专利名称：一种乳腺癌检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及乳腺癌检测技术。
背景技术：
乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤，全世界每年有四十多万妇女死于乳腺癌起因的疾病，在我国乳腺癌发病率已从五年前十万分之十七增加到2006年的十万分之五十，以每年3% -4%的速度急剧增长，目前约有接近50万患者。乳腺癌发生和转移受环境和遗传因素二者共同作用，复杂的发病机制是长期困扰医学界的一大难题。因此，发现预测和早期诊断乳腺癌发生转移的特异标记物是防治这类重大疾病的关键所在。目前，对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有以下三种。1)临床体格检查定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。始于1963年纽约的健康保险计划(HIP)，历经18年研究发现，接受定期临床体格检查的妇女乳腺癌死亡率比对照组低 23%。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作，但是，由于乳腺癌普查耗资巨大，成本/效果比高，因此，我国乳腺癌早期发现主要着眼于自我检查和提高自身保健意识，但患者偶尔触及肿块而就诊，常常为时过晚。2)影像学诊断法影像学检查是以钼靶X线摄片为主要手段，辅以超声扫描和MRI扫描。钼靶X线摄片最早开始于1960年，在近五十年的发展历程中，对乳腺癌的早期诊断起到重要作用。乳腺组织本身密度小，包括肿瘤在内的很多病变表现为微小钙化。钼靶X线摄片方法能发现细小钙化点，如果表现为泥沙样钙化或细颗粒样钙化，或者每lcm2内< 0.5mm的超过5枚则可提示乳腺癌。但对于不典型的病变，尤其是致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2005年国际上乳腺癌诊疗领域的23位专家在肯定钼靶X线摄片技术在乳腺癌早期诊断的重要地位的同时，建议结合超声，MRI和病理检查，进行最佳评价。虽然该方法在发达国家乳腺癌的普查和早期发现中起到很大作用， 尤其是乳腺MRI技术的应用，将诊断敏感率提高至77 % -100 %，但是由于特殊仪器的限制， 对诊断技术的高要求和昂贵的价格，使这些方法在发展中国家及地区得不到广泛应用。3) 生物靶标早期检测包括乳腺癌相关基因普查，例如BRCAl和BRCA2的突变分析；乳头溢液特异物检测及血清肿瘤标志物的测定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中过度表达，在血清中可以检测到Her-2蛋白片断。通过酶联免疫反应测定血清Her_2水平，可以作为诊断乳腺癌的指标之一。因此，重点发展生物靶标检测，寻找新的乳腺癌检测靶标并发展为可供临床检测且简单实用的技术对于乳腺癌患者提前预警及采取有效的治疗手段意义重大。SPA-I 蛋白分子，艮口 signal-induced proliferation-associated protein l(SPA-l)，信号诱导的增殖相关蛋白1，是Ras超家族成员Rapl和Rap2的GTP酶活化蛋白，促使其由活性形式向非活性形式转变。小分子G蛋白Rapl在调控细胞增殖、分化、细胞粘附、肿瘤细胞浸润癌细胞转移中发挥重要作用。接受外来刺激而活化的Rapl 可通过Raf/ERK、ρ 38MAPK/CREB和P11调节造血细胞增殖和恶性转型，并能由内而外调节htegrin介导的粘附作用参与肿瘤细胞浸润[参见1. Hironori K.，Yasuo W., Noriyuki T. , Masatsugu Μ. , Hiroshi K. , Masakazu H. , Kazuhiro I. , Nagahiro Μ.,Human SPA-I Gene Product Selectively Expressed in Lymphoid Tissues Is a Specific GTPase-activating Protein for Rapl and Rap2, J Biol Chem,1997,272 28081-28088 ；2.Noriyuki Τ. , Masakazu H. , HailinY. , Johannes L.B. , Nagahiro Μ., Rapl GTPase-activating Protein SPA-I Negatively Regulates Cell Adhesion,J Biol Chem,1999,274 :18463-18469. ；3. Li Su, Masaki Moriyama, Norihito Murata, Masashi Harazaki, Kozo Kaibuchi, and Nagahiro Minato ；AF—6 and SPA-I Form a Molecular Complex and Negatively Regulate Integrin-dependent Cell adhesion via Efficient Rapl Inactivation, J Biol Chem, 2003, 278 (17) :15232-15238]。越来越多的研究表明， SPA-I与癌细胞转移密切相关。统计学分析发现SPA-I和MMP9多态性与早期宫颈癌淋巴结转移风险增高相关[参见:4. Rebecca Brooks, Nora Kizer, Loan Nguyen, Atthapon Jaishuen, Karolyn Wanat, Elizabeth Nugent, Perry Grigsby, Jenifer E. Allsworth, Janet S.Rader, Polymorphisms in MMP9 and SIPAl are associated with increased risk of nodal metastases in early-stage cervical cancer, Gynecologic Oncology 116(2010)539-543]。并且SPA-I在高转移的前列腺癌组织中表达有明显差异，有研究表明 SPA-I可以促使转录因子Brd4出核而引起ECM相关基因表达降低，最终导致前列腺癌细胞转移[参见:5. Yosuke Shimizu, Yoko H.，Masakazu H.，Keiko Doi，SPA-I controls the invasion and metastasis of human prostate cancer，Cancer Sci.，2011，]o
发明内容
本发明的目的是提供一种乳腺癌检测试剂盒。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种乳腺癌检测试剂盒包括鼠抗人SPA-I单克隆抗体。该乳腺癌检测试剂盒还可以包括封闭液、工作液、抗体稀释液、Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液、SABC-POD浓缩液、20XDAB显色液A、20XDAB显色液B，所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5% (W/V)牛血清蛋白(BSA)溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30% H2O2溶液稀释为3% (V/V)的H2O2溶液；所述的抗体稀释液为含有0. 1% (V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)。本发明提供的乳腺癌检测试剂盒，还可以有以下试剂中的一种或几种或全部pH为7. 2-7. 4，浓度为0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；pH为6. 0，浓度为0. Olmol/L的柠檬酸钠缓冲液，苏木素染液；中性树脂；75%(V/V)乙醇;95%(V/V)乙醇;无水乙醇；二甲苯。该试剂盒保存方法鼠抗人SPA-I单克隆抗体需4°C保存，其它试剂若长期储存需放于-20°C，短期储存可放于4°C以方便使用。本发明检测试剂盒的乳腺癌检测标签SPA-I蛋白分子，是一种具有GTP酶活性的调控分子，主要通过调控小G蛋白Rapl信号通路而参与细胞的生长、粘附、肿瘤发生等生理过程。本专利申请的发明人通过常规免疫组织化学染色和免疫蛋白质印迹等技术，首次发现乳腺癌患者在正常和癌旁组织细胞中SPA-I蛋白不表达或呈低表达，而在肿瘤细胞中则呈现高表达(见附图1)。进而选取64例已经确诊为不同病理级别的浸润性导管癌患者的组织切片经SPA-I染色后分级并经过统计学分析，发现SPA-I在不同分期的乳腺癌病理组织中表达水平有显著差异(P < 0. 05)。在体外细胞转移实验中，通过RNA干扰手段特异性降低内源性高表达的SPA-1，原本高转移能力的MDA-MB-231细胞迁移能力显著降低(见附图2)。综上表明，SPA-I蛋白在乳腺癌的恶化转移中发挥重要作用，而其表达的这种显著差异也为我们将其应用于临床诊断乳腺癌提供佐证。SPA-I蛋白氨基酸序列如序列表中的序列1所示(来自UniProKB，> sp | Q96FS4)。本申请发明人首次发现并证实乳腺癌患者乳腺组织癌细胞中特异性高表达SPA-I 蛋白分子，并且其表达程度与乳腺癌细胞的转移能力密切相关，因而临床上可以利用免疫组织化学方法检测乳腺癌患者肿瘤组织SPA-I的表达水平，从而用于乳腺癌及转移的诊断。以甲醛固定石蜡包埋的组织切片为例，本发明检测试剂盒的使用方法如下(1)脱蜡至水切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中 5min，95%乙醇中5min，75%乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。(2)封闭内源性酶活在切片上滴加3% H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10 分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。(3)抗原修复将切片浸入0. OlM柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5-10分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5 分钟。(4)封闭在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。(5) —抗用抗体稀释液将鼠抗人SPA-I单克隆抗体按1 100_1 500稀释(经过稀释的抗体可在4°C短期保存)后，加在切片组织上，37°C放置1个小时或4°C过夜。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(6) 二抗用抗体稀释液将Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1 100_1 500稀释为工作液(此工作液可在4°C短期保存)，加在切片组织上，37°C，30分钟到1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(7) SABC-POD复合物用稀释液按1 100将SABC-P0D浓缩液稀释为工作液(此工作液可在4°C短期保存)，加到切片上，室温或37°C，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次， 每次5分钟。(8) DAB显色用PBS配置，将20 X DAB-显色液A和20 X DAB显色液B各稀释20倍后混合制备DAB工作液。混勻后加至切片。室温显色，镜下控制显色时间，一般5-10分钟。 蒸馏水洗涤终止反应。(9)苏木素复染切片上滴加苏木素染液，1-2分钟，之后用蒸馏水洗涤。(10)脱水、透明、封片切片分别置于75%乙醇中5分钟，95%乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
本申请发明人通过免疫组织化学染色发现SPA-I在正常组织、癌旁组织、癌组织表达有明显的的组织特异性，并且在级别不同的乳腺癌组织中表达也有明显差异，进一步在细胞系水平上的研究表明SPA-I可以促进乳腺癌细胞的转移能力。所以，SPA-I可以作为乳腺癌癌细胞转移检测的生物标记而应用于乳腺癌生物靶标检测预警。[实验资料]利用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织切片中SPA-I表达的实验资料检测试剂盒(1)鼠抗人SPA-I单克隆抗体，购自美国BD公司；(2)封闭液，其制备方法是从Biosharp公司购得牛血清蛋白BSA，用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制成浓度为5% (W/V)牛血清蛋白(BSA)溶液；(3)3% (V/V) H2O2工作液，其制备方法是用PBS溶液作为稀释液将301^H2O2溶液稀释为3% (V/V)的H2A溶液，30% H2O2购自国药集团化学试剂有限公司；(4)抗体稀释液，由含有0. 1% (V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)构成，其制备方法是用磷酸盐缓冲液(PBQ将Tween-20稀释1000倍得到，Tween-20购自Amresco 公司；(5) Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液，购自北京索莱宝科技有限公司；(6) SABC-POD浓缩液，购自北京索莱宝科技有限公司；(7) 20 X DAB显色液A，购自北京索莱宝科技有限公司；(8) 20 X DAB显色液B，购自北京索莱宝科技有限公司。试剂盒保存方法鼠抗人SPA-I单克隆抗体需4°C保存，其它试剂若长期储存需放于-20°C，短期储存可放于4°C以方便使用。实验室还需要准备以下试剂pH为7. 2-7. 4，浓度为0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；pH为6. 0，浓度为0. 01mol/L的柠檬酸钠缓冲液，苏木素染液；中性树脂；75%(V/V)乙醇;95%(V/V)乙醇;无水乙醇；二甲苯。实验步骤从肿瘤医院病理科获取乳腺癌组织甲醛固定石蜡包埋的组织切片两张，一张作为阴性对照，一张用于检测SPA-I蛋白表达。该组织切片病理诊断情况为右乳浸润性导管癌 I期。现根据本试剂盒提供实验方法进行SPA-I检测操作。(1)脱蜡至水切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中 5min，95%乙醇中5min，75%乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。(2)封闭内源性酶活在切片上滴加3% H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10 分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。
(3)抗原修复将切片浸入0. OlM柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5分钟。(4)封闭在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。(5) 一抗用抗体稀释液将试剂盒中鼠抗人SPA-I单克隆抗体按1 200稀释后， 加在切片组织上，4°C过夜。阴性对照使用PBS溶液代替SPA-I单克隆抗体工作液，其余操作相同。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(5) 二抗用抗体稀释液将试剂盒中Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1 100稀释为工作液，将工作液加在切片组织上，37°C，1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(6) SABC-POD复合物用稀释液按1 100将试剂盒中SABC-POD浓缩液稀释为工作液加到切片上，室温或37°C，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(7) DAB显色配置ImlDAB工作液，将20 X DAB-显色液A和20 X DAB显色液B各取50 μ L加入900 μ L PBS溶液中混勻，加至切片，室温显色，镜下控制显色时间，5分钟。蒸馏水洗涤终止反应。(8)苏木素复染切片上滴加苏木素染液，2分钟，之后用蒸馏水洗涤。(9)脱水、透明、封片切片分别置于75%乙醇中5分钟，95%乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。(10)待中性树脂凝固后，显微镜下观察切片染色效果。染色结果见图4和图5，图4为阴性对照，图5为SPA-I单克隆抗体免疫染色结果 (SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图4阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图5中棕色部分即为阳性着色，SPA-I主要表达在呈肥大、增生性病变的恶性肿瘤细胞的细胞质中，并且可以看到棕色着色大部分围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。而正常的间质细胞中则没有SPA-I着色，如黑色箭头所示，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明 SPA-I呈特异性分布在乳腺癌组织恶性的肿瘤细胞胞浆中，呈强阳性着色分布，预示着肿瘤细胞有较强的转移能力，需对患者乳腺癌细胞的转移加以监测和预防。
图1为免疫组织化学方法检测SPA-I蛋白在乳腺癌组织肿瘤细胞(见a图)和正常乳腺组织细胞中的表达(见b图)，在图1中的a图中，箭头所指为SPA-I蛋白表达；在图1中的b图中，则未见到有SPA-I蛋白表达。图2免疫蛋白印迹方法检测SPA-I蛋白在乳腺癌正常组织(Lane 1)、乳腺癌癌旁组织(Lane 2)和乳腺癌组织细胞(Lane 3)中的表达图3 SPA-I蛋白表达降低后即231-Si细胞，可显著降低乳腺癌细胞系MDA-MB-231 的转移能力。图4和图5为实施例1中显微镜下观察切片染色效果图，图4为阴性对照，图5为 SPA-I单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图4阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图5中棕色部分即为阳性着色，SPA-I主要表达在呈肥大、增生性病变的恶性肿瘤细胞的细胞质中，并且可以看到棕色着色大部分围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。而正常的间质细胞中则没有SPA-I着色，如黑色箭头所示，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明SPA-I呈特异性分布在乳腺癌组织恶性的肿瘤细胞胞浆中，呈强阳性着色分布，预示着肿瘤细胞有较强的转移能力，需对患者乳腺癌细胞的转移加以监测和预防。图6和图7为实施例2中的显微镜下观察染色效果图，图6为阴性对照，图7为 SPA-I单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图6阴性对照中无棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图7中棕色部分即为阳性着色，SPA-I主要表达在细胞质中，并且可以看到棕色着色基本围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。表明SPA-I在高转移能力的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中特异性表达于癌细胞胞浆中，在癌细胞胞浆中呈阳性着色。图8为操作流程框图。
具体实施例方式实施例1 利用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织切片中SPA-I的表达从肿瘤医院病理科获取乳腺癌组织甲醛固定石蜡包埋的组织切片两张，一张作为阴性对照，一张用于检测SPA-I蛋白表达。该组织切片病理诊断情况为右乳浸润性导管癌 I期。现根据本试剂盒提供实验方法进行SPA-I检测操作。(1)脱蜡至水切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中 5min，95%乙醇中5min，75%乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。(2)封闭内源性酶活在切片上滴加3% H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10 分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。(3)抗原修复将切片浸入0. OlM柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5分钟。(4)封闭在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。(5) 一抗用抗体稀释液将试剂盒中鼠抗人SPA-I单克隆抗体按1 200稀释后， 加在切片组织上，4°C过夜。阴性对照使用PBS溶液代替SPA-I单克隆抗体工作液，其余操作相同。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(5) 二抗用抗体稀释液将试剂盒中Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1 100稀释为工作液，将工作液加在切片组织上，37°C，1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(6) SABC-POD复合物用稀释液按1 100将试剂盒中SABC-POD浓缩液稀释为工作液加到切片上，室温或37°C，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(7) DAB显色配置ImlDAB工作液，将20 X DAB-显色液A和20 X DAB显色液B各取50 μ L加入900 μ L PBS溶液中混勻，加至切片，室温显色，镜下控制显色时间，5分钟。蒸馏水洗涤终止反应。(8)苏木素复染切片上滴加苏木素染液，2分钟，之后用蒸馏水洗涤。(9)脱水、透明、封片切片分别置于75%乙醇中5分钟，95%乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
(10)待中性树脂凝固后，显微镜下观察切片染色效果。染色结果见图4和图5，图4为阴性对照，图5为SPA-I单克隆抗体免疫染色结果 (SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图4阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图5中棕色部分即为阳性着色，SPA-I主要表达在呈肥大、增生性病变的恶性肿瘤细胞的细胞质中，并且可以看到棕色着色大部分围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。而正常的间质细胞中则没有SPA-I着色，如黑色箭头所示，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明 SPA-I呈特异性分布在乳腺癌组织恶性的肿瘤细胞胞浆中，呈强阳性着色分布，预示着肿瘤细胞有较强的转移能力，需对患者乳腺癌细胞的转移加以监测和预防。实施例2 利用免疫组织化学方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231中SPA-I的表达乳腺癌细胞系MDA-MB-231 (来自华中科技大学中法联合实验室，具有较高的转移能力)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养于细胞培养板中，生长至90%丰度时，使用PBS溶液洗一次，加入胰酶消化2分钟后，加入培养基终止消化，IOOOrpm离心5分钟后弃去上清液，培养基重悬细胞沉淀制备成细胞悬液待用。(1)准备细胞将MDA-MB-231细胞铺于经过多聚赖氨酸包被过的盖玻片上，一片用作阴性多照，一片用于SPA-I染色。待其丰度为80%以上吸去培养基，PBS溶液洗涤三次；(2)固定加入4% (V/V)多聚甲醛溶液，室温放置8分钟，PBS洗涤3次；(3)破膜加入0. 2% (V/V) Triton PBS溶液，室温放置6分钟，PBS洗涤3次；(4)封闭内源性酶活在切片上滴加3% H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10 分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。(5)封闭在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。(6) 一抗用抗体稀释液将试剂盒中鼠抗人SPA-I单克隆抗体按1 200稀释后， 加在切片组织上，4°C过夜。阴性对照使用PBS溶液代替SPA-I单克隆抗体，其余操作相同。 然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(7) 二抗用抗体稀释液将试剂盒中Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1 100稀释为工作液，将工作液加在切片组织上，37°C，1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(8) SABC-POD复合物用稀释液按1 100将试剂盒中SABC-POD浓缩液稀释为工作液，将工作液加到切片上，室温或37°C，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。(9) DAB显色配置ImlDAB工作液，将20 XDAB-显色液A和20 XDAB显色液B各取 50 μ L加入900 μ L PBS溶液中混勻，加至切片，室温显色。室温显色，镜下控制显色时间，5 分钟。蒸馏水洗涤终止反应。(10)苏木素复染切片上滴加苏木素染液，2分钟，之后用蒸馏水洗涤。(11)脱水、透明、封片切片分别置于75%乙醇中5分钟，95%乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。(12)待中性树脂凝固后，显微镜下观察染色效果。染色结果见图6和图7，图6为阴性对照，图7为SPA-I单克隆抗体免疫染色结果 (SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图6阴性对照中无棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图7中棕色部分即为阳性着色，SPA-I主要表达在细胞质中，并且可以看到棕色着色基本围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。表明SPA-I在高转移能力的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中特异性表达于癌细胞胞浆中，在癌细胞胞浆中呈阳性着色。
权利要求
1.一种乳腺癌检测试剂盒，包括鼠抗人SPA-I单克隆抗体.。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌检测试剂盒，其特征在于，包括封闭液、工作液、抗体稀释液、Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液、SABC-POD浓缩液、20 XDAB显色液A、20 XDAB显色液B。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌检测试剂盒，其特征在于所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5% (W/V)牛血清蛋白(BSA)溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30% H2O2溶液稀释为3%(V/V)的H2A溶液； 所述的抗体稀释液为含有0. 1% (V/V) Tween-20的磷酸盐缓冲液PBS。
4.根据权利要求1或2或3所述的乳腺癌检测试剂盒，其特征在于，它还包括以下试剂PH为7. 2-7. 4，浓度为0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液； PH为6. 0，浓度为0. 01mol/L的柠檬酸钠缓冲液； 苏木素染液； 中性树脂； 75% (V/V)乙醇； 95% (V/V)乙醇； 无水乙醇； 二甲苯。
全文摘要
本发明提供了一种乳腺癌检测试剂盒，该试剂盒包括有鼠抗人SPA-1单克隆抗体。本发明揭示乳腺癌患者乳腺组织癌细胞中特异性高表达SPA-1蛋白分子，并且其表达程度与乳腺癌细胞的转移能力密切相关，在级别不同的乳腺癌组织中表达也有明显差异，且SPA-1在正常组织、癌旁组织、癌组织表达有明显的组织特异性，进一步在细胞系水平上的研究表明SPA-1可以促进乳腺癌细胞的转移能力。本发明以SPA-1作为乳腺癌及其癌细胞转移检测的生物标记，提供包括鼠抗人SPA-1单克隆抗体的试剂盒，利用免疫组织化学方法检测乳腺癌患者肿瘤组织SPA-1表达水平。
文档编号G01N33/577GK102353781SQ20111015469
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者夏和顺, 张义磊, 张茜, 苏莉 申请人:华中科技大学