专利名称：：蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法
技术领域：
：本发明涉及蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，具体涉及蜂蜜或蜂王浆等蜂产品中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、e-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三唑醇等ii大类农兽药残留的同时检测方法。
背景技术：
：目前兽药残留检测仍然是国内外设立技术壁垒的主要手段，蜂产品、水产品等是我国重要的动物源性出口创汇产品，是欧盟等发达国家关注的重点。目前，国内外有关多残留分析研究主要是农药残留。农药多为非水溶性的非极性和弱极性化合物，前处理过程有一定的相似性。国内外都有相关的超过百种的农药多残留检测报道。而对于动物源性产品中药物残留检测的方法，主要还是以按类分别分析的方式研发。以蜂蜜为例，国内外有关蜂蜜中各种药物残留检测的国标就有近20种之多，也有许多的文献报道蜂产品中各种药物残留检测的方法，但对于不同类抗生素药物很少放在一起进行研究。这是国为各种不同用途的兽用抗生素，其化学分子结构相差较大，性质差异也较大，进行多残留同时分析有一定的难度。目前国内的兽药多残留检测，多为同类药物的多残留检测，不同种类的兽药多残留检测一次前处理测定的不多。目前，企业在出口蜂产品、水产品等动物源性产品时，需要进行大量的检测监控，以蜂蜜为例，一个企业完成全套的药物残留的检测需要支付万元以上的费用，抗生素的检测成为出口企业的负担之一。
发明内容本发明的目的是提供一种方便可靠、选择性好、灵敏度高的蜂产品中多类农兽药残留具体是磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、e-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三唑醇等11大类药物残留的同时检测方法，以简化蜂产品中的各类兽药残留的检测程序。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。一种蜂产品中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、e-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三等丄1大类药物残留的检测方法，包括一下步骤(1)蜂产品样品中加入提取液A和B混合均匀，提取农兽药残留；所说的A为1.0-10%重量浓度的三氯乙酸或高氯酸，所说的B为0.05-1.0mol/L浓度的醋酸盐、磷酸盐或硼酸盐溶液，控制pH值4.5-9.0;提取液A、B的加入量分别为样品重量的O.2-IO倍；(2)将步骤(1)的混合物离心过滤，收集滤液；(3)滤液加入固相萃取柱中萃取，洗脱，弃去流出液，萃取柱吹干，然后用2g/L草酸-甲醇溶液洗柱，洗脱液用甲醇水溶液定容；(4)将定容样品溶液用液相色谱-串联质谱进行分析测试，测得样品的色谱峰；(5)将测得的色谱峰与各已知药物的标准色谱峰对照，准定所检出药物的具体名称。上述步骤(3)所说固相萃取柱优选为HLB(500mg，6mL)或C18(lg，6mL)。上述步骤(3)的定容样品在分析测试前过平均孔径为0.45txm的滤膜，除去微细杂质。由于蜂蜜或王浆等蜂产品中含有大量的糖、蛋白和其它有机物等杂质，干扰较多，本发明采用强酸作为蛋白变性试剂，通过加入缓冲盐溶液控制pH值。所控制的pH值满足多种药物在固相萃取柱上的保留条件，从而使多种药物残留可同时一次提取。本方法只需对品样进行一次前处理，即可提取磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、e-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三唑醇等11大类60多种兽药的药物残留，然后通过液相色谱-电喷雾串联质谱法进行正离子同时检测和负离子检测，或正负离子同时检测，通过测得的样品中的色谱峰与各药物已知的标准色谱峰对照，准定所检出药物的具体名称。综上所述，本方法快速、简单，选择性好，灵敏度高，测定低限能满足目前世界各国对蜂产品中药物残留的要求，采用内标法定量，解决了蜂产品中部分兽药的基质效应问题，定量准确。样品溶液经液相色谱串联质谱多反应监测选择离子分析，经内标校正后，回收率在60%-120%，相对标准偏差RSD《15%。与现有的分类检测方法相比，分析效率提高至少5倍，检测成本约为原来的10%。具体实施例方式实施例l蜂蜜样品的农兽药残留检测准确称取蜂蜜样品5.00g(±0.05g)于50mL离心管中，加入10mL为2%浓度的三氯乙酸溶液，涡旋混匀后，再加入0.5mol/L醋酸钠溶'液5mL，控制溶液的pH值4.5;离心过滤后，加入经5ml甲醇和5iiiL水活化的HLB固相萃取柱中，流速控制在1-2cl/s，流完后，用5mL水洗离心管和贮液管并过柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用0.2%草酸-甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL试管中，于45。C用氮气吹干仪吹干吹干萃取柱，用30%甲醇溶液定容至1.0mL，过平均孔径为0.45um的滤膜，收集滤液入进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。药物标准工作溶液在表1和表2设定的液相色谱-质谱条件下分别进样，以样品峰面积与内标面积比值为纵坐标，工作溶液浓度(ng/mL)为横坐标，绘制出6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，样品中是否存在某种药物，需满足如下条件该样品出现的色谱峰的保留时间与标准药物保留时间相差不超过土2.5%，该色谱峰所对应的药物在表3中的质谱定性离子的丰度比与标准溶液中药物的离子丰度比相匹配，则确定为样品中含有该药物。表3为各种药物的母离子、子离子和碰撞能量。在表1和表2设定的色谱条件下，阴性样品添加标加标实验的回收率范围见表4。实施例2王浆样品的农兽药残留检测准确称取蜂王桨2.00g±0.05g或干粉1.00g于50mL离心管中，加入4%浓度的高氯酸溶液10mL,涡旋混匀后，再加入0.5mol/L的磷酸钠溶液5mL，控制pH值7.4;离心过滤后，加入经5ml甲醇和5mL水活化的C18固相萃取柱，流速控制在l-2d/s，流完后，用5mL水洗涤离心管和贮液管并过柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用2g/L的草酸-甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL试管中，于45'C下，用氮气吹干仪吹干吹干萃取柱，用是3(^甲醇溶液定容至1.0mL，过平均孔径为0.45um的滤膜，收集滤液到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。阴性样品添加标回收的回收率检测结果如表4。药物标准工作溶液的液相色谱-串联质谱典型条件见表1和表2。表1质谱正离子模式下的仪器条件参数<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3定性离子和定量离子的选择<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，其特征是包括一下步骤(1)蜂产品样品中加入样品提取液A和B混合均匀，所说的A为1.0-10％重量浓度的三氯乙酸或高氯酸，所说的B为0.05-1.0mol/L的醋酸盐、磷酸盐或硼酸盐溶液，控制pH值4.5-9.0；提取液A、B的加入量分别为样品重量的0.2-10倍；(2)将步骤(1)的混合物离心过滤，收集滤液；(3)滤液加入固相萃取柱中萃取，洗脱，弃去流出液，萃取柱吹干，然后用2g/L草酸-甲醇溶液洗柱，洗脱液用甲醇水溶液定容；(4)将定容样品溶液用液相色谱-串联质谱进行分析测试，测得样品的色谱峰；(5)将测得的色谱峰与各已知药物的标准色谱峰对照，根据保留时间和质谱离子的丰度确定所检出药物的具体名称。2.根据权利要求l所述的蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，其特征是步骤(3)所说固相萃取柱优选为HLB或C18。3.根据权利要求1或2所述的蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，其特征是步骤(3)的定容样品在分析测试前过平均孔径为0.45um的滤膜，除去微细杂质。全文摘要本发明涉及蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法，样品加入提取液三氯乙酸或高氯酸和提取液醋酸盐、磷酸盐或硼酸盐溶液，控制pH值4.5-9.0；离心，滤液入固相萃取柱中萃取，洗脱并吹干萃取柱，用草酸-甲醇溶液洗柱，洗脱液用甲醇水溶液定容，入液相色谱-串联质谱分析测试，所得的色谱峰与各已知药物的标准色谱峰对照，根据保留时间和质谱离子的丰度确定所检出药物的具体名称。本方法只需对品样进行一次前处理，即可同时提取磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类、磺胺增效剂类、杀虫脒，三唑醇等11大类60多种兽药的药物残留，分析效率高，检测成本大降低。文档编号G01N30/00GK101358953SQ20081019588公开日2009年2月4日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者涛丁,斌吴,张晓燕,涛彭,徐锦忠,宏林,沈崇钰,原蒋,陈惠兰,陶宏锦申请人:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局