固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10‑蒽醌残留量的方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体涉及固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量的方法。

背景技术：

9,10-蒽醌（Anthraquinone，CAS No 84-65-1）是茶叶中出现的一种新型污染物，欧盟规定其在茶叶中的最大残留限量（MRL）为0.02 mg/kg。2012年，欧盟首次通报了中国茶叶中9,10-蒽醌超标；2014年我国9,10-蒽醌位于欧盟茶叶中污染物超标通报之首。目前，对于茶叶中9,10-蒽醌的检测方法研究较少。已有的文献报道多通过凝胶色谱、TPT或实验室自制玻璃柱净化，实验步骤繁琐，有机溶剂用量大，造成实验时间成本高，环境负担高。

9,10-蒽醌分子结构式如下所示：

。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量的方法。该方法通过弗罗里硅土的固相分散，有效地简化实验步骤和降低有机溶剂使用量。该方法操作简便快速，有机溶剂用量少，在回收率、检出限及精密度等方面均能满足国内外茶叶中残留限量要求，可为茶叶9,10-蒽醌残留量的测定提供技术支持。

所述的固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品提取

取粉碎茶叶样品2 g于50 mL聚四氟乙烯离心管，加入2 mL蒸馏水，充分润湿后浸泡30 min；加入10 mL体积比为4：1的正己烷和丙酮混合溶液，超声提取30 min；加入2 g 无水硫酸镁摇匀冷却，涡旋30 s，以6000 r/min离心5 min；取5 mL上清液于鸡心瓶，35 ℃旋转蒸发至近干，用5 mL体积比为39:1的正己烷和丙酮混合溶液溶解残渣，待净化；

2）样品净化

取待净化液于10 mL离心管中，加入0.7 g加水脱活弗罗里硅土，涡旋1 min，6000 r/min 离心5 min；移取4 mL上清液于鸡心瓶中，35 ℃旋转蒸发至近干，氮气吹干；0.8 mL含内标氘代蒽醌体积比为39:1的正己烷和丙酮混合溶液定容，加入0.8 mL乙腈液液分配后静置，取乙腈层溶液过0.22 μm 有机膜，供GC-MS/MS测试；

3）GC-MS/MS测定

基质匹配标准溶液和样品溶液在以下设定的气相色谱-质谱/质谱条件下进样：

A）气相色谱-质谱/质谱仪器参数：

气相色谱：色谱柱：VF-5ms ，规格30 m×0.25 mm×0.25μm；程序柱温：80℃保持1min，以15℃ /min 的速率升温至240℃，再以25℃/min升温至280℃，保持5min；载气：氦气，纯度99.999%，流速1.0 mL/min；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；

质谱条件：电离方式：EI；碰撞气: 氩气，纯度99.999%，2.0 mTorr；

电离能量：70eV；离子源温度：210℃；传输线温度：280℃；测定方式：多级反应检测模式；定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差：相对离子丰度＞50％，允许的相对偏差±20％；相对离子丰度＞20％～50％，允许的相对偏差±25％；相对离子丰度＞10％～20％，允许的相对偏差±30％；相对离子丰度≤10％，允许的相对偏差±50％；

B）9,10-蒽醌质谱参数

4）空白试验

除不加样品外，均按上述步骤1）、步骤2）、步骤3）操作进行；

5）结果计算和表述

按以下公式计算样品中蒽醌的质量浓度，处理结果须扣除空白值：

式中：

X_i──样品中蒽醌的残留量，单位为毫克每千克；

C_i──从标准曲线上得到蒽醌的溶液浓度，单位为毫克每升；

V──样液最终定容体积，单位为毫升；

m──最终样液所代表的试样质量，单位为克；

6）判断

以质量浓度X为横坐标，峰面积比值Y为纵坐标，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量测定，样品溶液中待测物的响应值满足仪器检测的线性范围；定量和定性离子对同时存在，且信噪比≥3；样品溶液中待测物出现的色谱峰保留时间与基质匹配标准溶液一致，允许偏差小于±0.5％，则可确定含有该药物。

所述的固相分散净化快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量的方法，其特征在于：弗罗里硅土500℃条件下烘干4 h，于干燥器内冷却至室温，加入7%水w/w脱活。

本发明采用固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量，操作简便快速，有机溶剂用量少。在回收率、检出限及精密度等方面均能满足国内外茶叶中残留限量要求。

本发明的测定方法具有以下有益效果：

开发了固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量的方法，简化了实验操作步骤，降低了时间成本；实验过程不涉及柱净化步骤，减少了有机溶剂使用量，降低环境负担。

附图说明

图1为9,10-蒽醌（0.01mg/L）和氘代-蒽醌（0.04 mg/L）标样质谱图；

图2为提取溶剂不同丙酮含量对9,10-蒽醌提取效率影响；

图3为弗罗里硅土含水量对9,10-蒽醌提取效率的影响；

图4为弗罗里硅土量对9,10-蒽醌回收率的影响。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例一：质谱条件的建立

全扫描方式获得9,10-蒽醌特征离子m/z 208，180和152，选择离子丰度最高的208作为母离子。逐级增加碰撞能量，获得特征子离子180和152以及最优碰撞能量，选择不受茶叶基质干扰的m/z 208>152离子通道作为定量离子对，m/z 208>180作为定性离子对。同样的方式优化得氘代-蒽醌的定性定量离子对。质谱图见图1。

实施例二：提取溶剂的优化

丙酮和正己烷的混合比例对9,10-蒽醌回收率的影响见图2。当丙酮在正己烷中的体积分数低于10%时，平均回收率低于70%；增加提取溶剂中丙酮含量至20%及以上，回收率基本稳定在80-90%，满足残留分析的要求。由于丙酮含量增加会增加茶叶中极性物质的共提取，因此最终选择丙酮+正己烷（V/V = 1+4）作为提取溶剂。

实施例三：弗罗里硅土使用筛选

1）设置弗罗里硅土中含水量为1%，3%，5%，7%，10%，12%的不同处理，发现随着含水量的增加，9,10-蒽醌回收率提高（图3），含水量超过5%时，回收率稳定在80%左右。随着加水量的增加，提取液的颜色加深，因此选择7%含水量作为弗罗里硅土吸附剂的活化条件。

2）优化了弗罗里硅土加入量对回收率的影响（图4）。增加弗罗里硅土的量，可以有效提高净化效果。但是由于弗罗里硅土的吸附作用，弗罗里硅土的加入量与9,10-蒽醌的回收率呈明显的负相关关系，且在9,10-蒽醌的回收率在0.7 g以上时下降显著，因此弗罗里硅土的用量选用0.7 g。

实施例五：固相分散净化技术快速测定茶叶中9,10-蒽醌残留量的方法

1、试剂和材料

1.1 正己烷：色谱纯。

1.2 丙酮：色谱纯。

1.3 乙腈：色谱纯。

1.4 无水硫酸镁：分析纯，650℃灼烧4h, 在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。

1.5 9,10-蒽醌标准物质(Anthraquinone,,CAS:84-65-1，C₁₄H₈O₂ ) ：纯度99.0%。

1.6 氘代-蒽醌标准物质(D₈-Anthraquinone,CAS:10439-39-1) ：纯度98.6%。

1.7 标准储备溶液：准确称取标准物质(1.5)0.010 g（精确至0.0001 g）于50 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成100 mg/L储备标准溶液，于-20 ℃保存。

1.8 D₈-蒽醌标准储备溶液：准确称取标准品(1.6)0.010 g（精确至0.0001 g）于50 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成100 mg/L储备标准溶液，于-20 ℃保存。

1.9 标准中间液的配制：准确移取标准储备液适量(1.7)，用乙腈配制成10 mg/L的标准溶液；准确移取标准储备液适量(1.8)，用乙腈配制成4mg/L 的混合标准溶液于-20 ℃冰箱内避光储存。

1.10 标准工作溶液的配制：根据需要将标准中间溶液(1.9) 用乙腈稀释成适当浓度的标准工作溶液。

1.11 弗罗里硅土：150-250 μm，500 ℃条件下烘干4 h，加入7%水（w/w）活化，备用。

1.12 微孔滤膜：0.22μm，有机相。

2、仪器和设备

2.1 气相色谱-质谱/质谱仪：配有(EI) 离子源。

2.2 分析天平：感量0.00001g 和0.01g。

2.3 涡旋仪。

2.4 固体样品粉碎机。

2.5离心机。

2.6 超声仪。

2.7 氮吹仪。

3、测定步骤

3.1 样品提取

取粉碎茶叶样品2 g于50 mL聚四氟乙烯离心管，加入2 mL蒸馏水，充分润湿后浸泡30 min；加入10 mL正己烷和丙酮混合溶液（体积比4：1），超声提取30 min；加入2 g 无水硫酸镁摇匀冷却，涡旋30 s，以6000 r/min离心5 min；取5 mL上清液于鸡心瓶，35 ℃旋转蒸发至近干，用5 mL正己烷和丙酮混合溶液（体积比39:1）溶解残渣，待净化。

3.2 样品净化

取待净化液于10 mL离心管中，加入0.7 g加水脱活弗罗里硅土，涡旋1 min，6000 r/min 离心5 min；移取4 mL上清液于鸡心瓶中，35 ℃旋转蒸发至近干，氮气吹干；0.8 mL正己烷和丙酮混合溶液（体积比39:1，含内标氘代蒽醌）定容至0.8 mL，加入0.8 mL乙腈液液分配后，静置，取乙腈层溶液过0.22μm 有机膜，供GC-MS/MS测试。

3.3 测定

由于测试条件取决于所使用的仪器，因此不可能给出色谱分析的普遍参数。采用下列操作条件已被证明对测试是合适的。具体参数见表2、表3.

表2 气相色谱参数

表3 质谱条件参数

4、空白试验

除不加样品外，均按上述步骤进行；

5、结果计算和表述

按以下公式计算样品中蒽醌的含量，处理结果须扣除空白值：

式中：

X_i──样品中蒽醌的残留量，单位为毫克每千克；

C_i──从标准曲线上得到蒽醌的溶液浓度，单位为毫克每升；

V──样液最终定容体积，单位为毫升；

m──最终样液所代表的试样质量，单位为克。

通过GC-MS/MS测定茶叶中蒽醌的含量，标准曲线制作分别测定标样0.008mg/L，0.016mg/L，0.04mg/L，0.16mg/L，0.8mg/L的峰面积比值（AQ/d₈-AQ）为0.26，0.61，1.6，6.80，36.80，以响应值对9,10-蒽醌含量绘制标准曲线y = 46.222x - 0.2461 (R² = 0.9998)，待测样品峰面积比值为10，带入标准曲线计算，C_i为0.22mg/L，V为0.8 mL, m为1g，带入公式计算，X_i=0.18mg/L。

6、测定低限

本方法的测定低限为0.02 mg/kg。

7、回收率

本方法回收率实验设定了四个添加浓度，按本方法所确定的实验条件，对每个添加浓度进行5次实验，回收率及精密度结果见表4。

表4 样品的添加浓度及回收率范围