专利名称：同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，该猪流感病毒诊断器件是基于抗原/抗体特异性反应来诊断猪流感病毒抗原的专用微流控芯片，属于分析测试领域。
背景技术：
猪流感病毒(Swineinfluenza vires，SIV)属于正粘病毒科甲型流感病毒属 (Influenza virus A)，是单股负链RNA病毒，其基因组由大小不等的8个独立片段组成。 甲型流感的亚型是根据血凝素(Hemagglutinin)和神经氨酸(Neuraminidase)的不同来分的，其可分为15种不同的H抗原亚型和9种不同的N抗原亚型。目前造成世界流行SIV血清型亚型主要有3种=H1Np H3N2和H1Ny最近以墨西哥和美国为主的全球甲型H1N1流感的暴发更加坚定了对SIV的研究和防控。因此发展快速诊断和确诊SIV的方法非常迫切，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的意义。目前传统的猪流感诊断方法，大致可分为四种一是病毒分离，病毒分离被视作实验室诊断的标准，但缺点是所耗时间较长，而且只能在专门的实验室进行，往往不能及时防制措施提供依据；二是检测病毒核酸，最常用的是反转录PCR，若利用多对特异性引物进行多种PCR，可以实现不同亚型SIV同时检测，但影响因素多、操作复杂、耗时，同时需要专业技术人员进行操作；三是检测病毒蛋白，如荧光抗体方法和免疫组化方法，这类方法的虽可满足快速诊断的需要，但其灵敏度低、特异性不强；四是利用免疫学方法检测血清中的特异性抗体，如酶联免疫吸附试验(ELISA)；虽有较高的灵敏度和特异性，但也有少量的假阴性和假阳性。电化学免疫传感器具有自动化程度高、廉价、易制备、快速灵敏等独特优势，配合免疫反应的高效专一，非常适合构建重大传染病多重免疫分析检测的分析仪。有“生命科学集成电路”之称的微流控芯片(lab-on-chip)是构建微型化、集成化的电化学免疫传感器的理想技术。微流控芯片技术是将采样、预处理、加试剂、反应、分离、检测等集成在一块微芯片上完成的一门前沿技术，具有分析速度快、信息量大、试剂消耗少、污染小、操作费用低、仪器使用简便等优点。且非常适合工业化生产。微流控技术代表着21世纪分析仪器走向微型化、集成化的发展方向。构建适合于重大传染病检测的微流控安培检测芯片具有以下优势(1)通过微加工技术很容易在芯片上集成多个检测通道和检测电极，做到多目标物同时分析，技术可行性高。(2)通过微流动注射技术，样品在管路中流动保证了电极表面时刻更新，较好克服了电极易被污染，造成假阳性率高、结果平行性差等问题。(3)微流控传感器上管路直径只有μ m级，反应池体积也只有μ L级，分析时所需试剂用量极少，分析物到达电极表面的扩散距离短、因此可以大大减少温育时间，实现快速联检目标。⑷目前微流控传感器多基于光学检测系统，仪器昂贵体积大，全集成很难，而且检测成本很高，限制了其推广。而传感器中采用电化学检测，体积小、自动化程度高、成本低。目前，在微流控芯片技术领域，利用猪流感病毒(SIV)多种亚型的特异性抗体来同时检测、快速诊断多种亚型SIV抗原的相关技术和方法尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，在微流控芯片技术这样一个总的技术框架内，研发出一种能够利用SIV多种亚型的特异性抗体来对相应的SIV抗原进行同时检测、快速诊断的专用微流控芯片。本发明通过如下方案解决所述技术问题，该方案提供的装置是一种同时检测多种亚型SIV的多通道微流控芯片，该微流控芯片的结构包括贴合装设在一起的两片板状物， 所述两片板状物分别是微流控芯片的盖片以及微流控芯片的基片，在所述两片板状物之间的相互贴合的位置上装设有管道，以及，三个池状物，管道的一端经由歧管状流体通道分别与其中的两个池状物联通，管道的另一端与余下的一个池状物联通，以及，依序分别装设在所述管道内不同位置上的工作电极以及对电极以及参比电极，所述工作电极由导电性电极以及贴附在所述导电性电极上的包埋了 SIV特异性抗体的金胶敏感膜构成，本案特别之处在于，所述管道的构造呈并联构造，所述呈并联构造的管道由三条分支管道并联构成，以及，所述工作电极的数量是三个，该三个工作电极的装设位置分别位于所述三条分支管道内，以及，该三个工作电极其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体分别是对不同亚型SIV 抗原能特异性结合的三种不同亚型Siv抗体物质，该三种不同亚型的特异性抗体物质分别是H1Np H3N2和H1N2，而且每一个工作电极其形貌均呈串珠状。所述金胶敏感膜是将壳聚糖金胶溶液与SIV特异性抗体溶液充分混合均勻，并使其干燥成膜而成。所述金胶敏感膜中的不同亚型SIV均为辣根过氧化物酶或者葡糖糖氧化酶标记的SIV抗体，所述金胶敏感膜已包含为固定上述各SIV特异性抗体而引入其中的辅助性介质，所述辅助性介质例如壳聚糖、醋酸纤维素、明胶其中的一种或它们的混合物。所述微流控芯片结构中的所述管道以及所述分支管道以及所述歧管状流体通道， 其内径尺寸均可以是任意选定的尺寸，但是，出于尽量少用待测液样以及降低试剂损耗等方面的考虑，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管状流体通道最好均选用毛细管级的通道，所述毛细管级的通道意即毛细管通道，其内径与通常意义上的毛细管的内径相当。所述毛细管其内部通道的横截面形状可以是任意的形状，所述横截面形状例如圆形、椭圆形、 方形、矩形、条形，当然也可以是任意的存在弯曲的线形，并且，所述毛细管的内部形状随着管道的延伸，不同部位的横截面形状也可以允许是不同的形状。仅就毛细管一词而言，其技术含义是公知的。结构中涉及的对电极以及参比电极均为微小尺寸的电极，其电极形状均可以是任意选定的形状，所述任意选定的形状例如方片形状、矩形片状、条状或圆形片状等等。本案芯片中的工作电极呈串珠状，其串珠状电极外形有助于大幅度地扩展它的有效工作界面，并且，进一步地，串珠状形貌还使得该工作电极具有良好的扰流性，这有助于强化工作电极与流经其周边的被测物液流之间的接触。本案微流控芯片结构中涉及若干个池状物，所述池状物是用于过渡性储液的池形或囊形构造，其中的每一个池状物的内腔其形状均可以是任意选定的形状，所述内腔形状例如圆柱形空腔状、方柱形空腔状、椭圆形空腔状或球形空腔状等等。所述池状物的尺寸可以是任意选定的尺寸，但是，为了能够尽量少用待测液样以及降低试剂损耗，所述池状物最好是能够与毛细管匹配的微小型的池状物。本案装置当然还可以进一步包括一些附件，所述附件例如多道电化学工作站以及微流动泵等等，所述多道电化学工作站的技术含义以及微流动泵的技术含义是公知的。本案微流控芯片结构中涉及的各个串珠状工作电极以及对电极以及参比电极等，可以分别经由相应的专用串线与所述多道电化学工作站的相应接口进行联接。所述专用串线是用来将各所述电极与所述多道电化学工作站的各相应接口进行相互联接的专用电缆。所述微流动泵专用于驱动微量液体流动，所述微流动泵可以与按需选定的任意一个所述池状物联通。所述形貌呈串珠状的工作电极，既可以是一体化压制成型的串珠状导电性电极， 也可以是浇注成型的串珠状导电性电极；所述工作电极其结构当然也可以允许是导电性的磁珠串结构，在这一情形下，所述形貌呈串珠状的工作电极其材质是具有导电能力的四氧化三铁材质，以及，所述形貌呈串珠状的工作电极是由许多的四氧化三铁材质的磁珠在外加磁场条件弓I导下相互拼接而成的准一维导电性电极。所述形貌呈串珠状的工作电极，即所述磁珠串结构的工作电极，其结构中的磁珠直径不限，所述磁珠的直径可以是根据需要设定的任意的尺寸，但是，所述磁珠的优选直径范围是介于20纳米至2000纳米之间，以及，每一个所述工作电极的结构中所含有的相互拼接在一起的磁珠的个数可以允许是根据需要设定的任意的个数，所述个数不限，但是，构成一个所述工作电极的磁珠的个数的优选值是在100个至100000个之间。鉴于每一支所述串珠状工作电极占用的空间宽度较小，该工作电极能够允许被直接安置于毛细管通道内，相对窄小的流体通道更有利于展现串珠状电极的对周边流动液体的扰动能力，并且，还有利于将其有效工作界面的潜力充分发挥出来。通过喷涂或点样仪点样或其它合适工艺涂布装设于所述工作电极表面层的所述金胶敏感膜，其膜层厚度可以允许是任意设定的可对待测样液发生电性信号响应的厚度， 但是，推荐的厚度或者说是优选的厚度是介于10纳米与200纳米之间。芯片结构中的所述盖片及基片，其材质可以允许是任何的电绝缘性材质，例如聚丙烯、玻璃，等等，优选的材质是聚甲基丙烯酸甲酯。结构中的所述盖片及基片其宽度可以允许是能够达成相关测试目的的任意设定的宽度值，但是，优选的所述宽度值是均介于2厘米与4厘米之间；所述盖片及基片的长度值也一样可以允许是任意设定的能够达成相关测试目的的长度值，但是，优选的长度值或曰推荐的长度值是介于3厘米与6厘米之间。所述盖片及基片其厚度可以允许是任意设定的便于器件装配的厚度，推荐的厚度或曰优选的厚度是介于0. 5毫米与5毫米之间。较小的厚度有利于节省材料。本案微流控芯片的使用方法采用外加微泵驱动液流在三通道微流控芯片的毛细管通道中稳定流动，利用三通道电化学分析仪器分别对不同亚型SIV诊断抗原加以检测。本案微流控芯片的具体检测使用步骤如下1、在微管路中加入血清样品液，在外加微泵驱动下，各种不同亚型SIV抗原分子被各通道中电极表面上金胶敏感膜包埋的相应的辣根过氧化物酶标记的SIV特异性抗体捕获。2、辣根过氧化物酶标记的SIV特异性抗体与血清样品中的相应的SIV抗原形成免疫复合物。3、采用多通道电化学分析仪，加入邻苯二酚等电子媒介体，采用安培法检测上述反应引起的电流变化，由此获得各种分析物的种类和含量。4、将结果进行综合分析，对不同亚型SIV抗原进行诊断。本发明的优点是，在一块物理器件即微流控芯片上集成了分别包覆有三种不同亚型的猪流感病毒特异性抗体物质的三个串珠状工作电极，该三个串珠状工作电极分别针对三种不同亚型SIV的特征抗原进行检测，本案微流控芯片是一种能够利用多种不同亚型 SIV特异性抗体进行同时检测的微流控芯片，其集成构造的结构特点以及特异的串珠状工作电极形貌有助于提高猪流感病毒诊断效率、降低诊断费用。
图1是本案微流控芯片实施例构造示意图，所展示的是该例结构的俯视角度下的透视的形态，图中未描绘出所述附件，并且，图中也未对所述串珠状工作电极的详细形貌进行放大描绘、展示。图中，1、2、8分别是三个装设位置不同的池状物，3是歧管状流体通道，4、9、12分别是装设位置不同但相互并联形成并联联通结构的三条分支管道，5是装设在分支管道4 内的其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体物质是亚型H1N1猪流感病毒特异性抗体的串珠状工作电极，10是装设在分支管道9内的其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体物质是亚型H3N2猪流感病毒特异性抗体的串珠状工作电极，11是装设在分支管道12内的其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体物质是亚型H1N2猪流感病毒特异性抗体的串珠状工作电极， 6是对电极，7是参比电极。
具体实施例方式在图1所展示的本案实施例中，该器件也即微流控芯片的结构包括贴合装设在一起的两片板状物，两片板状物分别是微流控芯片的盖片以及微流控芯片的基片，在两片板状物之间的相互贴合的位置上装设有管道，以及，三个池状物，该三个池状物分别是池状物 1、池状物2和池状物8，所述管道的一端经由歧管状流体通道3分别与池状物1以及池状物 2联通，所述管道的另一端与余下的一个池状物10联通，以及，依序分别装设在所述管道内不同位置上的串珠状工作电极以及对电极6以及参比电极7，串珠状工作电极由导电性电极以及贴附在所述导电性电极上的包埋了猪流感病毒特异性抗体抗体的金胶敏感膜构成， 所述管道的构造呈并联构造，该呈并联构造的管道由三条分支管道并联构成，该三条分支管道分别是分支管道4以及分支管道9以及分支管道12，且串珠状工作电极的数量是三个， 该三个串珠状工作电极分别是串珠状工作电极5以及串珠状工作电极10以及串珠状工作电极11，其中，串珠状工作电极5是装设在分支管道4内的其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体物质为猪流感病毒特异性抗体H1N1的串珠状工作电极，串珠状工作电极10是装设在分支管道9内的其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体物质为猪流感病毒特异性抗体H3N2 的串珠状工作电极，串珠状工作电极11是装设在分支管道12内的其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体物质为猪流感病毒特异性抗体H1N2的串珠状工作电极。图1中没有绘出作为附件的微流动泵及多道电化学工作站等附属件。本例结构中的各池状物可以根据需要与作为附件的微流动泵按任何方式联通。本例结构中的各串珠状工作电极以及对电极以及参比电极可以分别经由各自专用的电缆或串线分别与作为附件的多道电化学工作站的对应电缆接口或串线接口联接。似乎有必要在这里作一点额外的补充说明抗体与抗原是彼此相关的但又不同的物质，它们之间的相互关系，通俗一点地比喻，就好比是一套锁具中的锁与钥的关系。
权利要求
1.同时检测多种亚型猪流感病毒(Swineinfluenzavires, SIV)的多通道微流控芯片，该微流控芯片的结构包括贴合装设在一起的两片板状物，所述两片板状物分别是微流控芯片的盖片以及微流控芯片的基片，在所述两片板状物之间的相互贴合的位置上装设有管道，以及，三个池状物，管道的一端经由歧管状流体通道分别与其中的两个池状物联通， 管道的另一端与余下的一个池状物联通，以及，依序分别装设在所述管道内不同位置上的工作电极以及对电极以及参比电极，所述工作电极由导电性电极以及贴附在所述导电性电极上的包埋了不同亚型猪流感病毒抗体的金胶敏感膜构成，其特征是，所述管道的构造呈并联构造，所述呈并联构造的管道由三条分支管道并联构成，以及，所述工作电极的数量是三个，该三个工作电极的装设位置分别位于所述三条分支管道内，以及，该三个工作电极其表层金胶敏感膜结构中的特异性抗体分别是对不同亚型猪流感病毒抗原能特异性结合的三种相应猪流感病毒抗体物质，该三种抗体物质分别是猪流感病毒特异性抗体H1NpH3N2及 H1N2，以及，每一个工作电极其形貌均呈串珠状。
2.根据权利要求1所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管状流体通道均为毛细管通道。
3.根据权利要求1所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述形貌呈串珠状的工作电极其材质是具有导电能力的四氧化三铁材质，以及，所述形貌呈串珠状的工作电极是由许多的四氧化三铁材质的磁珠在外加磁场条件引导下相互拼接而成的准一维导电性电极。
4.根据权利要求3所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述磁珠的直径介于20纳米至2000纳米之间，以及，每一个所述工作电极的结构中所含有的相互拼接在一起的磁珠的个数在100个至100000个之间。
5.根据权利要求1所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述金胶敏感膜的厚度介于10纳米与200纳米之间。
6.根据权利要求1所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，结构中的所述盖片及基片其材质均为聚甲基丙烯酸甲酯。
7.根据权利要求1所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，结构中的所述盖片及基片其宽度均介于2厘米与4厘米之间，其长度均介于3厘米与 6厘米之间。
8.根据权利要求1所述的同时检测多种亚型猪流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，结构中的所述盖片及基片其厚度均介于0. 5毫米与5毫米之间。
全文摘要
本发明是涉及分析测试领域，特别是涉及同时检测多种亚型猪流感病毒(Swineinfluenza vires，SIV)的多通道微流控芯片。快速且廉价地诊断SIV是相关诊疗技术进步的目标之一，本发明提供一种指向上述目标的诊断器件。本案要点是，该器件也即微流控芯片内含有呈并联构造的管道，该并联构造含有三条相互并联的分支管道，共有三个串珠状工作电极分别装设在所述三条分支管道内，所述串珠状工作电极由导电性电极以及贴附在所述导电性电极上的包埋了不同亚型SIV特异性抗体的金胶敏感膜构成，该三个串珠状工作电极表层的各自的金胶敏感膜，分别包埋了三种不同亚型SIV特异性抗体物质，该三种不同亚型SIV特异性抗体物质分别是亚型H1N1、H3N2及H1N2。
文档编号G01N27/30GK102478582SQ20111031112
公开日2012年5月30日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者侯建国, 周汉坤, 干宁, 曾少林, 李天华, 李榕生, 杨欣, 金海娟 申请人:宁波大学