一种具有SERS活性的分离装置、制备方法及其应用与流程

本发明属于纳米技术与检测领域，具体涉及在尼龙66膜分离装置内修饰贵金属及半导体纳米粒子，制备一种具有SERS活性的分离装置、制备方法及其应用。

背景技术：

表面增强拉曼散射(SERS)是一种重要的分析手段，能在分子水平上检测出物质的大小、形状等信息，具有很高的灵敏性。在化学、生物医学和环境监控等领域受到广泛的关注。而SERS活性基底的选定和制备是该领域的一个研究关键，因为分子主要吸附在基底上，基底的表面形态和材质等因素能够影响SERS的信号强度和再现性，可以提高SERS检测的准确性和灵敏性，从而决定了SERS这种检测方法在实际生活中的应用。因而，制备SERS基底的主要原则是提高活性、稳定性和重现性并且降低成本。希望研究一种方法简单、容易控制、重复性好、应用广泛的新型SERS活性基底。

随着科技的发展，纳米层次的研究越来越被重视。继而，越来越多的具备多种性能的纳米材料快速发展起来。而兼具SERS活性又具有多组份分离性能(如多蛋白质分离和农药分子分离等)的装置一直是从事分析检测人员研究的重点。高分子聚合物薄膜具有优良的吸附性能，其表面可以结合各种各样的纳米材料。因此，本发明在尼龙66膜分离装置内部修饰金属或半导体纳米材料，它具有强的SERS活性，实现对多组分样品进行分离与检测的目的。

技术实现要素：

本发明设计了一种具有SERS活性的，由纳米粒子修饰的尼龙66聚合物分离装置，可以进行原位SERS测试，具有高灵敏性和重现性。因为纳米粒子的大小、形状和聚集度都影响着SERS增强，所以通过调控尼龙66聚合物浸在纳米粒子溶液的时间，控制纳米粒子的聚集程度，来获得可再生的SERS信号。本发明结合了SERS技术的原位检测、高灵敏性和快速等优势，可以将不同的小分子、农药和蛋白质等混合物进行分离和检测，同时这种分离装置成本低脱净率高。

为实现上述目的，本发明所述的一种具有SERS活性的分离装置的制备方法，其步骤如下：

(a)制备金纳米粒子溶液

将1～2mL、1％(w/v)氯金酸水溶液和2～4mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液加入到含有0.1～0.5g聚乙烯基吡咯烷酮的100mL蒸馏水中，加热至沸腾后反应20～40min，得到金纳米粒子溶液；

(b)制备金纳米粒子修饰的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置

将0.1～0.5mL步骤(a)制备的金纳米粒子溶液注入到装有尼龙66膜的分离装置内(装有尼龙66膜的装置购自于津腾实验设备有限公司，尼龙66膜的孔径为0.22μm～0.8μm，尼龙66膜的直径为13mm，面积为132.665mm²)，60～120分钟后白色的聚合物薄膜变为粉色，从而得到金纳米粒子修饰的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置；

(c)亲和素分子的吸附

将0.1～0.5mL的亲和素(卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素及类亲和素等)注入到经步骤(b)制备的装有尼龙66膜分离装置内，在37℃的环境中培育60～120分钟；然后用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS水溶液，含质量分数0.8％NaCl、0.02％KH₂PO₄、0.02％KCl和0.12％Na₂HPO₄·12H₂O)冲洗3～5次，再用氮气吹干，从而制备得到本发明所述的一种具有SERS活性的分离装置。

(d)制备标准样品吸附的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置

将标准样品atto610标记的生物素分子的磷酸盐缓冲液溶液注入到经步骤(c)制备的尼龙66膜分离装置内30～60分钟，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3～5次，再用氮气吹干；atto610标记的生物素分子的浓度分别为10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9mg/mL的磷酸盐缓冲液。

(e)SERS测试

对经步骤(d)得到的吸附有atto610标记的生物素分子的尼龙66膜分离装置进行SERS测试，得到SERS指纹图谱；

(f)绘制标准曲线

绘制步骤(e)得到的SERS指纹图谱中特征峰(538cm^-1)的峰强与atto610标记的生物素分子浓度的标准曲线；此标准曲线可以在利用步骤(c)得到的分离装置对atto610标记的生物素分子与其它分子进行分离的同时，对其浓度进行测量；

(g)混合样品回收率测定

atto610标记的生物素分子可以与亲和素分子特异性识别，因而可以检测到atto610的SERS信号。对于R6G标记的胰岛素分子，由于其与亲和素分子不能够特异性识别，因此可以在冲洗分离装置的同时分离掉R6G标记的胰岛素分子，而检测不到R6G分子的SERS信息。

将atto610标记的生物素分子(10^-5～10^-8mg/mL)和R6G标记的胰岛素分子(10^-3～10^-6mg/mL)混合的PBS溶液注入到经步骤(c)制备的尼龙66膜分离装置内30～60分钟，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3～5次，在这一过程中，atto610标记的生物素分子留在分离装置内，而R6G标记的胰岛素分子则被冲洗掉，再用氮气吹干；然后对分离装置进行SERS测试得到SERS指纹图谱，由SERS指纹图谱中特征峰(538cm^-1)的峰强并根据标准曲线可以计算混合的PBS溶液中atto610标记的生物素分子的浓度，进而计算混合的PBS溶液中atto610标记的生物素分子的回收率。

上述方法所述的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置内还可以修饰银纳米粒子、金银复合纳米粒子和半导体(TiO₂、ZnO或Cu₂O等)纳米粒子等。

本发明优点在于：该装置是首次将金纳米粒子修饰的三维SERS活性基片聚合物表面层应用在一个过滤器滤膜上所形成的多孔高分子过滤器。该发明在拉曼光谱学的现场测定上有很好的应用，能得到高质量的SERS光谱，具有较高的灵敏性和可重复性，同时成本低，材料容易制备。它可以通过SERS技术对蛋白质和配位体之间的相互作用检测，可以应用在小分子蛋白质的检测和识别，可以应用在农业和持久有机污染物等领域，具有良好的应用前景。

附图说明

图1：金纳米粒子吸附到尼龙66膜分离装置的制备过程示意图；

本发明获得的制备SERS活性的分离装置可由图1表述，在尼龙66膜分离装置(如图1-1)内装入金纳米纳米粒子120分钟(如图1-2)，得到白色的聚合物薄膜变为粉色(如图1-3)。

图2：金纳米粒子吸附到尼龙66膜分离装置内的扫描电镜照片

本发明获得的制备具有分离功能的SERS活性基底可由图2表述，图2可见，尼龙66过滤膜表面结合有金纳米粒子，金纳米粒子尺寸在15nm。尼龙66膜分离装置内还可以修饰银纳米粒子、金银复合纳米粒子、半导体纳米粒子(如氧化锌纳米粒子、氧化亚铜纳米粒子、二氧化钛纳米粒子等)等。

图3：atto610标记的生物素分子的SERS光谱图。其中atto610标记的生物素分子的浓度分别为(1)10^-5，(2)10^-6，(3)10^-7，(4)10^-8和(5)10^-9mg/mL。

本发明获得的SERS指纹图谱为标记分子atto610的信息，由于尼龙66膜分离装置内修饰有亲和素分子，它可以和atto610标记的生物素分子发生特异性识别。因此，对于未识别的其他分子(如R6G标记的胰岛素分子等)可以被过滤掉，而检测到atto610标记的生物素分子的SERS信息。

图4：atto610标记的生物素分子浓度(10^-5～10^-8mg/mL)变化与SERS强度之间的标准曲线。

本发明获得的标准曲线，其SERS强度与atto610标记的生物素分子浓度遵循线性关系为：Y＝-8507.81X+69540.54，R²＝0.9984，其中Y为SERS强度，X为atto610标记的生物素分子浓度。

具体实施方式

实施例1：一种具有SERS活性分离装置的制备方法，尼龙66膜分离装置内修饰金纳米复合材料。

(b)制备金纳米粒子溶液

将1mL、1％(w/v)氯金酸水溶液和4mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液加入到含有0.1g聚乙烯基吡咯烷酮的100mL蒸馏水中，加热至沸腾后反应30min，得到金纳米粒子；

(b)制备金纳米粒子修饰的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置

将0.5mL步骤(a)制备的金纳米粒子溶液注入到装有尼龙66膜(尼龙66膜的孔径为0.45μm)的分离装置内，90分钟后白色的聚合物薄膜变为粉色，从而得到金纳米粒子修饰的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置；

(c)亲和素分子的吸附

将0.5mL的卵黄亲和素注入到经步骤(b)制备的尼龙66(孔径为0.45μm)分离装置内，在37℃的环境中培育120分钟；然后用磷酸盐缓冲液(PBS，含0.8％NaCl、0.02％KH₂PO₄、0.02％KCl和0.12％Na₂HPO₄·12H₂O)冲洗3次，再用氮气吹干；从而制备得到本发明所述的一种具有SERS活性的分离装置。

(d)制备标准样品吸附的具有SERS活性的尼龙66膜分离装置

将标准样品atto610标记的生物素分子的磷酸盐缓冲液溶液注入到经步骤(c)制备的尼龙66膜分离装置内30分钟，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3次，再用氮气吹干；atto610标记的生物素分子的浓度分别为10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9mg/mL的磷酸盐缓冲液。

(e)SERS测试

将经步骤(d)，对吸附有atto610标记的生物素-亲和素体系的尼龙66膜分离装置进行SERS测试，得到SERS指纹图谱；

(f)绘制标准曲线

绘制步骤(e)得到的SERS指纹图谱中特征峰(538cm^-1)的峰强与atto610标记的生物素分子浓度的标准曲线；此标准曲线可以在利用步骤(c)得到的分离装置对atto610标记的生物素分子进行分离的同时，对其浓度进行测量；

(g)混合样品回收率测定

混合体系中atto610标记的生物素分子可以与亲和素分子特异性识别，因而可以检测到atto610的SERS信号。对于R6G标记的胰岛素分子，由于其与亲和素分子不能够特异性识别，可以被分离掉。将atto610标记的生物素分子(10^-7mg/mL)和R6G标记的胰岛素分子(10^-3mg/mL)的PBS溶液注入到经步骤(c)制备的尼龙66膜分离装置内30分钟，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3次，再用氮气吹干；然后对分离装置进行SERS测试，得到SERS指纹图谱，根据特征峰(538cm^-1)的峰强，并根据标准曲线计算出混合体系中生物素分子的浓度为9.55×10^-8mg/mL，而混合体系中atto610标记的生物素含量为10^-7mg/mL，经计算，其回收率为95.5％。