一种布鲁氏菌病的快速测定方法与流程

文档序号:12453880阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种布鲁氏菌病的快速测定方法,其特征在于,包括如下步骤:1)表达片段克隆:将S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min,之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板,利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应,利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收,回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液;2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(1)中的回收后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理,之后,在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h,获得连接产物;3)转化大肠杆菌DH5α克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞,采用“热激法”进行转化,得到固体LB培养基平板;4)阳性克隆子的筛选:挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落,以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈循环为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时,进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理,获得阳性菌株菌液;5)质粒提取:取步骤(4)中的阳性菌株菌液1mL,利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取,得到阳性重组质粒;6)转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重组质粒,利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,得到固体LB培养基平板;7)阳性克隆子的筛选:次日,用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落,以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性表达菌株的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈循环为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时,利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理,液体摇瓶培养的条件为:37℃,180rpm-200rpm,培养12h-14h,获得表达菌株培养菌液;8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液,从中取0.5mL表达菌株培养菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中,卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL,在37℃、180rpm-200rpm条件培养3h-4h之后,在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达,IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L,诱导表达的条件为在37℃、180rpm-200rpm条件下诱导3h-4h;之后,5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体,用20mL1×PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀,在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min,结束后10000rpm-12000rpm高速离心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化,收集获得纯化洗脱液;9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取步骤(8)的亲和纯化后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液,对蒸馏水透析20h-24h,并且12h期间更换一次蒸馏水,利用PEG8000进行浓缩,取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,同时,以常见的BSA蛋白作为对照进行试验,试验直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止,获得蛋白质凝胶电泳胶片;10)“半干法”转膜:利用半干式印迹转膜仪,将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上,转膜条件为:电压8v-10v,时间40min-50min,获得转膜后的醋酸纤维素薄膜;11)免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育10-20min,再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min,然后用家畜或者人的血清100μL-200μL孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h,次日,利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min之后,用加有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h,然后,用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min,最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色,发色时间为5min-10min,直到出现清晰可见的灰褐色条带。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病的快速测定方法,其特征在于,将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1