检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法与应用与流程

文档序号:12268410阅读:来源:国知局

技术特征:

1.检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)利用引物对NXP2-F/NXP-R2和引物对NXP2-F2/NXP2-R从pCMV-myc-NXP2全长质粒中分别PCR扩增人NXP2的N端或C端;

2)回收纯化PCR产物,然后克隆至pCMV-myc载体,构建含NXP2N端或NXP2C端并且带有Myc标签的pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒,通过酶切鉴定确定所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒的插入子;

3)测序证实所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒中的NXP2N端或NXP2C端序列和读码框的准确性;

4)将所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒瞬时转染人胚肾(HEK)293细胞48小时,通过Western Blot法使用c-myc抗体或NXP2抗体检测所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒的NXP2N端或NXP2C端在HEK293细胞中的过表达;

5)采集30ul NXP2抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清分别与200ug所述过表达的NXP2N端或NXP2C端的细胞裂解液进行免疫沉淀,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳,用c-myc抗体进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法,其特征在于,所述引物对NXP2-F/NXP-R2的引物NXP2-F的序列如SEQ ID NO:1所示,所述引物对NXP2-F/NXP-R2的引物NXP2-R2的序列如SEQ ID NO:2所示,所述引物对NXP2-F2/NXP2-R的引物NXP2-F2的序列如SEQ ID NO:3所示,所述引物对NXP2-F2/NXP2-R的引物NXP2-R的序列如SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法,其特征在于,所述PCR产物为NXP2的N端或C端,采用胶回收试剂盒回收。

4.根据权利要求1所述的检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法,其特征在于,所述免疫沉淀方法包括:用Protein G magnetic beads分别与20ul NXP2抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清进行结合,继而与过表达的NXP2N端或NXP2C端的细胞裂解液孵育进行抗原吸附,洗脱后进行SDS-PAGE凝胶电泳,用c-myc抗体进行检测。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测炎症性肌病NXP2自身抗体的非放射标记免疫沉淀方法的应用,其特征在于,用于检测特发性炎症性肌病患者的抗NXP2自身抗体。

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