一种舒肝丸的含量测定方法与流程

本发明涉及到一种舒肝丸的含量测定方法，属中药技术领域。具体的，涉及一种舒肝丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷四种成分同时测定的含量测定方法。

背景技术：

舒肝丸为理气剂，具有舒肝和胃，理气止痛之功效。主治肝郁气滞，胸肋胀满，胃脘疼痛，嘈杂呕吐，嗳气泛酸。该药物由川楝子、醋延胡索、片姜黄、白芍(酒炒)、沉香、枳壳(炒)、木香、砂仁、陈皮、豆蔻仁、茯苓、姜厚朴、朱砂组成，药效明确。舒肝丸(大蜜丸)标准最早收录在《中国药典》1985年版，2000年版中增加水蜜丸规格，2005年版增加水丸规格，并对标准进行修订，检验内容同现行标准，2010年版第二增补本中增加小蜜丸规格，检验内容同《中国药典》2005年版，未作修定。该药物现行标准为《中国药典》2015年版，记载了该药物的处方、制法及质量控制方法。该药物所含药味多，《中国药典》2015年版中的含量测定项中，样品经过复杂的处理过程后，仅对白芍中芍药苷进行了含量测定，舒肝丸处方中陈皮中橙皮苷、枳壳中柚皮苷、新橙皮苷等成分在药材中含量较高，但并未进行测定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种同时测定舒肝丸中芍药苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷四种成分含量的方法。

本发明含量测定方法采用高效液相色谱法，该方法如下：

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％-0.10％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-40分钟，流动相A由15％渐变至25％；检测波长为210-240nm；流速为1ml/min，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000-10000；

对照品溶液的制备 取芍药苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备 取舒肝丸，取样量0.5-1.2g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流70-100分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明含量测定方法中，流动相B优选为0.05％磷酸；检测波长优选为230nm；理论板数优选为按芍药苷峰计算应不低于8000；取样量优选为0.8g；测定法中分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液的量优选为5μl，注入液相色谱仪。

为了验证测定含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适应性，对方法进行了以下方法学验证试验，以确保该含量测定方法可以作为舒肝丸的质量控制。

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪：Waters e2695；色谱柱：Thermo Accliam(5μm，4.6mm×250mm)；电子天平：Mettler AE163；Mettler AE240；超纯水仪：Integral 10(Millipore)。

1.2试药与试剂

对照品：芍药苷(批号：110736-201035，含量96.4％)、柚皮苷(批号：110722-201111)、橙皮苷(批号：110721-201014，含量95.3％)、新橙皮苷(批号：111857-201102，含量99.6％)购自中国食品药品检定研究院；制备阴性对照用药材：川楝子、醋延胡索、白芍(酒炒)、片姜黄、木香、沉香、豆蔻仁、砂仁、姜厚朴、陈皮、枳壳(炒)、茯苓、朱砂均购自市场，经河北省药品检验研究院主任药师段吉平鉴定为正品。

试剂：甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2方法确定

2.1色谱条件的确定

2.1.1测定波长的选择 分别称取芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，用甲醇溶液配制成适宜浓度的对照品溶液，在200nm～400nm进行光谱扫描。结果表明，芍药苷在232nm波长附近有最大吸收，橙皮苷在213、282nm波长附近有最大吸收，柚皮苷、新橙皮苷在225、282nm波长附近有最大吸收。282nm波长下，芍药苷紫外吸收极低，在确保测定值的准确性的基础上，为方便实验，选择四个成分均有较大吸收的210-240nm作为测定波长，此波长下各待测成分与杂质峰分离良好，阴性无干扰，其中230nm测定更优。采用芍药苷最大吸收波长处测定数据与按选定波长测定数据进行比较，结果两者基本一致，见表1。

表1不同波长处各待测成分的含量测定结果对比

2.1.2流动相的选择

样品处方中药味多，成分复杂，杂质多，性质相近的成分多，流动相以甲醇作有机相时，未能得到良好分离，结合提取方法考察及色谱条件的考察，最终选择乙腈作为有机相，梯度洗脱，根据各待测成分的极性及出峰时间，将梯度初始比例设为乙腈-0.05％磷酸溶液(15∶85)，梯度洗脱表见表2，分离良好。

表2梯度洗脱表

2.2对照品溶液的制备

2.2.1配制对照品溶剂的选择

供试品溶液的溶剂为甲醇溶液，故对照品溶液的稀释选择甲醇溶液。

2.3供试品溶液的制备方法确定

2.3.1提取方法的初选

供试品溶液的制备方法1(现标准方法) 取舒肝丸适量，剪碎，混匀，取1g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率260W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精蜜量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水5ml使溶解，通过GDX-201型大孔吸附树脂柱(内径为0.9cm，柱高为12cm)，用30％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备方法2 取舒肝丸适量，剪碎，混匀，取1g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率260W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果：方法1得到的供试品溶液色谱峰较少，难以选择待测成分进行多成分含量测定方法的探索。而且不同品牌GDX-201型大孔吸附树脂对样品测定结果影响较大。方法2得到的供试品溶液色谱峰较多，且各色谱峰之间分离良好，因此初步选择方法2。

2.3.2取样量的考察

取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)，分别精密称取0.5g、0.8g、1.2g，按正文方法试验。结果表明三种取样量所得含量基本无差别，在保证色谱峰面积合适的前提下并使提取充分，选择取样量为0.8g(见表3)。

表3取样量考察结果

2.3.3提取方式的考察

取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)适量，分别超声处理(功率400W，频率40kHz)90分钟、加热回流90分钟，按拟定色谱条件测定。结果表明加热回流比超声处理提取率略高，故选择加热回流的提取方式，见表4。

表4不同提取方式的含量测定结果

2.3.4提取时间的考察

取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)适量，分别加热回流30min、45min、60min、90min、120min，按拟定色谱条件测定。结果表明基本无差别，为确保提取完全，选择加热回流90min，见表5。

表5不同提取时间的含量测定结果

2.3.5提取溶剂的考察

取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)适量，分别以50％、70％的甲醇溶液、甲醇、稀乙醇为提取溶剂，按拟定色谱条件测定。结果表明以甲醇为提取溶剂，所测得待测成分含量较高，因此选择甲醇作为提取溶剂，见表6。

表6不同提取溶剂的含量测定结果

3方法学考察

3.1专属性试验

按处方比例和制法分别制备不含白芍、陈皮、枳壳的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液，按正文方法测定，并在二极管阵列检测器上分析色谱峰纯度。结果表明，方中其他药味不干扰芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定，色谱图见图1，峰纯度见图2。

3.2线性关系考察

精密量取混合对照品溶液(芍药苷浓度0.03898mg/ml、柚皮苷浓度0.04520mg/ml、橙皮苷浓度0.04487mg/ml、新橙皮苷浓度0.04705mg/ml)2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液II。精密量取混合对照品溶液II 5μl、10μl，混合对照品溶液5μl、10μl、25μl注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，记录峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，对照品的峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。结果芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷线性方程分别为y＝1.269×106x+1727.45、y＝2.128×106x+5288.04、y＝1.99×106x+4370.25、y＝2.123×106x+5287.15；线性范围分别为0.03898～0.9476μg、0.0452～1.13μg、0.04487～1.1217μg、0.04705～1.1763μg；相关系数均为0.9999，表明待测成分线性关系良好。实验结果见表7。

表7各待测成分线性关系考察结果

3.3重复性试验

取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)，剪碎，分别称取0.64g、0.8g、0.96g各三份，精密称定，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按正文方法测定。结果表明，本方法重复性良好(结果见表8)。

表8重复性试验结果

3.4回收率试验

取已知含量的样品(大蜜丸，批号：4015087，含量见重复性结果)，剪碎，取9份，每份约0.4g，精密称定，每三份为一组，分别精密加入用溶液配制的低、中、高三个浓度的混合对照品溶液25ml，低浓度(芍药苷：0.01170mg·ml^-1；柚皮苷：0.01808mg·ml^-1；橙皮苷：0.01795mg·ml^-1；新橙皮苷：0.01882mg·ml^-1)；中等浓度(芍药苷：0.01559mg·ml^-1；柚皮苷：0.0226mg·ml^-1；橙皮苷：0.02243mg·ml^-1；新橙皮苷：0.02353mg·ml^-1)；高浓度(芍药苷：0.01949mg·ml^-1；柚皮苷：0.02712mg·ml^-1；橙皮苷：0.02692mg·ml^-1；新橙皮苷：0.02823mg·ml^-1)。按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，按正文方法测定，计算回收率。结果表明本方法回收率良好。见表9～12。

表9芍药苷回收率试验结果

表10柚皮苷回收率试验结果

表11橙皮苷回收率试验结果

表12新橙皮苷回收率试验结果

3.5稳定性试验

取同一供试品溶液，于0小时开始测定，以后间隔一段时间测定一次，记录峰面积。结果RSD分别为1.1％、1.3％、0.9％、1.0％，表明供试品溶液至少在20小时内稳定(结果见表13)。

表13供试品溶液稳定性试验结果

3.6耐用性试验

参照《中国药典》2010年版一部，对方法进行了不同品牌的色谱柱、柱温、流速的耐用性进行考察，并计算含量。结果表明，采用三种品牌色谱柱及各项色谱条件的微小变化下色谱峰均分离较好，测定结果基本一致，方法的耐用性较好。(见表14)

表14耐用性考察

注：色谱柱I：Thermo Acclaim C18，4.6×250mm，5μm；

II：Shim-pack lnertsil ODS-3，4.6×250mm，5μm；

III：Boston Green ODS，4.6×250mm，5μm

4样品测定与限度制定

取小蜜丸2批、大蜜丸25批，按正文方法测定，结果见表16、17。

表15样品测定结果(小蜜丸)

表16样品测定结果(大蜜丸)

附图说明

图1方法专属性试验色谱图(A、混合对对照品；B、样品；C、D、E分别为白芍、陈皮、枳壳阴性样品)(各色谱峰1为芍药苷，2为柚皮苷，3为橙皮苷，4为新橙皮苷)；

图2各待测成分色谱峰纯度(A为芍药苷，B为柚皮苷，C为橙皮苷，D为新橙皮苷)；

具体实施方式

实施例1

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-40分钟，流动相A由15％渐变至25％；检测波长为230nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；

对照品溶液的制备 取芍药苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备 取舒肝丸，取样量0.8g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例2

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.08％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-40分钟，流动相A由15％渐变至25％；检测波长为240nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于9000；

对照品溶液的制备 取芍药苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备 取舒肝丸，取样量0.5g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例3

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.10％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-40分钟，流动相A由15％渐变至25％；检测波长为210nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于10000；

对照品溶液的制备 取芍药苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备 取舒肝丸，取样量1.2g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

实施例4

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为0-40分钟，流动相A由15％渐变至25％；检测波长为232nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于10000；

对照品溶液的制备 取芍药苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备 取舒肝丸，取样量1.0g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

上述实施例均按照药典要求进行方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求。