封闭甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入封闭液，200pL/孔， 37。C 2hr;3) 加人IgG:甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入稀释好的人IgG， 人IgG的工作浓度为20|xg/mL， 100nL/孔，37°C 60min;4) 加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG:甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍 干，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG， 100pL/孔，37°C 60min;5) 加底物显色甩去液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，加入四甲基联苯胺底 物，100pL/孔，37。C孵育15-30min;6) 读数加入终止液终止反应，在酶标仪上测定OD45Q值。
全文摘要
本发明提供了一种葡萄球菌蛋白A活性比较试剂盒，主要包括人IgG，HRP标记的羊抗人IgG，包被缓冲液，封闭液，样品稀释液等。该试剂盒利用葡萄球菌蛋白A与IgG结合的特性，采用间接ELISA的方法比较不同葡萄球菌蛋白A结合IgG的活性。本发明的葡萄球菌蛋白A活性检测试剂盒适用于不同来源或结构的葡萄球菌蛋白A活性差异的比较，并能将差异定量化，具有快速性、客观性和准确性等优点，并为高性能的免疫吸附血液净化治疗产品的生产提供保证。
文档编号G01N33/543GK101329351SQ20081002999
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月30日 优先权日2008年7月30日
发明者余波光, 张旭锋, 杨东升, 苗 赵, 陈校园 申请人:广州康盛生物科技有限公司