一种诊断结核杆菌感染的生物标志物及其相关试剂盒的制作方法

本发明涉及生物诊断技术领域，尤其涉及一种诊断结核杆菌感染的生物标志物及其相关试剂盒。

背景技术：

目前的结核病的免疫诊断方法仍不能满足快速早期诊断结核病和筛选潜伏性结核感染的需要。由于人体在对抗结核分枝杆菌的感染中，细胞介导的免疫反应起到了关键性的作用，所以寻找结核杆菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应已经成为近年来研究热点。

IFN-γ释放实验(IFN-γrelease assays，IGRAs)的发展和应用，给结核病的诊断带来了新的进步，这两种实验也在结核病的临床检测中获得了一定程度的应用。IGRAs应用检测者的外周全血或分离的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，与结核杆菌特异性的抗原共培养后，感染过结核分枝杆菌的个体外周血中的记忆性T细胞能够被再次激活，从而迅速地释放包括IFN-γ在内的多种炎症因子。这种被结核特异性抗原激活释放的炎症因子如IIFN-γ，进一步通过酶联免疫吸附检测(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)或酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)的方法进行检测，从而最终判断是否存在结核杆菌的感染。近年来，IGRAs在结核病的诊断中进行了广泛的应用和验证，表明其在诊断结核分枝杆菌的感染方面具有较低的假阳性率和较高的敏感性，并且能够检出潜伏性结核感染。

以检测IFN-γ为主的免疫反应，在诊断结核杆菌的感染方面有较高的敏感性，但仍然存在重大缺陷，限制了其在结核病诊断中的应用，主要是IFN-γ的释放水平在活动性结核病人和潜伏性结核感染者中无明显差异，因此目前的IGRAs只能够检测结核杆菌的感染，而不能够区分活动性结核和潜伏性结核感 染，在结核病高流行的地区和国家，由于潜伏性结核感染的比率较高，使IGRAs的在临床诊断中的应用受到了极大地限制。

现有的基于细胞免疫反应的结核病诊断方法均以IFN-γ作为唯一的诊断标志物。IFN-γ在宿主对抗结核病的保护性免疫反应中是必需的。但以IFN-γ为唯一的诊断标志物，其敏感性仍然存在不足，此外在HIV合并结核病的患者或其它伴有免疫缺陷的结核病患者中，会出现阳性对照抗原刺激后释放IFN-γ的量不足而无法判定结果(indeterminate)的情况，在HIV合并结核病的患者中更是高达20％-40％因此，补充IFN-γ以外的其它诊断标志物，可以与IFN-γ互补以提高诊断的敏感性。另一方面由于释放的水平的不同，其它生物标志物与IFN-γ联合适用，会减少出现无法判定结果的情况。

此外，有研究显示，外周血单核细胞受到结核特异性抗原刺激后，会释放多种炎症标志物，这些炎症标志物的释放，被认为与机体抗结核感染的免疫应答相关，并最终导致了活动性结核病和潜伏性结核感染的不同结局。如受结核特异性抗原刺激后的IFN-γ释放水平，随治疗时间的延长会不断下降，从而间接反映了机体的带菌量，而IFN-γ释放量增高则预示着结核病的复发。因此某些炎症标志物可能是活动性结核病或潜伏性结核感染所特有的。随着Luminex悬液芯片检测技术的发展，使我们有可能在仅仅25ul的样品中同时对多种生物标志物进行检测和筛选。得到某些细胞因子在活动性结核和潜伏感染中存在表达差异，这些差异表达的分子标志可以作为区分活动性结核和潜伏感染的标志，从而为结核病的临床诊断和指导性治疗提供参考依据。

技术实现要素：

本发明针对目前在结核杆菌免疫诊断方面存在的问题，通过高通量技术批量筛选并获得能够有效区分活动性结核病人和潜伏性结核感染人群的细胞因子组合，开发一种具有高灵敏度和特异性度，操作简便快捷的结核感染诊断试剂盒。

所述的细胞因子IL-2和IL-10是通过高通量悬液芯片技术的筛选，得到的能够诊断结核杆菌感染，并区分活动性和潜伏性结核感染的新型生物标志物。

为实现上述目的，本发明提供一种筛选单核细胞释放的结核感染生物标志物的方法，包括下列步骤：

1)制备不同结核感染状态人群包括活动性结核病人，潜伏性结核感染者及健康对照者的外周血单核细胞样本

2)采用悬液芯片技术，检测样本中的细胞因子及趋化因子，获得细胞因子及趋化因子的数据

3)比较活动性结核病人及潜伏感染者样本中的细胞因子及趋化因子水平，通过数据分析，得到能够区分活动性结核病和潜伏性结核感染的生物标志物

本发明的再一个目的在于提供一种诊断结核杆菌感染，并区分活动性结核病和潜伏性结核感染的方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

测定不同结核感染状态的人群中单核细胞经结核杆菌特异性抗原刺激后产生的细胞因子IL-2和IL-10的水平；

基于单核细胞释放或产生的细胞因子的水平，来判断所述个体是否存在结核杆菌的感染。

本发明的另一个目的在于提供一种用于诊断结核杆菌感染，并区分活动性结核病和潜伏性结核感染的试剂盒。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

一种用于诊断结核分枝杆菌感染的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子IL-2和IL-10中至少一个。

进一步的，上述试剂盒中含有能够测定单核细胞经刺激后产生的IL-2或IL-10含量的检测组件，可对细胞因子IL-2和IL-10中至少一个进行定量。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的对细胞因子的检测组件为ELISA检测组件或电化学发光检测组件。

在获知本发明后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样本中IL-2和IL-10的含量，包括悬液芯片，酶联免疫斑点技术等，这些方法均包含在本发明中。

本发明所用的单核细胞可以来自于分离的外周血单个核细胞和外周全血，还可以是脑脊液，胸腔积液，腹水，关节腔积液中的一种或多种。

此外，本发明涉及分枝杆菌，尤其是结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)的用途，用于作为区分活动性结核病和潜伏性结核感染状态的刺激物。

最后，提供了含有分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌PPD以及ESAT-6和CFP-10的组合物，用于在全血或单核细胞中作为刺激物，来检测样本的结核感染状态

本发明首次证实了细胞因子IL-2和IL-10可以作为结核感染诊断的标志物，可以通过测定外周血单核细胞受结核抗原刺激后的IL-2和IL-10的浓度来诊断结核感染，并进一步区分活动性结核病和潜伏性结核感染。以本发明所述的两种细胞因子为基础制备的结核感染血液检测试剂，为活动性结核病的快速诊断提供新的技术基础，具有敏感性和特异性高等优点，且操作快速、合理可行，可以明显提高活动性结核病的诊断效率。

附图说明

图1为活动性结核病人(ATB)，潜伏性结核感染者(LTBI)和健康对照(HC)人群外周血单核细胞受结核抗原PPD刺激后的细胞因子释放量；

图2为联合IL-2和IL-10区分活动性结核病(ATB)和潜伏性结核感染(LTBI)的决策树分析示意图；

图3为IL-2和IL-10联合用于活动性结核疑似病人的诊断流程示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1：诊断结核分枝杆菌感染的生物标志物的筛选

步骤1：病例收集

采集受试者样本，包括活动性结核患者，潜伏性结核感染者和健康对照者的血液样本。其中所述患者诊断为活动性肺结核的依据为：患者有痰涂片阳性结果或痰培养阳性结果，X射线胸片异常或抗结核治疗少于30天；潜伏性结核感染者的入选标准为：有结核感染的高危因素或有活动性结核病人的密切接触史，结核特异或检测阳性，胸片和痰涂片均无结核感染的证据；健康对照者无结核感染的高危因素，无近期活动性结核的密切接触史，胸片 或痰涂片均未见明显异常。

根据上述标本，在本实施例中收集活动性结核病人25例，潜伏性结核感染者36例，健康对照者31例。

步骤2：样本收集和处理

从活动性结核患者，潜伏性结核感染者及健康对照者外周血中采静脉血5-10ml至真空采血管中；

将真空采血管进行离心，离心的速度为2800-3000rpm，离心时间为10min；离心完成后吸取中间层白色细胞，重悬于细胞培养基RPMI1640中，补平至8ml；上层为血浆，可分离冻存于-80℃备用；

在15ml离心管中加入4ml Ficoll淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液轻轻加入淋巴细胞分离液上层，3000rpm室温离心20min；

吸取离心后的中间层细胞于新离心管中，加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min；

弃上清，加入5ml红细胞裂解液，室温孵育10min；

加入RPMI1640重悬至12ml，混匀，2000rpm离心5min，弃上清；重悬细胞于1ml 1640培养基中，取细胞与typan blue 1：1混合，加入血细胞计数板进行计数；

在24孔细胞培养板内，加入500ml 2.5*10^5/ml重悬的PBMC细胞；

每孔加入结核特异性抗原PPD(10ug/ml)，混匀后放置入37℃细胞培养箱中，培养18-24小时；’

吸去培养液上清，每孔可吸取200-300ul，转移至1.5ml EP管中；

步骤3：悬液芯片技术检测

悬液芯片的核心技术是把微小的颗粒或称微球(bead)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白或寡核苷酸探针以共价的方式吸附到不同颜色的微球上。微球在制作过程中按照严格的搭配比例掺入两种不同的红色分类荧光染料，根据比例不同可以把球形基质分类为100种，每种标上不同的探针分子，从而可以对一个样本中多达100种不同的目的分子进行同步检测。

本研究对活动性结核病，潜伏性结核感染和健康对照三组人群外周血清和特异性抗原刺激后的细胞培养液上清进行检测，其检测的细胞因子共27种：IL-1beta,IL-1ra,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-12(p70),IL-13,IL-15,IL-17,basic FGF,eotaxin,G-CSF,GM-CSF,IFN-γ,IP-10,MCP-1(MCAF),MIP-1alpha,MIP-1beta,PDGF-BB,RANTES,TNF-alpha,VEGF

Bio-Plex悬液芯片操作的具体步骤如下：

准备标准品，将标准品用500ul标本稀释液重悬，震荡1-3s后冰上孵育30mim,按照说明书的要求稀释标准品；

将所有标准品、样本放置室温20min平衡，快速将10×磁珠离心，每孔需要5ul 10×磁珠，将1×磁珠中速漩涡震荡30s，每孔加入50ul；

轻轻震荡标准品，对照和样本1-3s后加入孔内，每孔50ul。室温孵育30min。离心以后弃去上清；

每孔内加入检测抗体，培养30分钟，洗涤3次；

加入streptavidin-PE，30min孵育完成后，再洗3次，每孔内再加入显色液，室温孵育10min。完成后再洗涤3次加入缓冲液；

待测样本进一步在Luminex系统中进行读数和检测，并应用相应的分析软件进行分析。最终炎症因子的浓度应用pg/ml来表示，低于检测下限的浓度值计为0pg/ml。

步骤4：筛选生物标志物并建立预测模型

根据所获的27种细胞因子在不同人群中的含量，我们从中筛选出在活动性结核病人和潜伏性结核感染者中存在表达差异的细胞因子：PPD刺激后的IL-2，IL-10，IP-10，IFN-γ和TNF-α的表达在两组之间存在明显差异，可以作为诊断结核感染不同状态的生物标志物(图1)。为了进一步分析这些细胞因子的诊断价值，我们首先进行了受试者操作曲线(Receiver-operating-characteristic，ROC)的分析，用ROC分析中的曲线下面积(AUCs)用来评价单个基因对所在两组的区分能力。AUCs值越大，说明该基因对该两组的区分能力越好。

为了进一步建立用于区分活动性结核病和潜伏性结核感染的细胞因子预测 模型，我们采用了决策树建模法，采用的软件是R program software。分子标识的最佳组合基于交叉验证和最小错误原则，最小分支节点处的节点数值为10。通过决策树分析，得到细胞因子的最佳组合为IL-2和IL-10，两者联合的诊断敏感性和特异性分别为84.0％和88.9％，诊断结果的准确性为86.9％(图2)。

本实施例筛选出在活动性结核患者和潜伏性结核感染者之间PBMC细胞中差异表达的细胞因子。以所筛选出的细胞因子为诊断标志物，应用悬液芯片技术或ELISA技术进行检测，可用于活动性结核病血液的快速检测中，具有较高的灵敏度高和准确度，简单易操作，可以大大提高活动性结核病的诊断效率。

实施例2：诊断结核杆菌感染的生物标志物及其相关试剂盒在临床中的应用

步骤1：病例收集

在临床上收集活动性结核病的疑似病人，入选标准为：具有类似活动性结核病的临床表现如咳嗽、咯血、消瘦、发热和盗汗等，或具有与活动性结核病相类似的影响学表现，具有结核感染的高危因素或活动性结核病人的密切接触史。在本实例中，根据上述入选标准，共收集疑似活动性结核病人44例。

步骤2：标本收集和处理

从所收集的活动性结核疑似病人的外周血中采静脉血5-10ml至真空采血管中；进一步分离外周血单个核细胞：将真空采血管进行离心，离心的速度为2800-3000rpm，离心时间为10min；离心完成后吸取中间层白色细胞，重悬于细胞培养基RPMI1640中，加入4ml Ficoll淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液轻轻加入淋巴细胞分离液上层，3000rpm室温离心20min；吸取离心后的中间层细胞于新离心管中，加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min；弃上清，加入5ml红细胞裂解液，室温孵育10min；加入RPMI1640重悬至12ml，混匀，2000rpm离心5min，弃上清；重悬细胞于1ml 1640培养基中，取细胞与typan blue 1：1混合，加入血细胞计数板进行计数；

计数好的PBMC，一部分用于进行T-SPOT检测，另一部分加入24孔细胞培养板内，每孔加入结核特异性抗原PPD(10ug/ml)，混匀后放置入37℃细胞培养箱中，培养18-24小时；吸去培养液上清，转移至1.5ml EP管中，用于进 一步的检测。

步骤3，采用ELISA技术检测IL-2和IL-10的含量：

L-2与IL-10的含量应用ELISA方法进行测定。以应用Duoset ELISA Development试剂盒(R&D Systems Inc,MN,USA)进行检测为例，操作步骤完全按照操作说明进行，简要步骤如下：1).应用96孔平底酶标板(NUNC maxisorp,Roskilde,Denmark)，然后每孔包被100ul稀释后的捕获抗体(capture antibody)，4oC包被过夜；2)包被过夜后洗去包被液，应用含有1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)进行封闭至少1h；3)洗涤液洗3遍后，每孔加入100ul适当稀释后的标本以及相应的标准品，室温下孵育2h；4)洗涤3遍后，每孔加入检测抗体，室温孵育2h；5)洗涤3遍后，每孔加入Streptavidin-HRP，室温孵育20min，洗涤3遍后加入显色液TMB，避光反应到足够的时间后，应用终止液2N H2SO4终止反应；6)应用酶标仪读取每孔在450nm的吸光度值OD值，并应用540nm的校正；7)根据标准品的OD值及对应浓度做出标准曲线，然后根据标准曲线算出标本的浓度，乘以稀释倍数及为实际浓度，在本研究中IL-2与IL-10的稀释比均为1:2；8)本研究所有标本都做复孔，最终浓度应用pg/ml表示

步骤4，诊断结果的判定：

本发明实施例中具体提供了基于IL-2和IL-10两种标志物的诊断判定方法，具体方法可参见图2：

如IL-2的释放量大于等于282.5pg/ml，同时IL-10的释放量大于等于113.9pg/ml，检测结果为阳性，即判断为活动性结核病人；若IL-2的释放量小于282.5pg/ml，或者IL-10的释放量小于113.9pg/ml，检测结果为阴性，即判断为潜伏性结核感染的病人。在本实例的61例样本中(25例活动性结核病人，36例潜伏性结核感染者)中使用该判定方法的诊断敏感性达84.0％，特异性达88.9％，区分的准确性为86.9％(图3)。

由上述实施例能够知道，本发明首次证实了细胞因子IL-2和IL-10可以作为结核感染诊断的标志物，可以通过测定外周血单核细胞受结核抗原刺激后的IL-2 和IL-10的浓度来诊断结核感染，并进一步区分活动性结核病和潜伏性结核感染。以本发明所述的两种细胞因子为基础制备的结核感染血液检测试剂，为活动性结核病的快速诊断提供新的技术基础，具有敏感性和特异性高等优点，且操作快速、合理可行，可以明显提高活动性结核病的诊断效率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。