细胞拉曼静默区表面增强拉曼散射基底及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物大分子分离分析技术领域，具体涉及—种金为核的细胞“拉曼静默区”的表面增强拉曼散射基底及其制备方法和在细胞拉曼成像的应用。

背景技术：

表面增强拉曼散射，是一种特殊的拉曼光谱现象，其表现为在一些金、银、铜等贵金属的粗糙表面，待测分子的拉曼散射信号由于受到表面等离子共振（LSPR）作用被几何倍数（10³‐10⁹）放大。该现象使拉曼光谱的灵敏度大幅度增加，同时其较小的狭缝宽度，较好的波谱形状，进一步扩展了其在各个领域方面的研究。由于拉曼的灵敏性被广泛应用到食品安全、环境监控、生物、医学以及考古等高灵敏性分析研究中，对其灵敏度的进一步探索引起了各个方向的关注。另外由于拉曼信号非常稳定，可以较长时间的其进行研究探索，而随着纳米材料技术与理论的不断发展，各种制备表面增强拉曼散射的基底的方法也被不断开发出来，为表面增强拉曼提供了更为宽广的应用前景。

拉曼探针分子的制备为拉曼基底的创新提供了可能，而将炔基分子（1800 cm^-1-2800cm^-1）引入到探针分子的制备中，为细胞拉曼成像奠定了基础。本发明合成的（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇（2200cm^-1）是较好的细胞“拉曼静默区”的分子，可用于对多种类型的细胞进行成像，而将其直接定位于细胞核中的成像研究中更为其他细胞器的研究提供了可能。

表面增强拉曼散射成像就是利用表面增强拉曼光谱的拉曼特征峰，然后通过软件进行拟合得到的模拟图像。其本质实际上是特定拉曼峰的强度分布图。相比于传统的荧光成像，因为其不受光学衍射散射、不发生荧光淬灭等因素，其成像的精度可以更高，由于表面增强拉曼探针不会像荧光那样容易被背景自发荧光干扰；这就使其成像灵敏度便远远超过荧光成像。然而，目前表面增强拉曼散射成像在细胞成像中尤其是细胞中细胞核的“拉曼静默区”的应用还比较少。虽然拥有美好的前景，但是细胞核的“拉曼静默区”成像无论在细胞成像计数还是细胞内分子标记与失踪上的研究都还需要进一步探索。因此，制备出高效率、高灵敏度的“拉曼静默区”表面增强拉曼散射基底与探针就成为关键因素。

为达到对肿瘤细胞细胞核成像的目的，本发明设计并制备了以金为核多肽修饰的金纳米粒子为基底，大大提高了表面增强拉曼散射的探针强度，从而可以在高强度高灵敏的表面增强拉曼散射中，保证识别活性细胞的同时，又能进一步的对细胞中的细胞核进行成像。实验结果可实现良好的细胞核成像图。同时，将传统用于染细胞核的染料进行细胞核成像，经过前后图形的对比，发现此种方法成像效果较好，此材料可运用于其他细胞器的研究中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灵敏度高的细胞“拉曼静默区”表面增强拉曼散射基底及其制备方法和在细胞拉曼成像的应用。

本发明提供的细胞“拉曼静默区”表面增强拉曼散射基底，是以金纳米粒子为核的表面修饰细胞核标记物的表面增强拉曼散射基底。该表面增强拉曼散射基底由如下基本方法得到：首先，通过水热法一步合成表面增强拉曼散射探针分子（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇，此探针分子的特征吸收峰在2200 cm^-1，是细胞的典型“拉曼静默区”，用此分子作为拉曼标签并对细胞核呈像，有着背景低、较易分辨的优势；然后，通过水热法合成50-60 nm金纳米粒子；然后，在金纳米粒子溶液中加入上述探针分子；最后，通过多巴胺在碱性条件下的自聚合产生的醌基，使其与细胞核标记物结合，从而形成可以标记细胞核的细胞“拉曼静默区”的表面增强拉曼散射基底。此材料可用于实现对癌细胞细胞核处的拉曼成像。

本发明提出的以金为核的细胞“拉曼静默区”表面增强拉曼散射基底的制备方法，具体步骤为：

（1）（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇的合成：在通有氩气的条件下，向三口烧瓶中加入2-3 g、9-10 mM的碘苯，1-2 g、8-10 mM的4乙炔基苯甲醛， 500-600 mg、0.2-0.3 mM四三苯基膦钯，以及80-100 mL无水三乙胺，然后鼓入氩气排除装置内氧气，并将其放在油浴中加热至沸腾，并持续加热反应8-10 h；反应结束后将溶剂旋干，得到中间产物4-苯乙炔基苯甲醛；然后将400-500 mg、7-8 mM的上述中间产物，400-500 mg、7-8 mM的巯基乙胺，400-500 mg、3-5 mM干燥的无水硫酸镁，以及15-20 mL无水四氢呋喃，置于三口烧瓶中，在常温下搅拌反应5-6 h；反应结束后将反应液旋干除去、洗涤，即得到（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇；

（2）利用水热法合成50-60 nm 金纳米粒子：向三口烧瓶中移取1-2 mL、10 mg/mL的高氯金酸溶液以及95-98 mL 的去离子水，混合均匀后，放入油浴中加热，控制每2-3s回流一次，向其中加入500-800 uL、1-3 %的柠檬酸三钠，保持回流20-30min；冷却至室温，即得到金纳米粒子溶液；

（3）拉曼探针分子的修饰：取步骤（2）中合成好的50-60 nm金纳米粒子溶液，采用8000-10000 rpm，5-10 min 对其进行离心，吸取上层清液，重溶在缓冲溶液中，向其中加入 5-10 uL步骤（1）合成的（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇，混合均匀，然后将其放于酶解仪中，维持反应1-2 min，实现拉曼探针分子的修饰；

（4）细胞核标记物的修饰：采用醌基共价偶联的方法将细胞核标记物修饰在金纳米粒子的表面，向上述步骤（3）的溶液中加入10-20 uL、10-20 ug/mL的细胞核标记多肽序列，在酶解仪中反映24-28 h，即得到目标物金为核的细胞“拉曼静默区”的表面增强拉曼散射基底，保存于冰箱中，以备用于对细胞的拉曼成像。

本发明制备的金为核的细胞“拉曼静默区”的表面增强拉曼散射基底，可用于人神经胶质瘤细胞U251中的细胞核的拉曼成像。

细胞拉曼成像的操作步骤为：首先在直径为10-20 mm的玻璃培养皿中加入约10 ⁴-10⁵的细胞密度的细胞，放于细胞培养箱中培养18-24 h；取10-30 μg/mL 的基底材料也加入玻璃培养皿中，将玻璃培养皿放于培养箱中，与细胞作用18-24 h，再吸取培养基，用PBS洗涤2-3次后，用4%的多聚甲醛溶液，在37℃培养箱中反应15-30 min；最后用PBS 洗涤二到三次，并加入100-200 uL的PBS ，放于4℃的冰箱中保存并用于细胞核的成像。

本发明将上述制备的表面增强拉曼散射基底材料，应用于人神经胶质瘤细胞U251中细胞核的拉曼成像。由于合成的为细胞“拉曼静默区”的探针分子，可扩展到细胞波谱在1800cm^-1-2800cm^-1的任意谱峰值，实现对细胞的细胞核拉曼成像。因此，本发明的表面增强拉曼散射基底材料应用于人神经胶质瘤细胞（U251）中细胞核的拉曼成像，可以扩充到人肝癌细胞（HepG-2）、肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、前列腺癌细胞（DU145）、非小肺癌细胞、人结直肠腺癌上皮细胞（DLD-1）等癌细胞中的细胞核成像等。同时，此应用还可以进一步扩展到活体中的组织切片中，在与活体动物作用之后，可以实现对组织切片提供了实验基础，具有较大的活体成像的应用前景。

通过上述步骤成功实现了金为核的细胞“拉曼静默区”的表面增强拉曼散射基底的制备并实现了对细胞核的成像。基底材料的进一步表征通过透射电子显微镜（TEM）、表面增强拉曼散射光谱（SERS）、紫外吸收光谱（UV）图像说明。

实验表明，这种以金为核的“拉曼静默区”表面增强拉曼散射基底不会干扰探针信号，同时利用拉曼增强原理，还原产生的金纳米可以显著的增强探针本身的信号，从而降低其它杂峰的干扰，最终由优异的拉曼信号可以实现较好的拉曼成像。借助于优良的探针信号峰的位置，在保持细胞活性的前提下，将此材料与活细胞过夜反应，最终在2200 cm^-1(（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇)实现了对活细胞的细胞核拉曼成像。同时将此材料成像效果与传统的荧光材料成像效果对比，用本发明基底材料，细胞核的成像速度快，效率高，操作简单，具有巨大的临床应用潜力。

附图说明

图1 为（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇分子的制备流程图。

图2金为核多肽连接其表面的拉曼基底的紫外图。其中，a 是金纳米粒子， b是包裹多巴胺的金纳米粒子，c是连接多肽的金纳米粒子。

图3金为核多肽连接在其表面的基底的TEM图像。其中，a 是金纳米粒子，b是修饰多肽的金纳米粒子。

图4基底材料与细胞作用之后的细胞核成像，其中，a是拉曼成像，b是荧光成像，c是重叠像。

具体实施方式

实施例1：人表皮生长因子与金为核多巴胺产生的醌基连接多肽的表面增强拉曼散射对细胞核成像基底的合成。

向250 mL的三口烧瓶中移取1-2 mL10 mg/mL的高氯金酸溶液及95-98 mL 的去离子水，将其混合均匀后，放入油浴中加热，控制大约每秒钟回流一次，向其中加入750 uL的1%的柠檬酸三钠，保持回流约20-30min，冷却至常温，将其储存于干净的玻璃瓶中，放4℃冰箱保存。取合成好的50-60 nm金纳米粒子，采用8000-10000 rpm， 5-10 min 对其进行离心，吸取上层清液，重溶在缓冲溶液中，向其中加入 5-10 uL的（E）-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇, 混合均匀后将其放于酶解仪，维持其反应1-2 min。采用醌基共价偶联的方法将细胞核标记物修饰在金纳米粒子的表面，向上述溶液中加入10-20 uL10-20 ug/mL的细胞核标记多肽序列，在酶解仪中反映24-28 h,将合成好的材料在用于对细胞的拉曼成像之前保存于冰箱中，可用于对细胞核的拉曼成像。

实施例2：多肽修饰的金为核的拉曼基底对神经胶质瘤细胞U251的细胞核成像。

在10-20 mm的直径玻璃表面皿中加入约10 ⁴-10⁵的细胞密度的细胞，放于细胞培养箱中培养18-24 h, 取10-30 μg/mL 的材料加入玻璃皿中，将玻璃培养皿放于培养箱中，与细胞作用18-24 h, 再吸取培养基，用PBS洗涤2-3次后，用4%的多聚甲醛溶液，在37℃培养箱中反应15-30 min, 最后用PBS 洗涤二到三次，并加入100-200 uL的PBS 放于4℃的冰箱中保存并用于细胞核的成像。