一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法与流程

文档序号:12657917阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)在种植Bt作物的田块采集秸秆样品和土壤样品;

2)对秸秆样品和土壤样品进行预处理;

3)提取秸秆样品和土壤样品中的总蛋白;

4)对总蛋白提取液进行透析纯化和冷冻干燥浓缩;

5)将浓缩后的总蛋白加入二化螟人工饲料;

6)分装二化螟人工饲料入饲养瓶;

7)将孵化24小时之内二化螟幼虫接入饲养瓶;

8)培养10天后检查二化螟的死亡与生长发育情况,计算外源蛋白在环境中的相对持留量和活性衰减动态。

2.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述样品的采集方法为:转Bt基因作物收割当日在种植转Bt基因作物的田间采集秸秆样品和10cm深的根围土样品作为阳性对照,之后每隔10天在种植转Bt基因作物的田块采集秸秆样品和10cm深的根围土样品作为试验处理,收割当日的秸秆样品采集量大于5kg、10cm深的根围土集采量大于10kg,之后每次秸秆样品采集量大于500g、10cm深的根围土大于1000g,采集好的样品用大号自封袋装好,贴上标签,-40℃以下保存。

3.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述样品的预处理方法为:将收割当日和收割第N天后的秸秆样品和土壤样品进行冷冻干燥,干燥后的秸秆样品加液氮磨至粒径0.2mm以下,干燥后的土壤样品研细后过60目筛,取至少3份重100g秸秆粉末、至少3份重200g土壤粉末备用,经预处理的样品-40℃以下保存。

4.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述样品的总蛋白提取方法为:经预处理后的100g秸秆样品和200g土壤样品分别加入2倍体积的PBS缓冲液,常温震荡提取2h,12000r/min离心20min,取上清液,再加2倍体积的PBS缓冲液重复提取一次,合并上清,上清液于4℃保存不超过2天。

5.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述总蛋白提取液透析纯化和冷冻干燥浓缩方法为:总蛋白提取液4℃下经过透析袋透析平衡过夜,透析后冷冻干燥浓缩总蛋白提取液至干粉,总蛋白干粉于-20℃以下保存。

6.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述添加总蛋白入二化螟人工饲料的方法为:配制15份各重200g二化螟人工饲料,当人工饲料冷却至45℃时加入100g秸秆样品总蛋白提取物或200g土壤样品的蛋白提取物,并充分搅拌2min,制成5种类型的人工饲料:①添加收割后第N天的秸秆总蛋白干粉的人工饲料,②添加收割后第N天的土壤总蛋白干粉的人工饲料,③添加收割当日的秸秆总蛋白干粉的人工饲料,④添加收割当日土壤总蛋白干粉的人工饲料,⑤不加任何提取物的人工饲料,每种类型人工饲料各3份,即3次重复。

7.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述二化螟人工饲料分装入饲养瓶的方法为:将配制好的人工饲料在超净工作台内分装入口径5.5cm、高8cm的饲养瓶中,每种类型人工饲料分装1瓶,每瓶30g,并贴好标签,剩下的人工饲料4℃下保存不超过2个月。

8.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述接二化螟幼虫入饲养瓶的方法为:每瓶接入15头孵化24小时以内的二化螟幼虫后用保鲜膜和黑布封口,保鲜膜在下层、黑布在上层,并在保鲜膜上用牙签扎孔6个。

9.根据权利要求1所述的转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法,其特征在于,所述二化螟培养和生长发育情况检查与相对持留量计算的方法为:于28℃、光照16D:8L的环境中培养10天后检查二化螟幼虫的死亡和生长发育情况,计算环境中Bt外源蛋白相对持留量:

收割后第N天的持留百分量=第N天的平均校正死亡率÷阳性对照的平均校正死亡率×100%,或=第N天的二化螟生物量÷阳性对照的二化螟生物量×100%,连续测定5次以上,以时间为横坐标,以持留百分量为纵坐标,绘制环境中Bt外源蛋白活性衰减动态图。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1