一种五加芪口服液的质量检验方法
【专利摘要】本发明提供的五加芪口服液的质量检验方法，包括对五加芪口服液进行定性分析和定量检测，其中定性分析包括采用薄层色谱法对五加芪口服液中的黄芪甲苷和异嗪皮啶分别进行鉴定，定量检测包括对五加芪口服液中的黄芪甲苷含量和总糖含量分别采用高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法进行检测。与灵芪加口服液的质量检验方法相比，本发明的检验方法专属性、重复性、准确性良好，可用于对五加芪口服液的质量进行综合评价，从而有效控制该产品的质量，保证其临床使用的安全、有效和稳定。
【专利说明】-种五加庚口服液的质量检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种五加茂口服液的质量检验方法，该方法 可用于对五加茂口服液的质量进行综合评价。
【背景技术】
[0002] 随着养殖业向集约化和工厂化发展，畜禽对病原微生物的易感性不断增加，病害 频繁发生，为了防治疾病，传统做法是大量使用抗生素类药物，结果使耐药菌株不断增多， 导致畜禽免疫功能急剧下降、生长受阻，抗生素的滥用还导致疫苗接种反应增强，副作用加 大或使免疫接种失败，给养殖业造成很大的经济损失。
[0003] 免疫增强剂是一类单独或与抗原同时使用增强动物机体非特异性和特异性免疫 的物质，目前使用的免疫增强剂种类很多，包括生物性免疫增强剂，如干扰素；化学性免疫 增强剂，如左旋咪哇等，其存在着高剂量产生免疫抑制或对机体有害等缺点，研制开发无毒 害、作用强的新型中药免疫增强剂已成为迫切需要。
[0004] 五加茂口服液由黄茂和刺五加两味中药组成，处方来源于《国家中成药标准》中 的灵茂加口服液，灵茂加口服液由灵芝、黄茂和刺五加；味中药组成，从节约养殖成本上考 虑去除价格昂贵的灵芝，并通过小鼠脾脏淋己细胞增殖试验筛选出黄茂与刺五加的最佳比 例。本处方具有补中益气、扶正巧邪的功能，临床用于提高机体免疫力，配合疫苗使用提高 疫苗免疫效果。临床试验结果表明，五加茂口服液W每升水1ml混饮，连用7日，能够提高 鸡非特异性免疫能力、鸡新城疫和禽流感（H9)抗体水平W及鸡的生产性能。
[0005] 五加茂口服液是根据传统中医理论开发的中药免疫增强剂，尚无质量标准，不利 于控制其质量，为保证临床使用安全、有效和稳定，有必要建立一个完善的质量标准及其检 验方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种五加茂口服液的质量检验方 法。通过建立和实施该检验方法，可增强该药的有效性、质量可控性和稳定性。
[0007] 本发明提供的五加茂口服液的质量检验方法，包括对五加茂口服液进行定性分析 和定量检测，其中定性分析包括采用薄层色谱法对五加茂口服液中的黄茂甲巧和异嗦皮巧 的分别鉴定，定量检测包括对五加茂口服液中的黄茂甲巧含量和总糖含量分别采用高效液 相色谱法和紫外-可见分光光度法进行检测。
[000引本发明中五加茂口服液的处方为；黄茂800g，刺五加200g。
[0009] 本发明的五加茂口服液的质量检验方法包括如下内容：
[0010] 一、黄茂的鉴定
[0011] 由于黄茂甲巧是黄茂的特征化学成分，因此本发明中对五加茂口服液中的黄茂进 行鉴定主要是鉴定其中的黄茂甲巧。采用的鉴定方法为薄层色谱法，包括如下步骤：
[0012] (1)制备待测样品溶液
[0013] 取五加茂口服液3ml，加水27ml，用水饱和的正下醇振摇提取2次，每次20ml，合并 正下醇液，用水洗涂2次，每次20ml，弃去水液，正下醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使之溶解，作 为待测样品溶液。
[0014] (2)制备对照样品溶液
[0015] 取黄茂甲巧对照样品，加甲醇制成每1ml甲醇含0. 5mg黄茂甲巧的溶液，作为对照 样品溶液。
[0016] (3 )采用薄层色谱法鉴定五加茂口服液中的黄茂
[0017] 吸取上述步骤（1)和（2)中的两种溶液各4ul，分别点于同一娃胶G薄层板上，W H氯甲焼-甲醇-水（体积比为13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W 10% (v/v)硫酸己醇溶液，在105C条件下加热至斑点显色清晰。如果待测样品色谱中，在与对 照样品色谱相应的位置上，显示与对照样品相同颜色的斑点，则说明待测样品中含有黄茂 甲巧，即含有黄茂。
[0018] 二、刺五加的鉴定
[0019] 由于异嗦皮巧是刺五加的特征化学成分，因此本发明中对五加茂口服液中的刺五 加进行鉴定主要是鉴定其中的异嗦皮巧。采用的鉴定方法为薄层色谱法，包括如下步骤：
[0020] (1)制备待测样品
[0021] 取五加茂口服液30ml，用H氯甲焼振摇提取2次，每次15ml，合并H氯甲焼液，蒸 干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为待测样品溶液。
[0022] (2)制备对照样品溶液
[0023] 取异嗦皮巧对照样品，加甲醇制成每1ml甲醇含0. 5mg异嗦皮巧的溶液，作为对照 样品溶液。
[0024] (3)采用薄层色谱法鉴定五加茂口服液中的刺五加
[0025] 吸取上述步骤（1)和（2)中的两种溶液各5y 1，分别点于同一娃胶G薄层板上， 氯甲焼-甲醇-水（体积比为19:1:0. 1)为展开剂，展开，取出，瞭干，置于紫外光灯 (365nm)下进行检视。如果待测样品色谱中，在与对照样品色谱相应的位置上，显示与对照 样品相同的蓝色英光斑点，则说明待测样品中含有异嗦皮巧，即含有刺五加。
[0026] H、黄茂甲巧含量的检测
[0027] 由于黄茂是五加茂口服液中的君药，黄茂甲巧是其特征有效成份，药理研究表明 黄茂甲巧具有增强机体免疫力的作用。因此，检测五加茂口服液中黄茂甲巧的含量可W用 于评价五加茂口服液的质量。采用的检测方法为高效液相色谱法，包括如下步骤：
[0028] ( 1)进行色谱条件选择与系统适用性试验
[0029] W十八焼基娃焼键合娃胶为填充剂，W己膳-水(体积比为35:65)为流动相，采用 蒸发光散射检测器检测，理论培板数按黄茂甲巧峰计算应不低于4000。
[0030] (2)制备对照样品溶液
[0031] 取黄茂甲巧对照样品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml甲醇含0.5mg黄茂甲巧的 溶液，即得。
[0032] (3)制备待测样品溶液
[0033] 精密量取五加茂口服液5ml，加水5ml，用水饱和的正下醇振摇提取4次，每次 40ml，合并正下醇液，用氨试液充分洗涂2次，每次约40ml，弃去氨液，将正下醇液蒸干，残 渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0034] (4)检测待测样品中的黄茂甲巧含量
[00巧]分别精密吸取对照样品溶液5 y 1、15 y 1，待测样品溶液10 y 1，注入液相色谱仪， 测定，用外标两点法对数方程计算，即得到待测样品中的黄茂甲巧含量。
[003引四、总糖含量的检测
[0037] 五加茂口服液中总糖含量为刺五加所含糖类成分和黄茂所含糖类成分的总和。由 于刺五加和黄茂都含有多糖和寡糖等糖类成分，现代药理学研究表明该些多糖类和寡糖类 成分均有增强免疫功能的作用。因此，检测五加茂口服液中刺五加和黄茂的总含糖量可W 用于评价五加茂口服液的质量。采用的检测方法为紫外-可见分光光度法，包括如下步骤：
[0038] (1)制备对照样品溶液
[0039] 取无水葡萄糖对照样品适量，精密称定，加水制成每1ml水含无水葡萄糖0. 6mg的 溶液，即得。
[0040] (2)制备待测样品溶液
[0041] 精密量取本品5ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置于 50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0042] (3)检测待测样品中的总糖含量
[0043] 精密量取对照样品溶液与待测样品溶液各2ml，置于25ml量瓶中，精密加入5%苯 酷溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5ml，摇匀，置于水浴中保温15min，取出，置于冰水浴 中冷却3min，加水稀释至近刻度，再置于冰水浴中冷却3min，取出，加水至刻度，摇匀；另量 取水2ml，同上平行操作作为空白对照，采用紫外-可见分光光度法，在490nm波长处测定吸 光度，按外标法W吸光度值计算待测样品中的总糖含量。
[0044] 与灵茂加口服液的质量检验方法相比，本发明的检验方法使用了高效液相色谱法 检测黄茂甲巧含量，并增加了总糖含量的检测方法，同时采用薄层色谱法分别鉴定五加茂 口服液中的黄茂甲巧和异嗦皮巧。该检验方法专属性、重复性、准确性良好，可用于对五加 茂口服液的质量进行综合评价，从而有效控制该产品的质量，保证其临床使用安全、有效和 稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1是实施例2中黄茂鉴定薄层色谱图；
[0046] 图中附图标记如下；1黄茂甲巧；2?4待测样品；5阴性对照。
[0047] 图2是实施例2中刺五加鉴定薄层色谱图；
[0048] 图中附图标记如下；1异嗦皮巧；2?4待测样品；5阴性对照。
[0049] 图3是实施例3中采用高效液相色谱法检测黄茂甲巧含量的专属性试验色谱图。
[0050] 图中附图标记如下；1黄茂甲巧对照样品色谱图；2待测样品色谱图；5阴性对照 色谱图。
【具体实施方式】
[0051] 下面将结合实施例和附图进一步详细说明本发明。
[0052] 实施例1制备五加茂口服液
[0053] 五加茂口服液；处方包括黄茂800g和刺五加200g。
[0054] 制法；将W上2味中药粉碎成最粗粉，加8倍量水，浸泡比，煎煮回流提取化，过 滤，滤渣再加水提取2次，每次加8倍量水并回流提取化，分次过滤，合并滤液，趁热（50? 6(TC )离也，上清液浓缩至相对密度1. 05?1. 08 (《7(TC )，冷藏12?2化，离也，上清液 减压浓缩至相对密度1. 15?1. 23 (《7(TC )，再冷藏12?2化，离也，上清液加纯化水至 1000ml，揽匀，滤过，分装，即得。
[00巧]实施例2五加茂口服液鉴定方法专属性考察 [005引 （1)试剂与样品
[0057] 对照样品：黄茂甲巧，批号；110781-200613,购自中国食品药品检定研究院；异嗦 皮口產，批号；110837-200304,购自中国食品药品检定研究院。
[005引五加茂口服液读施例1制备。
[0059] 阴性对照样品：按照实施例1方法制备各鉴定项阴性对照样品。
[0060] (2)黄茂的鉴定
[0061] 取实施例1制备的样品3ml，加水27ml，用水饱和的正下醇振摇提取2次，每次 20ml，合并正下醇液，用水洗涂2次，每次20ml，弃去水液，正下醇液蒸干，残渣加甲醇1ml 使之溶解，作为待测样品溶液；另取黄茂甲巧对照样品，加甲醇制成每ImL甲醇含0. 5mg黄 茂甲巧的溶液，作为对照样品溶液；按处方配比称取刺五加并按实施例1制备工艺制备样 品作为阴性对照样品，取阴性对照样品同法操作制备阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸 取上述H种溶液各4 y 1，分别点于同一娃胶G薄层板上，氯甲焼-甲醇-水(体积比为 13:7:2)的下层溶液作为展开剂，展开，取出，瞭干，喷W 10% (v/v)硫酸己醇溶液，105C加 热至斑点显色清晰，结果如图1所示。
[006引从图1可见；在与对照样品色谱相应的位置上，待测样品显示相同颜色的斑点，阴 性对照不显示斑点，表明方法专属性良好。
[006引 （3)刺五加的鉴定
[0064] 取实施例1制备的样品30ml，用H氯甲焼振摇提取2次，每次15ml，合并H氯甲焼 液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为待测样品溶液；另取异嗦皮巧对照样品，加甲醇制成 每1ml甲醇含0. 5mg异嗦皮巧的溶液，作为对照样品溶液；按处方配比称取黄茂并按实施例 1制备工艺制备样品作为阴性对照样品，取阴性对照样品同法操作制备阴性对照溶液。照薄 层色谱法试验，吸取上述H种溶液各5 y 1，分别点于同一娃胶G薄层板上，氯甲焼-甲 醇-水(体积比为19:1:0. 1)为展开剂，展开，取出，瞭干，置于紫外光灯（365nm)下检视，结 果如图2所示。
[0065] 从图2可见；在与对照样品色谱相应的位置上，待测样品显示相同的蓝色英光斑 点，阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。
[0066] 实施例3黄茂甲巧含量检测方法学考察
[0067] (1)仪器与试剂、样品 [006引仪器：
[0069] 高效液相色谱仪，e2695型，美国沃特世公司；蒸发光散射检测器，2424型，美国沃 特世公司；电子分析天平，AB135-S型，梅特勒巧利多公司。
[0070] 试剂；己膳为色谱纯冰为二次重蒸水；其他试剂均为分析纯。
[0071] 对照样品：黄茂甲巧，批号；110781-200613,购自中国食品药品检定研究院。
[0072] 五加茂口服液读施例1制备。
[0073] (2)色谱条件
[0074] 色谱柱为 Kromasill00-5C18 柱（150X4. 6mm，5y m);流动相为己膳-水（35:65); 蒸发光散射检测器检测，漂移管温度为6(TC，喷雾器温度为36C ;柱温为3(TC ;流速为 1. Oml/min。
[00巧](3)溶液的制备
[0076] 对照样品溶液的制备精密称取黄茂甲巧对照样品25. 4mg，置于50ml量瓶中，加甲 醇溶解并稀释至刻度，即得。
[0077] 待测样品溶液的制备精密量取实施例1制备的样品5ml，加水5ml，用水饱和的正 下醇振摇提取4次，每次40ml，合并正下醇液，用氨试液充分洗涂2次，每次约40ml，弃去氨 液，正下醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0078] 阴性对照溶液的制备：按照实施例1的制备方法制备缺黄茂的阴性对照样品，取 阴性对照样品，再按照待测样品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，即得。
[0079] (4)专属性试验
[0080] 分别精密吸取对照样品溶液15U 1、待测样品溶液lOy 1、阴性对照溶液lOy 1，注 入液相色谱仪，按上述色谱条件进行试验，记录色谱图，结果如图3所示。从图3可见；待测 样品色谱中黄茂甲巧的保留时间与对照样品一致，而阴性对照在对照样品、待测样品色谱 峰相应的位置上无干扰，方法专属性良好。
[0081] (5)线性范围考察
[008引精密称取黄茂甲巧对照样品25. 4mg，加甲醇制成0. 508mg/ml的溶液，按上述色谱 条件分别进样3y l、5y l、l0y l、15y l、20y 1测定。W峰面积对数（y)为纵坐标，W进样 量对数（X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=l. 4828X+5. 312，r=0. 9991，结果表明， 在1. 524 y g?10. 16 y g范围内，黄茂甲巧峰面积对数与进样量对数有良好的线性关系，数 据见表1。
[0083] 表1线性关系试验结果
[0084]
【权利要求】
1. 一种五加芪口服液的质量检验方法，包括对五加芪口服液进行定性分析和定量检 测，所述定量检测包括检测五加芪口服液中的黄芪甲苷含量以及五加芪口服液中的总糖含 量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述五加芪口服液中总糖含量为五加芪 口服液中的刺五加所含糖类成分和黄芪所含糖类成分的总和。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测总糖含量以无水葡萄糖为对照 样品，采用紫外-可见分光光度法，在490nm波长处测定对照样品和五加芪口服液待测样品 的吸光度，并按外标法以吸光度值计算而得。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测黄芪甲苷含量以黄芪甲苷为对 照样品，采用高效液相色谱法测定。
5. 根据权利要求1?4中任一项所述的方法，其特征在于，所述对五加芪口服液进行定 性分析包括对刺五加进行鉴定和对黄芪进行鉴定。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对刺五加进行鉴定和对黄芪进行鉴 定通过采用薄层色谱法分别鉴定五加芪口服液中的异嗪皮啶和黄芪甲苷。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用薄层色谱法鉴定五加芪口服液 中的异嗪皮啶包括以异嗪皮啶为对照样品，以甲醇为溶剂，以三氯甲烷-甲醇-水为展开 齐U，将对照样品溶液和五加芪口服液待测样品溶液在同一硅胶G薄层板上点样展开，并置 于紫外光灯下进行检视。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述展开剂中三氯甲烷-甲醇-水的体积 比为 19:1:0. 1。
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用薄层色谱法鉴定五加芪口服液 中的黄芪甲苷包括以黄芪甲苷为对照样品，以甲醇为溶剂，以三氯甲烷-甲醇-水为展开 齐U，将对照样品溶液和五加芪口服液待测样品溶液在同一硅胶G薄层板上点样展开，并喷 以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于1所述展开剂中三氯甲烷-甲醇-水的体 积比为13:7:2。
【文档编号】G01N21/31GK104422663SQ201310384903
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】张许科, 刘兴金, 张晓会 申请人:洛阳惠中兽药有限公司