一种基于单通道的多色超分辨显微系统及方法与流程

本发明涉及光学仪器领域、生物医学显微成像领域，具体涉及一种基于单通道的多色超分辨显微系统及方法。

背景技术：

目前在生物医药领域的研究对分辨率的要求越来越高，研究人员需要了解各种微小形态物质的三维结构，然而传统白光宽场显微镜和激光共聚焦显微镜的光斑尺寸无法达到这样的分辨率，而超分辨显微系统的出现完美地解决了这个问题。在超分辨显微技术中，目前的研究热点大多集中于各类荧光显微技术方面，诸如受激发射损耗(STED)荧光显微技术和单分子定位荧光显微镜(SMS)等。其中，STED系统中有激发光和损耗光两类光，在激发光斑和中空损耗光斑的叠加的区域，受到损耗的荧光粒子失去发射荧光光子的能量，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的发光点。基于该原理，STED系统中的损耗光必须位于荧光的光谱范围内才能对受激辐射的光斑进行擦除。

通常对于该类超分辨显微系统而言，如果要同时实现对不同细胞或组织进行观测，就必须采用不同的荧光染料分别对细胞进行标定，通过双色或多色成像来实现观测。为了实现双色或多色的成像观测，可以引入多个损耗光，分别抑制不同荧光染料的受激发射光，如Gerald Donnert等人于2007年在期刊Biophysical Journal上发表的文章《Two-Color Far-Field Fluorescence Nanoscopy》中提及的，这种方法可以较好的实现双色成像，然而引入多个损耗光的情况，势必会增加系统的复杂性以及制作成本。为了简化多色成像系统，Jan等人于2011年在期刊Biophysical Journal上发表的文章《Two-Color STED Microscopy of Living Synapses Using A Single Laser-Beam Pair》。文章中提出用一束激发光激发两种荧光染料，并用一束损耗光对这两种荧光染料的荧光进行消光。由于受损耗光波长的限制，可以用于多色标定的荧光染料的种类非常有限，因此荧光染料的受激发射波长比较接近。该种结构在实际使用过程中利用带通滤波片对不同荧光染料的受激发射光进行滤波，使得不同波长的受激发射光被不同的成像器件收集。一方面，由于STED可选荧光染料的受激发射波长比较接近，为了较好的滤波，通常会选择窄带滤光片，然而窄带滤光片会造成光能较大的损耗；另一方面，如果选择的带通滤波片的带宽较大，不同荧光染料的受激发射波长就会发生串扰，并引入背景噪声，为后期数据处理增加负担。因此，现有的双色或多色超分辨显微系统并不能很好的满足实际的需求。

技术实现要素：

本发明针对之前多色超分辨显微系统中存在的串扰或结构复杂等问题，提出了一种新型的基于单通道的多色超分辨显微系统。该系统可利用单个损耗光实现对多色样品进行观察，并且能量利用率高，背景噪声小。

本发明还提供了一种新型的基于单通道的多色超分辨显微方法，利用该方法可利用单个损耗光实现对多色样品的观察，能量利用率高，实用性强。

一种基于单通道的多色超分辨显微系统，包括损耗光源、第一准直单元、位相板、第一激发光源、第一二色镜、第二准直单元、半波片、偏振分束镜、第二激发光源、第一探测器、第二二色镜、透镜-针孔-透镜组、第三二色镜、扫描镜、第二探测器、第三准直单元、四分之一波片、显微物镜和样品台；

所述损耗光源依次经过所述第一准直单元、位相板到达偏振分束镜的一个入射面；所述第一激发光源发出的激发光束与第二激发光源发出的激发光束在第一二色镜处合束，合束光依次通过第二准直单元、半波片后，到达偏振分束镜的另一个入射面；所述合束光与损耗光束在偏振分束镜合束后，经过所述第三二色镜表面，到达扫描镜表面，然后依次经过第三准直单元、四分之一波片和显微物镜汇聚到样品台上的样品表面，所述样品被至少两种荧光染料提前标定；

由所述样品表面产生的荧光，依次通过所述显微物镜、所述四分之一波片、所述第三准直单元和所述扫描镜后，再透射通过第三二色镜然后依次经过第三二色镜、透镜-针孔-透镜组，到达第二二色镜表面；入射至第二二色镜的荧光一部分透射通过第二二色镜，被聚焦后由第一探测器接收，另一部分被第二二色镜反射的荧光被聚焦后由第二探测器接收。

作为优选，所述第一准直单元、第二准直单元、第三准直单元为透镜组。即，所述第一准直单元、第二准直单元、第三准直单元分别为第一透镜组、第二透镜组、第三透镜组。所述第一透镜组、第二透镜组、第三透镜组起扩束准直的作用，扩束后激光束直径变大，发散角较小，在垂直于光轴方向的横截面内光强分布更均匀，更接近于平行光，有利于光束会聚形成更小的光斑。

作为优选，还包括第一反射镜、第二反射镜或第三反射镜；经过位相板调节偏振态后的光束经过第一反射镜反射到偏振分束镜的入射面；第二激发光源经过第二反射镜反射至第一二色镜；所述另一部分的荧光先经过第三反射镜再被聚焦后由第二探测器接收。

作为优选，两部分荧光分别通过第一透镜、第四透镜聚焦后由第一探测器、第二探测器接收。

作为优选，所述损耗光源的激光器波长为775nm。

作为优选，第一激发光源的激光器波长为650nm。

作为优选，第二激发光源的激光器波长为594nm。

本发明中：

所述半波片用于调整接收的光束中水平偏振光和垂直偏振光的比例；

所述位相板用于对损耗光束做位相编码，生成中空聚焦光斑。

所述四分之一波片用于将线偏振光转为圆偏振光。

所述透镜-针孔-透镜组由第二透镜、针孔和第三透镜组成；所述针孔用于阻隔杂散光、降低背景噪声。

本发明光束传输过程为：

第二激发光源发出的激发光束经过第二反射镜反射后，激发光束传播方向偏转45°，与第一激发光源发出的激发光束在第一二色镜处合束。合束后的激发光束通过第二透镜组后被准直，之后通过半波片调节偏振态后，入射到偏振分束镜的一个入射面。

损耗光源发出的损耗光经过第一透镜组准直后，通过位相板调节偏振态与激发光束偏振态垂直后，损耗光入射到第一反射镜表面，由第一反射镜反射到偏振分束镜的另一个入射面。在偏振分束镜上，激发光与损耗光在偏振分束镜的胶合面合束后，入射到第三二色镜表面，被第三二色镜反射到扫描镜表面。扫描镜表面出射的光，经过第三透镜组准直后，通过四分之一波片，产生π/4的位相延迟后，经由显微物镜汇聚到样品表面。样品被两种(或两种以上)荧光染料提前标定过，因此两种荧光染料受到激发光辐照后，会产生两种荧光，即荧光光谱一和荧光光谱二。这两种荧光光谱反方向通过显微物镜，再次通过四分之一波片，再一次产生π/4的位相延迟，即总共π/2的位相延迟，使得偏振态与之前的偏振态垂直，可以在经过第三透镜组、扫描镜后透射通过第三二色镜。透射通过第三二色镜的光束经过第三透镜后会聚，会聚光束通过针孔后经由第二透镜后扩束准直，到第二二色镜表面。两种荧光光谱一部分透射通过第二二色镜，被第一透镜聚焦后，由第一探测器接收。另一部分的荧光被第二二色镜反射到第三反射镜表面后，再被反射，进入第四透镜，聚焦后由第二探测器接收。

所述荧光中包括两种染料激发的分别激发的两种荧光光谱，分别为荧光光谱一和荧光光谱二；在第一探测器和第二探测器上分别安装通道一滤波片和通道二滤波片，通道一滤光片过滤掉其它光谱仅仅保留荧光光谱一中没有与荧光光谱二叠加的部分，通道二滤光片过滤掉荧光光谱中波长大于激发光的部分，仅保留荧光光谱一与荧光光谱二叠加的部分。

对通道一中的光子数进行累加，得到通道一中的光子数。由于荧光光谱一的曲线由其对应的荧光染料所决定，所以该光谱的整体曲线已知。根据通道一中的光子数，通道一的光谱曲线以及荧光光谱一的整体曲线，可按比例计算，获得通道二中由荧光光谱一所贡献的光子数。用通道二的光子数减去通道二中由荧光光谱一所贡献的光子数，即可得通道二中由荧光光谱二所贡献的光子数。将上述计算出的通道一和通道二中来自荧光光谱一和荧光光谱二的光子数送入后续计算处理系统，即实现单通道的多色超分辨显微。

本发明还提供了一种基于单通道的多色超分辨显微方法，采用上述任一技术方案所述的基于单通道的多色超分辨显微系统；其中所述荧光中包括两种光谱，分别为荧光光谱一和荧光光谱二，通道一滤光片过滤掉其它光谱仅仅保留荧光光谱一中没有与荧光光谱二叠加的部分，通道二滤光片过滤掉荧光光谱中波长大于激发光的部分，仅保留荧光光谱一与荧光光谱二叠加的部分；

还包括计算通道一和通道二中来自荧光光谱一和荧光光谱二的光子数的步骤：

(1)对通道一中的光子数进行累加，得到通道一中的光子数；根据通道一中的光子数，通道一的光谱曲线积分面积以及荧光光谱一的整体曲线积分面积，获得通道二中由荧光光谱一所贡献的光子数；

(2)用通道二的光子数减去通道二中由荧光光谱一所贡献的光子数，即可得通道二中由荧光光谱二所贡献的光子数；

(3)将上述计算出的通道一和通道二中来自荧光光谱一和荧光光谱二的光子数送入后续计算处理系统，即实现单通道的多色超分辨显微。

需要说明的是，在没有特别说明的情况下，本发明中，“第一”、“第二”、“第三”“第四”等仅为了区别各元件，对元件的安装次序或者结构、功能等均无限定作用。

因此，现有的双色或多色超分辨显微系统并不能很好的满足实际的需求。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明采用一个损耗光源即可实现两色(或多色)的超分辨显微，系统架构简单，成本较低。

2、本发明可以克服以往单通道多色超分辨系统中能量损失大和串扰带来的较强的背景噪声，工作精度高，结果准确。

因此，该技术方案与原有技术相比，能够提高多色超分辨显微系统的工作效率和实验精度，并有效降低成本。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的光路图；

其中：1、损耗光源；2、第一透镜组；3、位相板；4、第一反射镜；5、第一激发光源；6、第一二色镜；7、第二透镜组；8、半波片；9、偏振分束镜；10、第二激发光源；11、第二反射镜；12、第一探测器；13、第一透镜；14、第二二色镜；15、第二透镜；16、针孔；17、第三透镜；18、第三二色镜；19、扫描镜；20、第二探测器；21、第四透镜；22、第三反射镜；23、第三透镜组；24、四分之一波片；25、显微物镜；26、样品；

图2是本发明的一个受激发射光谱图，包括荧光染料A和荧光染料B两种染料的受激发射光的光谱，其中：27为通道一的光谱；28为通道二的光谱；

图3是本发明的实施例的受激发射光谱图，包括荧光染料ATTO594和ATTO647N的荧光光谱，其中：29为通道545～590nm的光谱；30为通道591～778的光谱。

具体实施方式

下面结合附图说明本发明，但本发明并不限于此。

如图1所示是本发明一个实施例的单通道多色超分辨显微系统实施例。该实施例的双光束光镊系统包括：

损耗光源1；第一透镜组2；位相板3；第一反射镜4；第一激发光源5；第一二色镜6；第二透镜组7；半波片8；偏振分束镜9；第二激发光源10；第二反射镜11；第一探测器12；第一透镜13；第二二色镜14；第二透镜15；针孔16；第三透镜17；第三二色镜18；扫描镜19；第二探测器20；第四透镜21；第三反射镜22；第三透镜组23；四分之一波片24；显微物镜25；样品台和样品26；

其中，损耗光源1优选为OneFive公司的Katana–08HP。

第一激发光源5优选为PicoQuant公司的LDH-TA-595。

第二激发光源10优选为PicoQuant公司的LDH-P-C-650B。

第一探测器12优选为Excelitas公司的SPCM-AQRH-13FC。

第二探测器20优选为Excelitas公司的SPCM-AQRH-13FC

第二激发光源10发出的激发光束经过第二反射镜11反射后，激发光束传播方向偏转90°，与第一激发光源5发出的激发光束在第一二色镜6处合束。合束后的激发光束通过第二透镜组7后被准直，之后通过半波片8调节偏振态后，入射到偏振分束镜9的一个入射面。

损耗光源1发出的损耗光经过第一透镜组2准直后，通过位相板3调节偏振态与激发光束偏振态垂直后，损耗光入射到第一反射镜4表面，由第一反射镜4反射到偏振分束镜9的另一个入射面。

在偏振分束镜9上，激发光与损耗光在偏振分束镜9的胶合面合束后，入射到第三二色镜18表面，被第三二色镜18反射到扫描镜19表面。扫描镜19表面出射的光，经过第三透镜组23准直后，通过四分之一波片24，产生π/4的位相延迟后，经由显微物镜25汇聚到样品26表面。样品26被两种(或两种以上)荧光染料提前标定过，即荧光染料A和荧光染料B，因此两种荧光染料受到激发光辐照后，会产生两种荧光光谱，分别为荧光光谱A(由荧光染料A激发产生)和荧光光谱B(由荧光染料B激发产生)，如图2所示。这两种荧光光谱反方向通过显微物镜25，再次通过四分之一波片24，再一次产生π/4的位相延迟，即总共π/2的位相延迟，使得偏振态与之前的偏振态垂直，可以在经过第三透镜组23、扫描镜19后透射通过第三二色镜18。透射通过第三二色镜18的光束经过第三透镜17后会聚，会聚光束通过针孔16后经由第二透镜15后扩束准直，到达第二二色镜14表面。样品产生的荧光光谱A和荧光光谱B一部分通过第二二色镜14，被第一透镜13聚焦后，由第一探测器接收12。样品产生的荧光光谱A和荧光光谱B的另一部分被第二二色镜14反射到第三反射镜22表面后，再被反射，进入第四透镜21，聚焦后由第二探测器20接收。

在第一探测器12和第二探测器20上分别安装通道一和通道二的滤波片，通道一滤光片过滤掉其它光谱仅仅保留荧光光谱A中没有与荧光光谱B叠加的部分，即如图2所示通道一的光谱27；通道二滤光片过滤掉光谱中大于激发光的部分并仅保留荧光光谱A与荧光光谱B叠加的部分，即如图2所示通道二的光谱28。

对通道一的光谱27中所有的光子数进行累加，得到通道一中的光子数N。由于荧光光谱A的光谱曲线由荧光染料所决定，所以该光谱的整体曲线已知。根据通道一中的光子数N，通道一的光谱曲线的积分面积a以及荧光光谱A的整体曲线的积分面积b，可按比例计算，获得通道二中由荧光光谱A所贡献的光子数M，即M＝N/a(b-a)。

对通道二的光谱28中所有的光子数进行累加，得到通道二中的光子数U。用通道二的光子数减去通道二中由荧光光谱A所贡献的光子数，即可得通道二中由荧光光谱B所贡献的光子数Z＝U-M。将上述计算出的来自荧光光谱A和荧光光谱B的光子数送入后续计算处理系统，即实现单通道的多色超分辨显微。

本实施例中，显微物镜25可选用Olympus公司的UPLSAPO 100XS。

实施例

下面结合实施例对本发明所提出的单通道的多色超分辨显微系统进行进一步说明，但本发明并不限于此。

第二激发光源10发出的激发光束，波长为594nm。经过第二反射镜11反射后，激发光束传播方向偏转45°，与第一激发光源5发出的激发光束，波长为650nm。在第一二色镜6处合束。合束后的激发光束通过第二透镜组7后被准直，之后通过半波片8调节偏振态后，入射到偏振分束镜9的一个入射面。

损耗光源1发出的损耗光，波长为775nm，经过第一透镜组2准直后，通过位相板3调节偏振态与激发光束偏振态垂直后，损耗光入射到第一反射镜4表面，由第一反射镜4反射到偏振分束镜9的另一个入射面。在偏振分束镜9上，激发光与损耗光在偏振分束镜9的胶合面合束后，入射到第三二色镜18表面，被第三二色镜18反射到扫描镜19表面。扫描镜19表面出射的光，经过第三透镜组23准直后，通过四分之一波片24，产生π/4的位相延迟后，经由显微物镜25汇聚到样品表面。样品26被ATTO594和ATTO647N两种荧光染料提前标定过，因此两种荧光染料受到激发光辐照后，会产生相应的荧光光谱，如图3所示。这两种荧光光谱反方向通过显微物镜25，再次通过四分之一波片24，再一次产生π/4的位相延迟，即总共π/2的位相延迟，使得偏振态与之前的偏振态垂直，可以在经过第三透镜组23、扫描镜19后透射通过第三二色镜18。透射通过第三二色镜18的光束经过第三透镜17后会聚，会聚光束通过针孔16后经由第二透镜15后扩束准直，到第二二色镜14表面。样品荧光光谱的50％透射通过第二二色镜14，被第一透镜13聚焦后，由第一探测器接收12。样品荧光光谱的另50％被第二二色镜14反射到第三反射镜22表面后，再被反射，进入第四透镜21，聚焦后由第二探测器20接收。

在第一探测器12上带有545～590nm的带通滤光片，第二探测器20上带有591～778nm的带通滤光片，545～590nm的带通滤光片仅保留ATTO594荧光的光谱中没有与ATTO647N荧光的光谱叠加的部分，即如图3所示通道545～590nm的光谱29；591～778nm的带通滤光片过滤掉光谱中大于778nm的部分，并仅保留荧光的光谱一与光谱二叠加的部分，即如图2所示通道591～778nm的光谱30。

对通道545～590nm的光谱29中所有的光子数进行累加，得到通道545～590nm的光谱29中的光子数N。由于ATTO594的荧光的光谱曲线由荧光染料所决定，所以该光谱的整体曲线已知。根据通道的光子数N，通道545～590nm的光谱29的光谱曲线的积分面积a以及ATTO594的荧光整体曲线的积分面积b，可按比例计算，获得通道591～778nm的光谱30中由ATTO594的荧光所贡献的光子数M，即M＝N/a(b-a)。

对通道591～778nm的光谱30中所有的光子数进行累加，得到通道591～778nm的光谱30中的光子数U。用通道591～778nm的光谱30的光子数减去通道591～778nm的光谱30中由ATTO594荧光所贡献的光子数，即可得通道591～778nm的光谱30中由ATTO647N的荧光所贡献的光子数Z＝U-M。将上述计算出的来自ATTO594荧光和ATTO647的光子数送入后续计算处理系统，即实现单通道的多色超分辨显微。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。如，除实施例所述的ATTO594和ATTO647N两种荧光染料外，与实施例所述激发光和损耗光相匹配的荧光染料还包括：ATTO590、SiR、Alexa635P、KK140等。但是，根据所选荧光染料的不同，相应光学器件的选择和参数，如滤光片的通带等，还是应该进行合理微调。

另外，利用本发明的系统和方法，还可实现大于二色的多色的超分辨显微，此时需要根据需要增加相应的探头和滤波片，同时配置适当的二色镜，根据上述类似的方法，逐一进行计算。对于多色显微，在滤波片设计时，比如，对于S(S>2)色体系来讲，样品将会发出S个荧光光谱，需要配置S个探头，每个探头需要配置一个滤波片；对于第i个滤波片：i＝1时，滤波条件同上，即仅保留第1个荧光光谱没有与第2个荧光光谱重叠的部分；对于i≠1的第i个滤波片，其仅保留第i-1和第i个荧光光谱叠加的部分，计算时依次计算即可。

尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。