专利名称：一种野菊花指纹图谱的测定方法及其应用和野菊花的质量检测方法
技术领域：
本发明涉及中药材质量检测领域，尤其是一种野菊花药材指纹图谱的测定方法及其在野菊花质量检测中的应用和野菊花的质量检测方法。
背景技术：
野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序。秋、冬二季花初开放时采摘，晒干，或蒸后晒干。野菊花为野生药材，资源丰富，全国大部分地区均产，湖北、河南两省为商品药材主要产地，全年产量约3000吨左右，安徽、江苏、山东、陕西等省也有少量商品。由于受原植物品种、生长环境、采收期气候、产地加工方法等诸多因素的影响，不同来源的药材质量差异较大，成为药材采购和生产环节的质量控制的一大难题。长期以来，野菊花产地采收时均以性状、气味等传统经验鉴别方法控制质量，一般以花形小、颗 粒状、香气浓郁者为佳，简便快捷，但缺乏定量指标，不能对药材内在质量进行科学合理的判定。工业生产中一般按照《中国药典》2010年版一部野菊花项下方法控制蒙花苷含量，但由于指标单一，在整体质量控制方面和检测方面存在缺陷。
发明内容
本发明的目的在于建立一种野菊花药材的指纹图谱测定方法，通过指纹图谱相似度评价野菊花药材的质量。本发明的另一个目的是建立一种野菊花药材中有效成分绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量测定方法，通过有效成份的含量评价野菊花药材的质量。本发明针对现有技术的缺陷，建立野菊花药材的指纹图谱测定方法和有效成分绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量测定方法，将指纹图谱相似度、有效成份含量等定量指标与传统经验鉴别方法的定性指标有机结合，相互印证，用于野菊花药材的整体质量检测中，为野菊花的质量控制提供了有效方法，极大的方便了药材采收、采购、工业生产中的质量控制。为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案来实现本发明的野菊花药材指纹图谱的测定方法，包括如下步骤(I)供试品溶液的制备精密称定野菊花药材粉末，精密加入体积百分比浓度为30% 100%的甲醇水溶液，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。较佳的，精密称定的野菊花药材粉末为O. 05g 2. 5g，精密加入的体积百分比浓度为30% 100%甲醇水溶液的量为10 500mL。最佳的，精密称定的野菊花药材粉末为O. 25g，精密加入的体积百分比浓度为30% 100%甲醇水溶液的量为50mL。(2)参照物溶液的制备取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为30% 100%的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12. 7 202. 9μ g/mL的参照物溶液。(3)测定采用高效液相色谱法HPLC对参照物溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录供试品溶液的指纹图谱和作为对照色谱峰的参照物溶液的指纹图谱；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件a,色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱，所述流动相中有机相的体积百分比为5% 90%，水相的体积百分比为95% 10%，其中，流动相中的有机相选自乙睛、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶剂，流动相中的水相选自酸的水溶液或缓冲盐的水溶液；c，柱温为25 40°C ;检测波长为220 360nm ；
较佳的,所述流动相的流速为I. OmL/min ；本发明将供试品溶液的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；本发明的野菊花药材标准指纹图谱包括18个共有指纹峰，以蒙花苷色谱峰12#峰(S峰)为内参比峰，可计算出其他17个共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。本发明将测得的野菊花的指纹图谱与野菊花的标准指纹图谱进行相似度的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版软件进行比较。本发明的野菊花的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱的相似度> O. 95，是优质野菊花药材的判定标准之一。本发明的野菊花药材指纹图谱的测定方法可用于野菊花药材的质量检测。本发明的野菊花药材的质量检测方法，包括采用野菊花指纹图谱的测定方法得到野菊花的指纹图谱，采用与野菊花指纹图谱的测定方法相同的条件得到野菊花的标准指纹图谱，将得到的野菊花的指纹图谱与野菊花的标准指纹图谱进行相似度比较；还包括野菊花中有效成分的含量测定。所述野菊花药材中的有效成分是指绿原酸、木犀草苷和蒙花苷等有效成分。本发明的野菊花药材中有效成分的含量测定，包括有效成分中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷中的一种或多种成分的含量测定，具体包括如下步骤(I)供试品溶液的制备精密称定野菊花药材粉末，精密加入体积百分比浓度为30% 100%甲醇水溶液，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。较佳的，精密称定的野菊花药材粉末为O. 05g 2. 5g，精密加入的体积百分比浓度为30% 100%甲醇水溶液的量为10 500mL。最佳的，精密称定的野菊花药材粉末为O. 25g，精密加入的体积百分比浓度为30% 100%甲醇水溶液的量为50mL。(2)对照品溶液的制备选取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种对照品适量，用体积百分比浓度为30% 100%的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液。较佳的，所述单一对照品溶液为蒙花苷的单一对照品溶液、木犀草苷的单一对照品溶液或绿原Ife的单一对照品溶液；更佳的，所述蒙花苷的单一对照品溶液中蒙花苷的浓度为12. 7 202. 9μ g/mL ；所述绿原酸的单一对照品溶液中绿原酸的浓度为2. O 32. 4 μ g/mL ;所述木犀草苷单一对照品溶液中木犀草苷的浓度为I. O 15. 6 μ g/mL。较佳的，所述混合对照品溶液为包含蒙花苷的混合对照品溶液；所述包含蒙花苷的混合对照品溶液还包含绿原酸和木犀草苷中的一种或两种物质。更佳的，所述混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为2. O 32. 4 μ g/mL、木犀草苷的浓度为1.0 ~ 15. 6 μ g/mL、蒙花苷的浓度为12. 7 202. 9 μ g/mL。(3)测定采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行检测，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱；其中，所述流动相中有机相的体积百分比为5% 90%，水相的体积百分比为95% 10% ;流动相中的有机相选自乙睛、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶剂，流动相中的水相选自酸的水溶液或缓冲盐的水溶液；c，柱温为25 40°C ;检测波长为220 360nm ；较佳的,所述流动相的流速为I. OmL/min ；(4)根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。本发明的野菊花中蒙花苷的质量百分含量不小于0.8%，作为优质野菊花的判定标准之本发明用于测定野菊花中绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量和野菊花的指纹图谱时，可以采用相同的供试品制备方法和相同的色谱条件。本发明的供试品溶液的制备中野菊花药材粉末取用量为O. 05g 2. 5g，提取溶剂可以是体积百分比浓度为30% 100%的甲醇水溶液，提取溶剂的用量根据药材取用量的不同可以是10 500mL ;最佳的药材取用量与提取溶剂的用量之比为I : 200 (例如野菊花药材粉末O. 25g，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液50mL);提取溶剂中甲醇浓度不超过50 %时，可以取滤液直接进样；若提取溶剂中甲醇浓度超过50 %时，直接进样容易出现强溶剂效应导致的峰变形，可通过水稀释使甲醇浓度降至50%以下后进样可以消除强溶剂效应影响。也可以用不同浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，但乙醇溶液提取效果相比甲醇溶液要差。本发明的供试品溶液的制备中野菊花药材粉末提取方法可以是回流提取、超声提取、索式提取。本发明供试品溶液的制备中野菊花药材粉末提取方法采用回流提取时，一般采用烧瓶作为提取容器，提取溶剂采用移液管等精密量器定量加入，提取前需称定重量，提取后需用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行测定；回流提取的温度和时间对提取效果有明显影响，提取温度可以是60 100°C，最佳提取温度为80°C，提取时间可以是O. 5 4. O小时，最佳提取时间是2. O小时。本发明采用回流提取最佳的供试液制备方法为取野菊花药材粉末0.25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50 %的甲醇水溶液50mL，称定重量，800C回流提取2. O小时，冷至室温，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过,取续滤液作为供试品溶液。本发明的供试液的制备中野菊花药材粉末提取方法采用超声提取时，可以采用·烧瓶作为提取容器，提取溶剂采用移液管等精密量器定量加入，提取前需称定重量，提取后需用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行测定；也可以采用容量瓶作为提取容器，提取后定容，摇匀，滤过，取续滤液进行测定；超声提取的时间对提取效果有明显影响，提取时间可以是5 60分钟，最佳提取时间是30分钟。本发明采用超声提取最佳的供试液制备方法为取野菊花药材粉末O. 25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液50mL，称定重量，超声提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。本发明测定野菊花指纹图谱时，其参照物溶液可以用绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素等制成一定浓度的单一对照溶液或混合对照品溶液，分别对各指标成分进行归属定位；为方便指纹图谱比较并节约检测成本，可以用单一的蒙花苷对照品溶液作为参照物溶液，浓度可以是12. 7 202. 9 μ g/mL，参照物溶液的制备一般采用与供试品相同的溶剂，较佳的参照物制备方法为取蒙花苷对照品，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液溶解，制成含蒙花苷为12. 7 202. 9 μ g/mL的参照物溶液。 本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所指的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，不同品牌和型号的色谱柱分离性能有较明显的差异，在做指纹图谱测定时以Kromasil C18色谱柱分离效果最好。本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所指的流动相有机相可以是乙睛、甲醇、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合溶剂；所述流动相水相中的酸水溶液选自磷酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液和三氟乙酸水溶液，但不局限于上述酸水溶液；所述流动相水相中的缓冲盐水溶液选自磷酸盐水溶液和醋酸盐水溶液，缓冲盐水溶液的PH值不大于7. 0，但不局限于上述缓冲盐水溶液。本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所述流动相中有机相为乙睛，水相为磷酸水溶液，并采用梯度洗脱，且流动相中有机相体积百分比占5% 90 %，水相体积百分比占95 % 10 %，可以得到理想的分离效果；水相中的酸水溶液的浓度可以在较宽的范围内调整，磷酸水溶液中酸的体积百分比浓度为O. 025% O. 1%的范围内变动不会对分离效果造成明显影响。本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，最佳的流动相为以乙睛为流动相中的有机相，以体积百分比浓度为O. 05%磷酸水溶液为流动相中的水相；采用梯度洗脱的条件为0 5min，水相体积百分比从90%线性改变至85%，5 25min，水相体积百分比从85%线性改变至80%，25 40min，水相体积百分比从80%线性改变至70%,40 50min,水相体积百分比从70%线性改变至30%, 50 60min,水相体积百分比从30 %线性改变至30 %。本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所述色谱柱的温度为25 40°C，最佳的色谱柱柱温为30°C。本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，所述检测波长为220 360nm,最佳的检测波长为334nm。本发明测定野菊花指纹图谱和测定野菊花中有效成分的含量中，最佳的色谱条件为取参照物溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为O. 05%磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为0 5min，水相体积百分比从90%线性改变至85%, 5 25min,水相体积百分比从85%线性改变至80%, 25 40min,水相体积百分比从80%线性改变至70%，40 50min，水相体积百分比从70%线性改变至30%，50 60min，水相体积百分比从30%线性改变至30%，流速I. OmL/min ;柱温30°C;检测波长334nm。采用上述最佳色谱条件进行测定并记录供试品指纹图谱；将供试品指纹图谱与标准指纹图谱进行相似度计算。采用上述最佳条件所建立的野菊花的标准指纹图谱，包括18个共有指纹峰，以蒙花苷色谱峰12#峰(S峰)为内参比峰，其他17个共有指纹峰的相对保留时间依次为1#峰(O. 162±0· 005)、2# 峰(O. 216±0· 005)、3# 峰(O. 543±0· 005)、4# 峰(O. 570±0· 005)、5#峰(O. 650±0. 005)、6# 峰(O. 693±0. 005)、7# 峰(O. 733±0. 005)、8# 峰(O. 793±0. 005)、9# 峰(O. 804±0· 005)、10# 峰(O. 842±O. 005)、11# 峰(O. 984±O. 005)、13# 峰(1·031±0· 005)、14# 峰(1·078±0· 005)、15# 峰(I. 136±0. 005)、16# 峰(I. 148±0. 005)、17# 峰(I. 155±0· 005) ,18# 峰(I. 159±0· 005)。 本发明测定野菊花中有效成分的含量时，按进样量20 μ L计算，各指标成分浓度的线性范围分别为绿原酸2. O 32. 4 μ g/mL、木犀草苷I. O 15. 6 μ g/mL、蒙花苷12. 7 202. 9 μ g/mL,因此可以制成相应浓度的单一对照品溶液或混合对照品溶液作为含量测定的对照品；对照品制备可以采用不同浓度的甲醇溶液配制成储备液再进一步稀释成需要的浓度，也可以直接配制成需要的浓度；木犀草苷、蒙花苷在甲醇和甲醇水溶液中稳定性均较好，可长期存放使用；绿原酸在甲醇中稳定，可长期存放使用，在甲醇水溶液中不稳定，易降解转化，需要现用现配。本发明的野菊花的质量检测方法中，所测定的野菊花的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱的相似度不低于O. 95 ;所测定的野菊花中，以野菊花干药材计，蒙花苷的质量百分含量不低于O. 8% ;同时满足上述两个条件的野菊花为优质野菊花。本发明的野菊花的质量检测方法可用于野菊花的质量评价和野菊花药材的质量控制。野菊花药材以花形大小来看，花形的平均直径小于4毫米的为小花，花形的平均直径大于等于4毫米的为大花，传统经验认为花形小、色泽鲜艳、香气浓郁者质量为佳。产地和品种可能是决定野菊花质量的主要因素。本发明用于评价野菊花药材的质量，采用综合评价的方法，优质药材的判定标准为以干药材计，蒙花苷的质量百分含量不低于O. 8% ；与标准指纹图谱的相似度不低于O. 95。该评价方法可以区别不同产地药材、不同品种药材，并可以与经验鉴别标准相互印证，可以用于指导生产、采购环节的药材质量控制，具有很强的实用价值。
图I色谱柱选择色谱2流动相酸种类选择色谱3流动相酸浓度考察色谱4柱温考察色谱图
图5-1野菊花中活性成分绿原酸的紫外光谱图5-2野菊花中活性成分木犀草苷的紫外光谱图5-3野菊花中活性成分蒙花苷的紫外光谱图6不同检测波长下的野菊花色谱7野菊花供试品溶液DAD三维图谱图8野菊花药材HPLC标准指纹图谱图9不同产地22批野菊花药材HPLC指纹图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。具体试验方法供试品溶液的制备取野菊花药材粉末O. 25g，精密称定，置于烧瓶中，精密加入体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液50mL，称定重量，80°C回流提取2. O小时，冷至室温，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，O. 45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。 或者，取野菊花药材粉末O. 25g，精密称定，置于容量瓶中，精密加入体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液50mL，称定重量，超声提取30分钟，冷至室温，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液补足减失重量，并定容，摇匀，O. 45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。参照物溶液的制备取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12. 7 202. 9 μ g/mL的参照物溶液。对照品溶液的制备取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种适量，用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液。其中，所得的蒙花苷的单一对照品溶液中蒙花苷的浓度为12. 7 202. 9 yg/mL ;所得的绿原酸的单一对照品溶液中绿原酸的浓度为2. O 32. 4 μ g/mL ;所得的木犀草苷单一对照品溶液中木犀草苷的浓度为I. O 15. 6μ g/mL。所得的混合对照品溶液中，绿原酸的浓度为2. O 32. 4 μ g/mL、木犀草苷的浓度为I. O 15. 6 μ g/mL、蒙花苷的浓度为12. 7 202. 9 μ g/mL。采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和参照物溶液别进行测试，并记录供试品溶液的指纹图谱和作为对照色谱峰的参照物溶液的指纹图谱，将供试品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，并计算相似度；采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行测试，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。其中，采用高效液相色谱法HPLC对各种待测溶液分别进行测试时，色谱条件如下取待测溶液20 μ L注入高效液相色谱仪，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充齐U，以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为O. 05%的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为0 5min，水相体积百分比从90%线性改变至85%，5 25min,水相体积百分比从85%线性改变至80%, 25 40min,水相体积百分比从80%线性改变至70%,40 50min,水相体积百分比从70%线性改变至30%, 50 60min,水相体积百分比从30%线性改变至30%，流速I. OmL/min ;柱温30°C ;检测波长334nm。实施例I :色谱柱选择在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较Agilent SB-C18 (4. 6X 250mm, 5 μ m)、Agilent TC-C18 (2) (4. 6 X 250mm, 5 μ m)、AgilentXDB-C18(4. 6X250mm，5ym)以及 Kromasil C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m)等 4 款色谱柱的分离效果，结果表明，各色谱柱的出峰数目、峰分离度存在显著差异，其中KromasilC18(4. 6X250mm,5ym)各项性能指标最优，因此选用 Kromasil C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)作为进行指纹图谱测定柱。见图I。实施例2 :流动相酸种类选择野菊花中主要含黄酮类和有机酸类成分，在酸性流动相中分离较好。以乙腈为有机相，在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较磷酸、冰乙酸、甲酸、三氟乙酸的水溶液作水相时的分离效果，结果表明，磷酸水溶液做水相时色 谱峰形和分离度最好，因此选用磷酸溶液水相进一步考察酸浓度。见图2。实施例3 :流动相酸浓度考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较体积百分比浓度为O. 025%,O. 05%,O. I %三种浓度的磷酸水溶液作水相时的分离效果，结果表明，该方法对酸浓度变化的耐受性较好，三种酸浓度下色谱峰形和分离度无明显差异，因此选择O. 05%磷酸溶液作为流动相水相。见图3。实施例4 :柱温考察在具体试验方法中其他条件相同的情况下，比较25°C、30°C、35°C、40°C等四种不同的色谱柱温度下的分离效果，结果表明，柱温对分离效果有明显影响，25°C、30°C时各色谱峰分离较好，30°C时分离效果最佳，因此确定柱温为30°C。见图4。实施例5 :检测波长选择绿原酸、木犀草苷、蒙花苷为野菊花中的三种活性成分，其分子结构、极性和光谱特征均存在明显差异，作为指控指标成分具有较好的代表性。根据三种成分紫外光谱的特征吸收，从野菊花供试品DAD三维图谱中提取不同波长下的色谱图进行比较，结果表明，334nm下得到的色谱图基线平稳，并可兼顾各成分检测灵敏度，因此选为指纹图谱测定波长。见图5-1、图5-2、图5-3、图6。实施例6 :提取溶剂选择以各指标成分峰面积为评价标准，比较了甲醇、乙醇两种溶剂在超声提取30min时的提取效果，野菊花取样量为O. 25g，溶剂用量为50mL，结果表明，甲醇提取效率明显优于乙醇，因此选用甲醇作溶剂进一步优选提取溶剂浓度。相关数据见表I。表I提取溶剂选择结果
指标成分峰面积
提取溶剂 ----
绿原酸木犀草苷蒙花苷木犀草素
甲醇67.28345.0517699.69066.426
乙醇未检出未检出344.16744.125实施例7 :甲醇浓度考察以各指标成分峰面积为评价标准，比较了不同浓度甲醇水溶液80°C回流2h的提取效果，野菊花取样量为O. 25g，溶剂用量为50mL，结果表明，体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液提取效率最佳，因此选用体积百分比浓度为50%的甲醇水溶液为溶剂。相关数据见表2。表2甲醇浓度考察结果
权利要求
1.一种野菊花指纹图谱的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称定野菊花药材粉末，精密加入体积百分比浓度为 30% 100%的甲醇水溶液，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取蒙花苷对照品适量，用体积百分比浓度为30% 100%的甲醇水溶液溶解，制成蒙花苷浓度为12. 7 202. 9 μ g/mL的参照物溶液；(3)测定采用高效液相色谱法HPLC对参照物溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录供试品溶液的指纹图谱和参照物溶液的指纹图谱；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱，其中，所述流动相中有机相的体积百分比为5% 90%，水相的体积百分比为95% 10% ;流动相中的有机相选自乙睛、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶剂，流动相中的水相选自酸的水溶液或缓冲盐的水溶液；c，柱温为25 40°C ;检测波长为220 360nm。
2.如权利要求I所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，步骤(I)中，所述精密称定的野菊花药材粉末为O. 05g 2. 5g，精密加入的体积百分比浓度为30 % 100 %的甲醇水溶液的量为10 500mL ;所述提取选自回流提取、超声提取和索式提取。
3.如权利要求2所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，所述回流提取的条件为60 100°C回流提取O. 5 4. O小时，冷至室温，并用体积百分比浓度为30 100% 的甲醇水溶液补足减失的重量；所述超声提取的条件为超声提取5 60分钟，冷至室温， 并用体积百分比浓度为30 100%的甲醇水溶液补足减失的重量或者定容。
4.如权利要求I所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，步骤(3)的b中，所述酸的水溶液选自磷酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液和三氟乙酸水溶液；所述缓冲盐的水溶液选自磷酸盐水溶液和醋酸盐水溶液，且缓冲盐水溶液的pH值不大于7. O。
5.如权利要求I所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，步骤(3)的b中，所述酸的水溶液中酸的体积百分比浓度为O. 025% O. 1%。
6.如权利要求1-5任一所述的野菊花指纹图谱的测定方法，其特征在于，步骤(3)中， 色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；以乙睛为流动相的有机相，以体积百分比浓度为O. 05%的磷酸水溶液为流动相的水相，采用梯度洗脱，且梯度洗脱的条件为0 5min， 水相体积百分比从90%线性改变至85%，5 25min，水相体积百分比从85%线性改变至 80%, 25 40min,水相体积百分比从80%线性改变至70%,40 50min,水相体积百分比从70 %线性改变至30%，50 60min，水相体积百分比从30 %线性改变至30% ;流速为 I. OmL/min ;柱温为30°C ;检测波长为334nm。
7.如权利要求1-6任一所述的野菊花指纹图谱的测定方法在野菊花的质量检测中的应用。
8.—种野菊花的质量检测方法，包括采用权利要求1-6任一所述的野菊花指纹图谱的测定方法得到野菊花的指纹图谱，采用与野菊花指纹图谱的测定方法相同的条件得到野菊花的标准指纹图谱，将得到的野菊花的指纹图谱与野菊花的标准指纹图谱进行相似度比较；还包括野菊花中有效成分的含量测定。
9.如权利要求8所述的野菊花的质量检测方法，其特征在于，采用与权利要求6所述的野菊花指纹图谱的测定方法相同的条件得到野菊花的标准指纹图谱，所述野菊花的标准指纹图谱包括18个共有指纹峰，以蒙花苷色谱峰12#峰(S峰)为内参比峰，其他17个共有指纹峰的相对保留时间依次为1#峰(O. 162±0. 005)、2#峰(O. 216±0. 005)、3#峰 (O. 543±0. 005)、4# 峰(O. 570±0. 005)、5# 峰(O. 650±0. 005)、6# 峰(O. 693±0. 005)、7# 峰(O. 733±0. 005)、8# 峰(O. 793±0. 005)、9# 峰(O. 804±0. 005)、10# 峰(O. 842±0. 005)、 11# 峰(O. 984±0· 005)、13# 峰(I. 031 ±0. 005)、14# 峰(I. 078±0· 005)、15# 峰 (I. 136±0. 005)、16# 峰(I. 148±0. 005)、17# 峰(I. 155±0. 005)、18# 峰(I. 159±0. 005)。
10.如权利要求8所述的野菊花的质量检测方法，其特征在于，所述有效成分为绿原酸、木犀草苷和蒙花苷中的一种或多种成分。
11.如权利要求8所述的野菊花的质量检测方法，其特征在于，所述野菊花中有效成分的含量测定具体包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称定野菊花药材粉末O.05g 2. 5g，精密加入体积百分比浓度为30% 100%甲醇水溶液10 500mL，提取，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备选取绿原酸对照品、木犀草苷对照品和蒙花苷对照品中的一种或多种对照品适量，用体积百分比浓度为30% 100%的甲醇水溶液溶解，制成单一对照品溶液或者混合对照品溶液；(3)测定采用高效液相色谱法HPLC对供试品溶液和对照品溶液分别进行检测，并分别记录供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件a，色谱柱的填料采用十八烷基硅烷键合硅胶；b，采用有机相和水相的混合液作为流动相进行梯度洗脱；其中，所述流动相中有机相的体积百分比为5 % 90 %，水相的体积百分比为95 % 10 % ;流动相中的有机相选自乙睛、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶剂，流动相中的水相选自酸的水溶液或缓冲盐的水溶液；c，柱温为25 40°C ;检测波长为220 360nm ；(4)根据所记录的供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量。
12.如权利要求11所述的野菊花的质量检测方法，其特征在于，所述单一对照品溶液为蒙花苷的单一对照品溶液、绿原酸的单一对照品溶液或木犀草苷的单一对照品溶液；所述蒙花苷的单一对照品溶液中蒙花苷的浓度为12. 7 202. 9 yg/ mL ;所述绿原酸的单一对照品溶液中绿原酸的浓度为2. O 32. 4 μ g/mL ;所述木犀草苷单一对照品溶液中木犀草苷的浓度为I. O 15. 6 μ g/mL ；所述混合对照品溶液为包含蒙花苷的混合对照品溶液，其中，绿原酸的浓度为2. O 32. 4 μ g/mL、木犀草苷的浓度为I. O 15. 6 μ g/mL、蒙花苷的浓度为12. 7 202. 9 μ g/mL。
13.如权利要求8-12任一所述的野菊花的质量检测方法，其特征在于，所测定的野菊花的指纹图谱与野菊花标准指纹图谱的相似度不低于O. 95 ;所测定的野菊花中，以野菊花干药材计，蒙花苷的质量百分含量不低于O. 8% ;同时满足上述两个条件的野菊花为优质野菊花。
14.如权利要求8-12任一所述的野菊花的质量检测方法在野菊花在野菊花药材的质量评价和野菊花药材的质量控制中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种野菊花药材的质量检测方法，包括野菊花药材指纹图谱的测定和野菊花有效成分的含量测定。野菊花药材指纹图谱测定的主要步骤为供试品溶液制备、参照物溶液制备、测定、记录图谱、计算相似度。野菊花药材有效成分的含量测定的主要步骤为对照品溶液制备、供试品溶液制备、测定、记录图谱、用外标一点法计算含量。野菊花的质量检测方法可用于野菊花药材的质量评价和质量控制中，以指纹图谱相似度不小于0.95、蒙花苷含量不小于0.8%为综合评价指标。本发明野菊花药材的指纹图谱及其有效成分绿原酸、木犀草苷、蒙花苷的含量测定，具有专属性强、准确度高和稳定性、精密度、重复性良好等优点，是野菊花药材质量控制的有效手段。
文档编号G01N30/74GK102928523SQ201110230308
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者敬应春, 郭美兰, 蔡国琴, 张聪 申请人:上海雷允上科技发展有限公司, 上海市中药研究所