本发明涉及一种测定方法，具体是一种布鲁氏菌病的快速测定方法。
背景技术：
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的，是目前世界上流行最广、危害最大的人畜共患病之一，引起流产、不孕以及各种组织的局部病灶。布鲁氏菌可通过鼻、咽、口腔感染，主要是通过粘膜上皮组织浸入。目前，布鲁氏菌属已有10余个种的布鲁氏菌存在，不同种的布鲁氏菌具有明显的宿主危害倾向性，但大多具有不同宿主间的交叉感染能力，可引起严重的公共卫生问题。随着我国近年来，畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病成为了限制我国畜牧业发展的严重病害之一。布鲁氏菌包括羊群布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌等种源。布鲁氏菌检测技术主要有虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、乳环试验（MRT）、补体结合试验（CFT）、ELISA和PCR等方法。常规方法分离鉴定病原所需条件苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。PBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR检测方法较前几种快速也准确许多，但需要复杂的仪器设备，成本高，不适合基层和现场检测。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，目前多数建立的LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，只能分析LAMP反应的最终结果，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定。本发明使用的LAMP方法不仅敏感度高，特异性强，不造成环境污染，快速得出结果，并且可实时定量检测，而且操作简便，只需按建立的体系加样即可，为简便、快捷准确地检测布鲁氏菌带来便利。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌病的快速测定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种布鲁氏菌病的快速测定方法，包括如下步骤：1）表达片段克隆：将S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min，之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板，利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液；2）大肠杆菌原核表达载体的构建：取步骤（1）中的回收后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理，之后，在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h，获得连接产物；3）转化大肠杆菌DH5α克隆菌株：将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞，采用“热激法”进行转化，得到固体LB培养基平板；4）阳性克隆子的筛选：挑取步骤3）固体LB培养基表面的单个白色菌落，以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；5）质粒提取：取步骤（4）中的阳性菌株菌液1mL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性重组质粒；6）转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株：将步骤（5）中提取到的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，得到固体LB培养基平板；7）阳性克隆子的筛选：次日，用无菌牙签挑取步骤（6）中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为：37℃，180rpm-200rpm，培养12h-14h，获得表达菌株培养菌液；8）诱导表达与亲和纯化：将步骤（7）中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL表达菌株培养菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL，在37℃、180rpm-200rpm条件培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，诱导表达的条件为在37℃、180rpm-200rpm条件下诱导3h-4h。之后，5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体，用20mL1×PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min，结束后10000rpm-12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化，收集获得纯化洗脱液；9）聚丙烯酰胺凝胶电泳：取步骤（8）的亲和纯化后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液，对蒸馏水透析20h-24h，并且12h期间更换一次蒸馏水，利用PEG8000进行浓缩，取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时，以常见的BSA蛋白作为对照进行试验，试验直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止，获得蛋白质凝胶电泳胶片；10）“半干法”转膜：利用半干式印迹转膜仪，将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上，转膜条件为：电压8v-10v，时间40min-50min，获得转膜后的醋酸纤维素薄膜；11）免疫印迹试验：将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育10-20min，再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min，然后用家畜或者人的血清100μL-200μL孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h，次日，利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min之后，用加有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min，最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色，发色时间为5min-10min，直到出现清晰可见的灰褐色条带。
作为本发明再进一步的方案：将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能克服传统的检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种布鲁氏菌病的快速测定方法，包括如下步骤：1）表达片段克隆：将S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min，之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板，利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液；2）大肠杆菌原核表达载体的构建：取步骤（1）中的回收后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理，之后，在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h，获得连接产物；3）转化大肠杆菌DH5α克隆菌株：将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞，采用“热激法”进行转化，得到固体LB培养基平板；4）阳性克隆子的筛选：挑取步骤3）固体LB培养基表面的单个白色菌落，以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；5）质粒提取：取步骤（4）中的阳性菌株菌液1mL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性重组质粒；6）转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株：将步骤（5）中提取到的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，得到固体LB培养基平板；7）阳性克隆子的筛选：次日，用无菌牙签挑取步骤（6）中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为：37℃，180rpm-200rpm，培养12h-14h，获得表达菌株培养菌液；8）诱导表达与亲和纯化：将步骤（7）中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL表达菌株培养菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL，在37℃、180rpm-200rpm条件培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，诱导表达的条件为在37℃、180rpm-200rpm条件下诱导3h-4h。之后，5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体，用20mL1×PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min，结束后10000rpm-12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化，收集获得纯化洗脱液；9）聚丙烯酰胺凝胶电泳：取步骤（8）的亲和纯化后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液，对蒸馏水透析20h-24h，并且12h期间更换一次蒸馏水，利用PEG8000进行浓缩，取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时，以常见的BSA蛋白作为对照进行试验，试验直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止，获得蛋白质凝胶电泳胶片；10）“半干法”转膜：利用半干式印迹转膜仪，将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上，转膜条件为：电压8v-10v，时间40min-50min，获得转膜后的醋酸纤维素薄膜；11）免疫印迹试验：将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育10-20min，再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min，然后用家畜或者人的血清100μL-200μL孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h，次日，利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min之后，用加有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min，最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色，发色时间为5min-10min，直到出现清晰可见的灰褐色条带。将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。
实施例1：
本发明布鲁氏菌病的快速测定方法，包括如下步骤：1）表达片段克隆：将S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min，之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板，利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液；2）大肠杆菌原核表达载体的构建：取步骤（1）中的回收后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理，之后，在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接12h，获得连接产物；3）转化大肠杆菌DH5α克隆菌株：将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞，采用“热激法”进行转化，得到固体LB培养基平板；4）阳性克隆子的筛选：挑取步骤3）固体LB培养基表面的单个白色菌落，以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；5）质粒提取：取步骤（4）中的阳性菌株菌液1mL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性重组质粒；6）转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株：将步骤（5）中提取到的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，得到固体LB培养基平板；7）阳性克隆子的筛选：次日，用无菌牙签挑取步骤（6）中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为：37℃，180rpm，培养12h，获得表达菌株培养菌液；8）诱导表达与亲和纯化：将步骤（7）中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL表达菌株培养菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL，在37℃、180rpm条件培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，诱导表达的条件为在37℃、180rpm条件下诱导3h-4h。之后，5000rpm低速离心收集菌体，用20mL1×PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min，结束后10000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化，收集获得纯化洗脱液；9）聚丙烯酰胺凝胶电泳：取步骤（8）的亲和纯化后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液，对蒸馏水透析20h，并且12h期间更换一次蒸馏水，利用PEG8000进行浓缩，取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时，以常见的BSA蛋白作为对照进行试验，试验直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止，获得蛋白质凝胶电泳胶片；10）“半干法”转膜：利用半干式印迹转膜仪，将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上，转膜条件为：电压8v，时间40min，获得转膜后的醋酸纤维素薄膜；11）免疫印迹试验：将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育10min，再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min，然后用家畜或者人的血清100μL孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h，次日，利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min之后，用加有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min，最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色，发色时间为5min-10min，直到出现清晰可见的灰褐色条带。将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。