一种FcRn受体的ELISA检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种fcrn受体的elisa检测方法。

背景技术：

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。vegf由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育中的正常细胞及组织中表达，在体内调节血管的通透性，为血管形成过程中的多种细胞提供一个纤维网络；在体外能促进基质的降解以及内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管腔样结构的形成，并可动员骨髓来源的内皮祖细胞。vegf是诱导肿瘤血管形成的作用最强、特异性最高的血管生长因子。所以理论上来说，采用不同方法来干预或抑制血管内皮生长因子可以抑制肿瘤的生长。

抗vegf单抗是采用重组dna技术通过中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)细胞表达系统生产的重组人源化单克隆igg1抗体，包含93％的人源单抗序列和7％的可结合人vegf的鼠源单抗互补决定区序列，重链由453个氨基酸组成，轻链由214个氨基酸组成，分子量大约为149kda。治疗性单克隆抗体被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等治疗。单抗除具有特异性高、不良反应小和作用机制明确等特点外，半衰期长也是其独特的优势。当前的治疗性单抗大多为免疫球蛋白g(immunoglobuling，igg)，其在体内半衰期主要受fc段与新生儿fc受体(neonatalfcreceptor，fcrn)亲和力的影响，亲和力降低或提高可导致单抗体内半衰期的缩短或延长，通过igg-fcrn亲和力可以预测igg的体内半衰期。因此，测定单抗与fcrn的亲和力可以作为评价单抗药代动力学的间接指标。近年来，单抗生物类似药以及fc段改造和修饰类单抗不断涌现，评价该类单抗药物与fcrn亲和力的改变成为指导产品研发和生物类似药可比性研究的重要指标。igg与fcrn的结合呈现ph依赖的特点，在溶酶体内的低ph值条件下(ph5.5-6.5)，igg与fcrn结合使igg免于降解，待igg-fcrn复合物返回细胞表面后，在中性体液条件下，结合力降低，igg释放回体液中。

近年来，生物膜干涉技术(biolayerinterferomeory，bli)、biacore技术等被用于fcrn受体结合活性的测定，虽然简便快捷，但需要价格昂贵的大型设备，不利于普通实验室、小型生物公司的技术研发及产品质量的跟踪监测。而酶联免疫吸附测定法(elisa)方法，因其操作简单、快速、敏感性高、特异性强、设备要求简单，因此在实验室广泛应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是本发明创新性的利用夹心elisa方法检测抗vegf单抗与fcrn受体的结合能力，使抗体样品体外与fcrn受体的结合活性的检测更加简单易行。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种用elisa方法检测抗vegf单抗与fcrn受体的结合活性，即一种fcrn受体的elisa检测方法,其包括在酶标板上包被fcrn受体的包被步骤、封闭、样品配制、二抗孵育、底物显色的步骤，且所述样品配制步骤为：抗vegf单抗与抗原混匀后，静置一个小时形成免疫复合物。

本发明优选的技术方案中，抗vegf单抗与抗原的摩尔比在0.1～10:1之间；优选地，所述抗vegf单抗与抗原的摩尔比在0.5～5:1之间，更优选地，抗vegf单抗与抗原的摩尔比在1～3:1之间。

本发明优选的技术方案中，所述样品配制步骤中,还加入肝素，且加入的肝素在反应体系的终浓度≥0.05u/ml，优选为加入的肝素终浓度为0.05u/ml～5.00u/ml；更优选地，加入的肝素终浓度为0.05u/ml～0.50u/ml。以此，在反应过程中，形成抗原-抗体-肝素的超级复合物，增加了受体亲和度。

本发明优选的技术方案中，在包被步骤中，还加入连霉亲和素包被缓冲液到酶标板，优选地，连霉亲和素浓度为0.1～10μg/ml。本发明中，通过加入连霉亲和素，能够增加受体包被处理量，即增加包被受体浓度。

本发明优选的技术方案中，将所述的免疫复合物进行梯度稀释，加入包被好fcrn的酶标板上进行孵育。

本发明优选的技术方案中，所述抗vegf单抗为贝伐珠单抗(avastin)。

本发明优选的技术方案中，所述抗vegf单抗的分子式及分子量为：c6638h10160n1720o2108s44149kda，其轻链氨基酸序列如下：

diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnylnwyqqkpgkapkvliyftsslhsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqystvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec；

重链的氨基酸序列为：

evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftnygmnwvrqapgkglewvgwintytgeptyaadfkrrftfsldtskstaylqmnslraedtavyycakyphyygsshwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

本发明的抗vegf抗体fcrn受体结合活性检测方法是基于elisa方法，利用平行曲线(四参数曲线)模型测定相对活性。利用本发明检测方法能在体外快速、直接检测出抗vegf单抗与fcrn受体结合活性，且成本较低，实验操作方便，重复性好，结果判断客观、灵敏度高。为抗vegf单抗的一致性评价及临床药效及药代动力学研究也提供了参考信息。

附图说明

图1为fcrn受体与抗vegf单抗结合活性检测方法检测原理图。

图2为实施例1的fcrn与抗vegf单抗结合曲线图。从图中可知，采用加入肝素的方法，参数曲线可以很好达到上平台，而现有技术的检测方法是无法达到的。

图3为实施例2的fcrn与抗vegf单抗结合曲线图。从图中可知，采用连霉亲和素包被缓冲液的方法，参数曲线可以很好达到上平台，而已知的检测方法是无法达到此技术效果的。

图4a为抗vegf单抗的轻链氨基酸序列图；图4b为抗vegf单抗的重链氨基酸序列图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

介绍和概述

本发明通过举例而非给出限制的方式来进行说明。应注意的是，在本公开文件中所述的“一”或“一种”实施方式未必是指同一种具体实施方式，而是指至少有一种。

下文将描述本发明的各个方面。然而，对于本领域中的技术人员显而易见的是，可根据本发明的仅一些或所有方面来实施本发明。为说明起见，本文给出具体的编号、材料和配置，以使人们能够透彻地理解本发明。然而，对于本领域中的技术人员将显而易见的是，本发明无需具体的细节即可实施。在其他例子中，为不使本发明费解而省略或简化了众所周知的特征。

将各种操作作为多个分立的步骤而依次进行描述，且以最有助于理解本发明的方式来说明；然而，不应将按次序的描述理解为暗示这些操作必然依赖于顺序。

将根据典型种类的反应物来说明各种实施方式。对于本领域中的技术人员将显而易见的是，本发明可使用任意数量的不同种类的反应物来实施，而不只是那些为说明目的而在这里给出的反应物。此外，也将显而易见的是，本发明并不局限于任何特定的混合示例。

实验材料及器材

基本型漩涡混合器、酶标仪(厂家：moleculardevices，型号：spectramaxm2e)、酶标板(购自：corning)、微孔板恒温振荡器、洗板机(购自：thermo)

实验试剂：都为普通市售产品

磷酸盐缓冲液(pbs溶液)、样品稀释液/洗液、封闭液、显色液tmb、终止液(1m硫酸)、抗原rhvegf165、fcrn，肝素，连霉亲和素

实施实例1：以单个样品为例，阐述步骤如下：

标准品与样品稀释：

(1)用样品稀释液将贝伐珠单抗和参考品分别稀释到2mg/ml的浓度。

(2)取1.5mg/ml的样品，向其中加入浓度为0.3mg/ml的vegf，并加入样品稀释液，终浓度不少于0.05u/ml的肝素混匀后室温静置1～2小时。

(3)用样品稀释液将上述混合液梯度稀释8～11个浓度梯度。

实验步骤：

(1)用100μl3μg/ml的fcrn包被缓冲液加入酶标板各孔；用封口膜封口后，置于2-8℃条件下孵育16小时。

(2)取出酶标板弃掉包被液后，用洗板机每孔加300μl洗液(washbuffer)洗板2遍，将板在滤纸上拍干。

(3)在每个孔中加入100μl封闭液，用封口膜封口后，在室温条件下200rpm在微孔板振荡器上振摇孵育1～2h。

(4)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干。用洗板机每孔加300μl洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复2次。

(5)对于包被好的微孔板，分别在工作孔中加入梯度稀释的供试品溶液各100μl，用封口膜封口后，在室温条件下200rpm振摇孵育2h。

(6)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干，用洗板机每孔加300μl洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复4次。

(7)每孔中加入100μl的1000～5000倍稀释的酶标二抗稀释液，用封口膜封口后，在室温条件下200rpm振摇孵育60分钟。

(8)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干，用洗板机每孔加300μl洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复4次。

(9)每个工作孔中分别加100μl的tmb显色液，封口，室温避光孵育20～30分钟，工作孔出现蓝色。

(10)每孔分别加100μl的终止液，轻敲微孔板混匀，酶反应终止，原来显蓝色的孔将会变成黄色。

(11)终止反应半小时内，在450nm波长测吸光值，产生标准溶液和样品溶液的剂量效应曲线。

实施例2：

标准品与样品稀释：

(1)用样品稀释液ph5.8-6.0将贝伐珠单抗和参考品分别稀释到3μg/ml的浓度。

(2)取2μg/ml的样品，向其中加入浓度为0.3mg/ml的vegf165，制成tab008样品：vegf的摩尔比为2:1之间的混合液，混匀后室温静置1小时。

(3)将上述混合液梯度稀释8～11个浓度梯度。

实验步骤：

(1)用100μl0.5μg/ml的连霉亲和素包被缓冲液加入酶标板各孔；用封口膜封口后，置于2-8℃条件下孵育16-20小时。

(2)取出酶标板弃掉包被液后，用洗板机每孔加300μl洗液(washbuffer)洗板两遍，将板在滤纸上拍干。

(3)在每个孔中加入100μl封闭液，用封口膜封口后，在室温条件下200rpm在微孔板振荡器上振摇孵育1～2h。

(4)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干，用洗板机每孔加300μl洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复2次。

(5)在每个孔中加入100μl0.5～2μg/ml的生物素化fcrn，用封口膜封口后，在室温条件下200rpm在微孔板振荡器上振摇孵育1～2h。

(6)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干，用洗板机每孔加300μlph5.8-6.0洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复2次。

(7)对于包被好的微孔板，分别在工作孔中加入3倍梯度稀释供试品溶液ph5.8-6.0各100μl。用封口膜封口后，在室温条件下200rpm振摇孵育1～2h。

(8)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干，用洗板机每孔加300μlph5.8-6.0洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复4次。

(9)每孔中加入100μl的1000～5000倍稀释的酶标二抗稀释液ph5.8-6.0，用封口膜封口后，在室温条件下200rpm振摇孵育1～2h。

(10)从微孔板振荡器上取下微孔板，倾倒内容物，拍干，用洗板机每孔加300μlph5.8-6.0洗液(washbuffer)清洗，拍干，重复4次。

(11)每个工作孔中分别加100μl的tmb显色液，封口，室温避光孵育20～30分钟，工作孔出现蓝色。

(12)每孔分别加100μl的终止液，轻敲微孔板混匀，酶反应终止，原来显蓝色的孔将会变成黄色。

(13)终止反应半小时内，在450nm波长测吸光值，产生标准溶液和样品溶液的剂量效应曲线。

以上所述具体实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或替换，这些改进或替换也应当视为本发明的保护范围。