一种中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，包括以下步骤：(1)选取中药材，采用低压煎煮，煎煮结束后，得中药材煎煮液；(2)取步骤(1)中的中药材煎煮液，采用中国药典2010年版的高效液相色谱法，对中药材煎煮液中的功效成分进行定性定量分析；(3)取步骤(1)中的中药材煎煮液，采用顶空-固相微萃取法提取中药材煎煮液中的挥发物，采用气相色谱-嗅闻-质谱法对中药材煎煮液中的挥发物的特征赋予气味活性化合物进行定性定量分析和鉴定。该方法煎煮效率高，能快速、高效的定性定量检测中药材中的功效成分和气味活性化合物。
【专利说明】一种中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材【技术领域】，具体涉及一种中药材成分的快速高效溶出与溶出成 分的分析鉴定方法。 技术背景
[0002] 1、中药材的功效成分及挥发性成分
[0003] 中药材除了含有丰富的基本营养素（即蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质）之 夕卜，还含有种类繁多的具有特殊功效的物质。这些功效物质是中药材功效性能的重要物质 基础，在很大程度上决定了中药材的品质。中药材品种繁多，但不同品种间有效成分的差 别悬殊，同一品种的有效成分还受产地、栽培方法、生长环境以及采收季节等多种因素的影 响，所以对于中药材功效成分的分析就显得尤为重要。目前的研究大多集中在对中药材本 身（不同产地、不同药物部位等）功效成分的含量上，但是对于中药煎煮液溶出成分中的功 效成分含量研究的报道较少。功效物质是药膳性能的物质基础，因此，我们以药膳中功效物 质的含量作为衡量标准。
[0004] 中药材中的挥发性成分统称为挥发油。它是存在于植物体中的一类具有挥发性、 可以在水蒸气作用下被蒸馏出来的油状液体总称。一种挥发油可能含有不同类型的几十种 到一、二百种成分，其中某种或数种成分占较大的分量。挥发油基本组成为脂肪族、芳香族 和萜类化合物等，萜类主要是单萜和倍半萜，通常它们含量较高，但无香气，不是挥发油的 芳香成分；某些萜类的含氧衍生及芳香族化合物含量虽少，但它们具有挥发油的特异芳香 味和显著的生物活性。另外还有一些其它化合物，如：含硫化合物、含氮和含硫化合物也是 一些挥发油的组成部分。中药煎煮液的风味化合物中，除了包括中药中的一些带有芳香气 味的挥发油成分，还包括一些醛类、酮类等在传统食品中存在的风味化合物。独特的风味是 药膳/中草药受消费者喜欢的重要因素，药膳/中草药的风味是由其特征赋予气味活性化 合物的种类和多少决定的。
[0005] 目前，对于中药材中功效成分和挥发性物质的溶出方法通常采用传统的常压加热 煎药方法，煎煮效果极大的依赖于煎煮操作人的熟练程度，煎煮过程繁琐，煎药时间较长， 无法在短时间内较为彻底地提取功效成分和挥发性物质中的特征赋予气味活性化合物，同 时，功效物质和气味活性化合物会随水蒸气挥发发生损失，煎煮耗能多，气味散发会导致周 围充满中药味道，煎煮容器清洁困难，此外，溶出成分上机前需要进行萃取、浓缩等前处理， 前处理一般较为繁琐。在操作过程中，可能会对煎煮液中的目标成分造成损失，导致最终测 定结果出现偏差。
[0006] 2、中药材中功效成分的分析方法研究
[0007] (1)气相色谱分析方法（GC):气相色谱法是有机物分析的最有效的手段之一，被 广泛地应用于中药有效成分的分析中。主要用于沸点不太高、热稳定性好、分子量小于400 的成分的分析，对于其他的样品，则需要进行适当的衍生化处理，以改善其挥发性、选择性 或分离状况。
[0008] (2)高效液相色谱分析法（HPLC) :HPLC的适用范围较广，可用于分析高沸点、热敏 性、大分子量的样品，是一种非常有效和普遍适用的中药有效成分的分析方法。根据许多中 药成分在紫外区有吸收的原理，在高效液相色谱中，二极管阵列检测器、紫外检测器是常用 的检测器。
[0009] (3)薄层色谱分析法（TLC) :TLC是一种微量分析方法，由于该方法操作简便，不需 要昂贵的仪器设备，样品用量少，检测灵敏度高，分析速度快，分离效能高，在20世纪60年 代中期就受到了极大的重视并被广泛应用，这为该技术的发展奠定了基础。据初步统计， TLC法在《中华人民共和国药典》中的应用情况不断增加，显示了该方法的简便、快速、实用 等特点。
[0010] ⑷高效毛细管电泳分析法（HPCE) :HPCE以高压下产生的强电场为驱动力，以小 内径的石英毛细管为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离。毛 细管电泳近年来在中药有效成分的分析中得到了广泛的应用。
[0011] (5)超临界流体色谱分析法（SFC) :SFC是以超临界流体做流动相进行分析的一种 色谱技术，它作为GC和HPLC的补充，不仅有比GC和HPLC更宽的分析范围，而且所有GC和 HPLC常用的检测器均可作为SFC检测器。
[0012] (6)质谱联用技术分析法：质谱（MS)是分析纯有机化合物的最强有力的分析工 具，质谱在检出峰的同时还能给出分子量和结构信息，使检测具有二维性。液-质联用 (LC-MS)和毛细管电泳-质谱联用（CE-MS)发展迅速，已成为中药有效成分分析的常规方 法。
[0013] (7)红外光谱（IR)和拉曼光谱（Raman)分析法：利用傅立叶变换拉曼光谱技术 (FT-Raman)和漫反射傅立叶变换红外光谱技术（DF-FTIR)可以直接快速地鉴别生药材，利 用漫反射傅立叶变换近红外光谱技术可以无损定量分析中药材的组分含量。
[0014] 综上所述，在中国药典2010年版中，中药材中功效成分的检测多为高效液相色谱 法，但是如果中药材煎煮手段不同，其溶出成分中的功效成分是否与传统相同，还需要进一 步采用高效液相色谱法进行研究和探索。
[0015] 3、中药材中挥发性化合物的分析方法研究
[0016] (1)气质联用法（GC-MS)
[0017] 对样品中挥发物的分析，气相色谱-质谱法（GC-MS)是最为常用的方法，利用气相 色谱强大的分离作用将样品混合气味物质分离，利用质谱将分离的气味物质打成碎片，形 成图谱，进行谱库检索，鉴定未知物。
[0018] (2)气相色谱-嗅闻（GC-O)法
[0019] 气相色谱-嗅闻（GC-O)技术是近年来兴起的，它对食品香气的研究特别有效。一 些气相色谱-嗅闻技术如 CHARM(Combined hedonic aroma response measurement)分 析、香气提取物稀释分析（aroma extract dilution analysis, AEDA)、OSME分析以及检测 频率（detection frequency)分析等被用来对食品中气味活性化合物（aroma-active or odor-active)的鉴定和重要性排序。GC-O技术现在已经成为了一种被广泛使用的方法，它 将气相色谱的高效分离能力与人类鼻子敏感的嗅觉结合在一起。GC-O被称为"the state of the art",即目前最顶尖、最先进的技术。
[0020] 但目前还未有文献公开有采用气相色谱-嗅闻-质谱法来检测中药材溶出成分中 的特征赋予气味活性化合物。
[0021] 因此，现有技术中对于中药材中的功效物质和挥发性物质中的特征赋予气味活性 物质的溶出方法的研究，一般是采用传统水煎煮的方式，该方法存在煎药时间较长，无法在 短时间内较为彻底地提取功效成分和气味活性化合物等问题。此外，溶出成分上高效液相 色谱和气相色谱-嗅闻-质谱检测前需要进行前处理，前处理一般较为繁琐，在操作过程 中，可能对煎煮液中的目标成分造成损失，导致最终测定结果出现偏差；而目前也未有文献 公开采用气相色谱-嗅闻-质谱法来检测中药材溶出成分中的特征赋予气味活性化合物。
【发明内容】
[0022] 本发明所要解决的技术问题是提供一种中药材成分的快速高效溶出与溶出成分 的分析鉴定方法，该方法中中药材成分的快速高效溶出采用低压煎煮方法，低压煎煮方法 煎煮时间短，煎煮效率高，采用高效液相色谱法定性定量检测溶出成分中的功效物质和采 用气相色谱-嗅闻-质谱法定性定量检测中药材溶出成分中的特征赋予气味活性化合物， 效率高。
[0023] 本发明的上述技术问题可以通过以下技术方案来实现：一种中药材成分的快速高 效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，包括以下步骤：
[0024] (1)选取中药材，采用低压煎煮，煎煮结束后，得中药材煎煮液；
[0025] (2)取步骤（1)中的中药材煎煮液，采用中国药典2010年版的高效液相色谱法，对 中药材煎煮液中的功效成分进行定性定量分析；
[0026] (3)取步骤⑴中的中药材煎煮液，采用顶空-固相微萃取法提取中药材煎煮液中 的挥发物，采用气相色谱-嗅闻-质谱法对中药材煎煮液中的挥发物的特征赋予气味活性 化合物进行定性定量分析和鉴定。
[0027] 在上述中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的鉴定方法中：
[0028] 步骤⑴中所述的低压煎煮的煎煮压强优选为0?IOlkPa但不包括OkPa。以煎 煮压强约为55kPa时，煎煮效率更高。
[0029] 步骤⑴中所述的低压煎煮的温度优选为50?120°C，时间优选为5s?lh。煎 煮温度为1〇〇?120°C时，煎煮效率更高。
[0030] 所述的低压煎煮采用的溶剂优选为水，所述的中药材与水的用量关系优选为Ig : 20 ?50mL。
[0031] 步骤（1)中的中药材的粒径优选为24?1000目。当中药材粒径为24?1000目 时，颗粒溶胀充分无结块，适合用于试验。
[0032] 本发明步骤（1)中煎煮采用低压环境煎煮中药，一方面提高了煎煮效率，缩短了 煎药时间，实现了在较短时间内提取功效成分和气味活性化合物的目的；另一方面，上机前 样品的前处理过程简单易行，传统的前处理过程，需要萃取、浓缩等复杂工艺，而本发明中 在高效液相色谱对中药煎煮液功效成分的分析时，大部分的煎煮液样品过膜后直接进样即 可，不仅能最大程度地减少目标成分的损失，还可以节约传统分析方法的前处理时间。
[0033] 步骤（2)中采用中国药典2010年版的高效液相色谱法，对中药材煎煮液中的功效 成分进行定性定量分析时，设置高效液相色谱的参数优选为=HPLC系统配备G1322A真空在 线脱气系统，G1311A四级泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱及G131? DAD检测器，色 谱柱为Agilent SB-C18色谱柱。
[0034] 步骤（2)中采用保留时间比对和标准化合物验证这两种鉴定方式对中药材中的 功效成分进行定性定量分析。
[0035] 步骤（3)中采用顶空-固相微萃取法提取中药材煎煮液中的挥发物时，固相微萃 取法的萃取头优选采用PDMS/DVB/CAR三涂层萃取头。
[0036] 本发明步骤（3)中采用顶空-固相微萃取法提取中药材煎煮液中的挥发物时，优 选的实施例之一可以是：取20mL的中药煎煮液，在60°C条件下平衡20min，采用PDMS/DVB/ CAR三涂层萃取头吸附40min。
[0037] 相比传统的溶剂萃取法，采用顶空-固相微萃取方法具有操作简单、无后生物形 成、萃取效果较好等优点；且无需大量溶剂，萃取时间短，萃取效率高。
[0038] 步骤（3)中采用气相色谱-嗅闻-质谱法对中药材煎煮液中的挥发物的特征赋予 气味活性化合物进行定性定量分析时，气相色谱的参数优选为：色谱毛细管柱为DB-WAX， 起始温度优选为40°C，保持3min，然后优选为以5°C /min的升温速度升温到200°C，再优 选为以10°C /min的升温速度升温到230°C保持3min，载气为氦气，恒定流速优选为I. 2mL/ min，进样口温度优选为250°C，压力优选为14. 87psi，分流比优选为1:1 ;质谱参数为：电子 轰击离子源，电子能量优选为70eV，传输线温度优选为280°C，离子源温度优选为230°C，四 极杆温度优选为150°C，溶剂延迟优选为3min，质量扫描范围m/z优选为55?500 ;嗅觉检 测器的参数为：接口温度优选为200°C。
[0039] 步骤（3)中采用线性保留指数比对、气味特性、NIST谱库检索和标准化合物验证 这四种鉴定方式对中药材中的特征赋予气味活性化合物进行分析和鉴定。
[0040] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0041] (1)本发明中采用低压环境煎煮中药，提高了煎煮效率，缩短了煎药时间，实现了 在较短时间内提取功效成分和气味活性化合物的目的；
[0042] (2)本发明采用低压环境煎煮中药，溶出成分上机前前处理简单易行，能最大程度 的减少目标成分的损失，高效液相色谱对中药煎煮液功效成分的分析，大部分可以采用煎 煮液过膜后直接进样的方法，这与一般前处理过程（如萃取、浓缩等）相比，不仅能最大程 度地减少目标成分的损失，而且节约了传统分析方法的前处理时间；
[0043] (3)本发明针对中药材煎煮液中的挥发物，采用顶空-固相微萃取方法具有操作 简单、无后生物形成、萃取效果较好等优点；且无需大量溶剂，萃取时间短，萃取效率高；
[0044] (4)本发明通过利用低压煎煮法对中药成分进行快速高效溶出，采用高效液相色 谱法对中药煎煮液中的功效成分进行分析，采用气相色谱-嗅闻-质谱法（GC-O-MS)对中 药煎煮液中的特征赋予气味活性化合物进行定性定量分析，为中药及药膳的方便食用开辟 了新的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1是实施例1中传统煎煮方法西洋参煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0046] 图2是实施例1中采用本发明低压煎煮方法西洋参煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0047] 图3是实施例1中西洋参煎煮液的HPLC-DAD色谱图；
[0048] 图4是实施例2中传统煎煮方法当归煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0049] 图5是实施例2中采用本发明低压煎煮方法当归煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0050] 图6是实施例2中当归煎煮液的HPLC-DAD色谱图；
[0051] 图7是实施例3中传统煎煮方法菊花煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0052] 图8是实施例3中采用本发明低压煎煮方法菊花煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0053] 图9是实施例3中菊花煎煮液的HPLC-DAD色谱图；
[0054] 图10是实施例4中传统煎煮方法黄芪煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0055] 图11是实施例4中采用本发明低压煎煮方法黄芪煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0056] 图12是实施例4中黄芪煎煮液的HPLC-DAD色谱图；
[0057] 图13是实施例5中传统煎煮方法金银花煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0058] 图14是实施例5中采用本发明低压煎煮方法金银花煎煮液GC-O-MS总离子流图；
[0059] 图15是实施例5中金银花煎煮液的HPLC-DAD色谱图；
[0060] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0061] 实施例1西洋参成分的快速高效溶出与鉴定方法
[0062] 对西洋参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1这3种主要药效成分的 含量进行高效液相色谱测定。西洋参的所有挥发性组分中，含量最高的为（Z)-9-十七 烯-4, 6-二炔-8-醇，它是不饱和醇类化合物，醇类及含有不饱和键的化合物具有抗氧化和 清除自由基的作用。其次较高的成分是留醇类化合物，在西洋参中含量为19. 05%，具有降 低血清胆固醇、抗癌和抗衰老作用。采用固相微萃取法萃取西洋参煎煮液中挥发成分，使用 高效液相色谱法分析其中的功效成分，再使用气相色谱-嗅闻-质谱技术定性定量分析出 其中的关键气味活性化合物。
[0063] 1、材料
[0064] (1)样品西洋参
[0065] (2)试剂与仪器
[0066] 标准参考化合物均购自美国Sigma公司，色谱纯。
[0067]中药材中功效成分的分析，采用中国药典2010年版上的高效液相色谱法。
[0068] 中药材功效成分的分析仪器是：HPLC系统配备G1322A真空在线脱气系统，G131IA 四级泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱及G131? DAD检测器。
[0069] 气相色谱-嗅闻-质谱仪：气-质联用仪器型号，7890A-7000B (三重四级杆质谱 仪-QQQ)，购自美国Agilent公司；嗅味检测仪：Sniffer 9000,购自瑞士 Brechbiihler公 司；色谱柱：DB-Wax(30mX0. 25mmX0. 25iim)，购自美国J&W公司；手动进样手柄购自美国 Supelco公司；SPME萃取针头（DVB/CAR on PDMS)购自美国Supelco公司；顶空瓶（40mL) 购自美国QEC公司。
[0070] 2、分析条件
[0071] (1)中药煎煮液中功效成分的分析条件
[0072] HPLC系统配备G1322A真空在线脱气系统，G1311A四级泵，G1329A自动进样器， G1316A柱温箱及G131? DAD检测器，色谱柱为 Agilent SB-C18 (5 ii m，4. 6X 250mm)色谱柱， 柱温控制为30°C，流动相为乙腈和0. I %质量分数的磷酸溶液，流速为lmL/min，DAD检测波 长为203nm，采用乙腈-水溶液梯度洗脱，如表1。
[0073] 表1梯度洗脱程序
[0074]
【权利要求】
1. 一种中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其特征在于包括以下 步骤： (1) 选取中药材，采用低压煎煮，煎煮结束后，得中药材煎煮液； (2) 取步骤（1)中的中药材煎煮液，采用中国药典2010年版的高效液相色谱法，对中药 材煎煮液中的功效成分进行定性定量分析； (3) 取步骤（1)中的中药材煎煮液，采用顶空-固相微萃取法提取中药材煎煮液中的挥 发物，采用气相色谱-嗅闻-质谱法对中药材煎煮液中的挥发物的特征赋予气味活性化合 物进行定性定量分析和鉴定。
2. 根据权利要求1所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其 特征在于：步骤（1)中所述的低压煎煮的煎煮压强为0?lOlkPa但不包括OkPa。
3. 根据权利要求1或2所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方 法，其特征在于：步骤（1)中所述的低压煎煮的温度为50?120°C，时间为5s?lh。
4. 根据权利要求3所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法， 其特征在于：所述的低压煎煮采用的溶剂为水，所述的中药材与水的用量关系为lg :20? 50mL〇
5. 根据权利要求1所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其 特征在于：步骤（2)中采用中国药典2010年版的高效液相色谱法，对中药材煎煮液中的功 效成分进行定性定量分析时，设置高效液相色谱参数为：HPLC系统配备G1322A真空在线脱 气系统，G1311A四级泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱及G131? DAD检测器，色谱柱 为 Agilent SB-C18 色谱柱。
6. 根据权利要求1所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其 特征在于：步骤（2)中采用保留时间比对和标准化合物验证这两种鉴定方式对中药材中的 功效成分进行定性定量分析。
7. 根据权利要求1所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其 特征在于：步骤（3)中采用顶空-固相微萃取法提取中药材煎煮液中的挥发物时，固相微萃 取法的萃取头采用PDMS/DVB/CAR三涂层萃取头。
8. 根据权利要求1所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其 特征在于：步骤（3)中采用气相色谱-嗅闻-质谱法对中药材煎煮液中的挥发物的特征赋 予气味活性化合物进行定性定量分析时，气相色谱的参数为：色谱毛细管柱为DB-WAX，起 始温度40°C，保持3min，然后以5°C /min的升温速度升温到200°C，再以10°C /min的升温速 度升温到230°C保持3min，载气为氦气，恒定流速为1. 2mL/min，进样口温度250°C，压力为 14. 87psi，分流比为1:1 ;质谱参数为：电子轰击离子源，电子能量70eV，传输线温度280°C， 离子源温度为230°C，四极杆温度为150°C，溶剂延迟3min，质量扫描范围m/z55?500 ;设 置嗅觉检测器参数为：接口温度为200°C。
9. 根据权利要求1所述的中药材成分的快速高效溶出与溶出成分的分析鉴定方法，其 特征在于：步骤（3)中采用线性保留指数比对、气味特性、NIST谱库检索和标准化合物验证 这四种鉴定方式对中药材中的特征赋予气味活性化合物进行分析和鉴定。
【文档编号】G01N30/02GK104359987SQ201410592257
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】宋焕禄, 杨辉, 周艳, 李泽仟, 林锦 申请人:无限极（中国）有限公司