本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种快速检测氟硅唑的方法，尤其涉及利用表面增强拉曼光谱检测果蔬中氟硅唑的方法。
背景技术：
农药有助于铲除杂草、消灭病虫害和提高农作物产量，但是，施用产生的农药残留会对环境和食物造成污染，且随着农药的大量及不合理施用，环境和果蔬中的农药残留量越来越高。长期食用被农药污染的果蔬，导致农药在人体内部逐步积累，引起慢性中毒，危害人身安全。近年来，随着社会经济发展和人们生活水平的提高，果蔬中农药残留问题引起了人们的广泛关注。因此，研究一种快速、简单、有效的果蔬农药残留检测方法具有重要意义。
目前国内外关于农药残留的检测方法有很多，主要包括：色谱法、色谱-质谱联用法、超临界流体色谱法、毛细管电泳技术、酶联免疫吸附测定法等。这些色谱法虽然检测结果稳定、灵敏度较高，但普遍存在前处理程序复杂、操作繁琐、耗时长、检测成本高等问题。
拉曼光谱分析技术是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面的信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。以拉曼散射为基础建立的表面增强拉曼光谱(surface-enhancedramanspectroscopy，sers)通过将待测物分子吸附在粗糙金属材料表面，可使待测物的拉曼信号增强106～1015倍，从而解决了常规拉曼光谱灵敏度低的问题，使得一些微量和痕量物质得以检出。sers技术为食品等复杂体系中痕量物质的检测提供一种新的途径，现已广泛用于食品中痕量有机分子的分析。
表面增强拉曼光谱增强效果与很多因素有关，比如待测物分子结构，增强基底的组成元素类型、结构类型、形状、尺寸、吸附效果等。相同的增强基底，因待测物分子结构不同，表面增强拉曼光谱增强效果存在差异，导致不同的检测灵敏度；相同的待测物分子结构，因增强基底不同，表面增强拉曼光谱增强效果存在差异，导致不同的检测灵敏度。
果蔬成分复杂，其提取液中含有的糖类、色素、单宁等物质影响待测农药分子与基底结合，进而影响检测结果灵敏度。样品前处理可以尽量降低这些非目标化合物对sers检测影响，因此一种简单、高效的前处理方法也是必不可少的。
技术实现要素：
本发明提供一种快速检测氟硅唑的方法，该方法简便、快捷、准确的实现氟硅唑的定性和定量检测，尤其是果蔬中氟硅唑的定性和定量检测，并且灵敏度好，选择性高。
本发明技术方案为：一种快速检测氟硅唑的方法，以金核银壳纳米颗粒溶胶为增强基底，表面增强拉曼光谱检测样品液中氟硅唑。
所述样品液的制备方法为：(1)果蔬样品匀浆处理后得到的果蔬匀浆，依次加入乙腈、氯化钠和无水硫酸镁，离心或过滤后制得果蔬初步提取液；(2)向果蔬初步提取液中加入吸附剂吸附杂质后，去除吸附剂制得样品液，所述吸附剂为无水硫酸镁、psa和c18。
步骤(1)中，果蔬匀浆加入乙腈并混匀后，再加入氯化钠并混匀，之后再加入无水硫酸镁并剧烈搅拌，最后离心所得上清液或过滤所得滤液即为果蔬初步提取液。加入无水硫酸镁后剧烈搅拌，可避免无水硫酸镁遇水凝结成块，高效除水。
步骤(1)中，所述果蔬初步提取液的制备过程中，果蔬匀浆与乙腈的用量比为1g:(1.8～4)ml，优选为1g:2ml；果蔬匀浆与氯化钠的质量比为1:0.18～1，优选为1:0.2～0.5；果蔬匀浆与无水硫酸镁的质量比为1:0.55～1.2，优选为1:0.6～0.75。
步骤(2)中，离心或者过滤去除吸附剂。
步骤(2)中，无水硫酸镁与果蔬初步提取液的用量比为(0.2～0.6)g:1ml，优选为(0.22～0.25)g:1ml；psa与果蔬初步提取液的用量比至少为0.1g:1ml，优选为(0.1～0.5)g:1ml；c18与果蔬初步提取液的用量比至少为0.1g:1ml，优选为(0.1～0.5)g:1ml。
金核银壳纳米颗粒溶胶与样品液的体积用量比为1～3:1，优选为2:1。
金核银壳纳米颗粒溶胶中金核银壳纳米颗粒的粒径为60nm～105nm，优选为80nm～100nm，更优选为90nm±7nm。
以即时制备的金核银壳纳米颗粒溶胶为增强基底，表面增强拉曼光谱检测样品液中氟硅唑。
金核银壳纳米颗粒溶胶的制备方法为：(a)向沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液，反应后冰浴冷却，制得金种液；(b)将步骤(a)的金种液与抗坏血酸混合后，加入硝酸银，反应制得金核银壳纳米颗粒溶胶。
步骤(a)的反应体系中，氯金酸的摩尔浓度为2×10-4～2.5×10-4mol/l，优选为2.0×10-4～2.3×10-4mol/l；氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1:2.0～3.0，优选为1:2.5～2.6。
步骤(a)中，向沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液后剧烈搅拌，使反应完全；反应时间为5～10分钟。
步骤(b)的反应体系中，金元素的摩尔浓度为1.5×10-5～4.0×10-5mol/l，金元素、抗坏血酸和硝酸银的摩尔比为1:6.5×102～15.5×102:15～35；优选地，金元素的摩尔浓度为2.0×10-5～3.8×10-5mol/l，金元素、抗坏血酸和硝酸银的摩尔比为1:6.5×102～12.5×102:15～27.5；本发明的一个优选方案，金元素的摩尔浓度为2.2×10-5～2.5×10-5mol/l，金元素、抗坏血酸和硝酸银的摩尔比为1:12×102～12.5×102:27.2～27.5。
步骤(b)中，将步骤(a)的金种液与抗坏血酸混合后，逐滴加入硝酸银。反应时间为5～10分钟。
步骤(b)制得的金核银壳纳米颗粒溶胶于0～4℃保存。
表面增强拉曼光谱的激光波长为633nm，功率6mw，扫描范围为400～2000cm-1。
氟硅唑表面增强拉曼光谱的特征峰分别位于628±5cm-1、804±5cm-1、827±5cm-1、1103±5cm-1、1167±5cm-1、1355±5cm-1、1586±5cm-1，氟硅唑的上述特征峰强度与氟硅唑浓度呈良好的线性相关性，尤其是1103±5cm-1处的特征峰强度与氟硅唑浓度间线性关系较好，且1103±5cm-1处的特征峰强度高又无干扰。通过测定不同浓度的氟硅唑标准品表面增强拉曼光谱强度，绘制标准曲线，根据标准曲线法定量检测待测样品中氟硅唑的浓度，实现对果蔬中氟硅唑的定量分析。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明以金核银壳纳米颗粒溶胶作为表面增强拉曼光谱增强基底，能够简单、快速、准确、有效的实现果蔬中氟硅唑的定性和定量检测。
(2)本发明提供了一种简单、快速、廉价且操作易行的果蔬前处理方法，加入无水硫酸镁等吸水盐除去果蔬样品中水份，加入psa、c18等吸附剂除去糖类、色素、单宁等杂质。前处理过程中氟硅唑损失小，回收率好，精确度和准确度高；经该果蔬前处理方法制备的果蔬提取液无需滤膜过滤或者色谱柱分离等后续纯化处理，即可进行表面增强拉曼光谱检测。
(3)本发明方法能够检出的氟硅唑标准品的最低检出浓度为0.1mg/l，果蔬中氟硅唑的最低检出浓度为0.1μg/g，检测灵敏度高，选择性强。
附图说明
图1为氟硅唑标准品的拉曼光谱图。
图2为实施例2和实施例3不同用量金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜(tem)图。图中，图2(c)为0.4ml金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜图，图2(b)为0.5ml金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜图，图2(a)为0.9ml金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜图。
图3为实施例5各梯度浓度的氟硅唑标准水溶液表面增强拉曼光谱图。
图4为实施例6不同氟硅唑含量的梨肉提取液的拉曼光谱图。
图5为实施例4不同用量金种液制备的金核银壳纳米颗粒的氟硅唑检测灵敏度拉曼光谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施并不限于以下各实施例。
实施例1氟硅唑标准品的拉曼光谱检测
取约0.5mg氟硅唑标准品固体粉末置于载玻片上，压片，拉曼光谱检测。结果如图1所示，氟硅唑的主要特征峰位于：628cm-1、804cm-1、827cm-1、1103cm-1、1167cm-1、1355cm-1、1586cm-1，且能清晰辨认。
实施例20.5ml金种液制备金核银壳纳米颗粒溶胶
(1)制备金种液：将50ml浓度为2.0×10-4mol/l的氯金酸溶液加热至沸腾，加入0.74ml浓度为1wt％(约0.034mol/l)柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌，反应5min，冰浴冷却，制得金种液。
反应体系中，氯金酸的摩尔浓度约为1.97×10-4mol/l，氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比约为1:2.54。
(2)制备金核银壳纳米颗粒溶胶：取0.5ml刚合成好的金种液与1.2ml浓度为0.1mol/l抗坏血酸混合，逐滴加入2.7ml浓度为10-3mol/l硝酸银反应5min，制得金核银壳纳米颗粒溶胶，4℃保存备用。金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜图如图2(b)所示，金核银壳纳米颗粒的平均粒径为90±7nm。
反应体系中，金元素的摩尔浓度约为2.24×10-5mol/l，金元素、抗坏血酸和硝酸银的摩尔比约为1:1218:27.4。
实施例3其它用量金种液制备金核银壳纳米颗粒溶胶
取实施例2步骤(1)制备的金种液0.4ml，其他条件同实施例2步骤(2)，制得金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜图如图2(c)所示，金核银壳纳米颗粒的平均粒径为65±4nm。
取实施例2步骤(1)制备的金种液0.9ml，其他条件同实施例2步骤(2)，制得金核银壳纳米颗粒溶胶的透射电镜图如图2(a)所示，金核银壳纳米颗粒的平均粒径为98±6nm。
0.4ml金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶的反应体系中，金元素的摩尔浓度约为1.83×10-5mol/l，金元素、抗坏血酸和硝酸银的摩尔比约为1:1522:34.25。
0.9ml金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶的反应体系中，金元素的摩尔浓度约为3.70×10-5mol/l，金元素、抗坏血酸和硝酸银的摩尔比约为1:677:15.22。
实施例4不同用量金种液制备的金核银壳纳米颗粒溶胶对氟硅唑检测灵敏度的影响
取实施例2和实施例3制备的3种不同粒径金核银壳纳米颗粒溶胶，分别与同一浓度的氟硅唑标准液按2:1体积比混合，制得混合液；取5μl混合液滴加至干净的载玻片上，烘干后采用显微拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱测定。显微拉曼光谱仪功率为6mw，激光波长633nm，采集的波谱范围400～2000cm-1。
不同用量金种液制备的金核银壳纳米颗粒的氟硅唑检测灵敏度如图5所示，由图5可知，以实施例2(0.5ml金种液)制备的金核银壳纳米颗粒溶胶作增强基底，测得的表面增强拉曼光谱的特征峰强度最大，氟硅唑检测灵敏度最高。
实施例5氟硅唑标准溶液的表面增强拉曼光谱检测
首先配制梯度浓度的氟硅唑标准水溶液(2mg/l、1mg/l、0.5mg/l、0.2mg/l、0.1mg/l、0mg/l(空白对照)。分别取50μl各梯度浓度的氟硅唑标准水溶液，并单独与实例2(0.5ml金种液)制备的金核银壳纳米颗粒溶胶按1:2体积比混合，制得混合液；取5μl混合液滴加至干净的载玻片上，烘干后采用显微拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱测定。显微拉曼光谱仪功率为6mw，激光波长633nm，采集波谱范围400～2000cm-1。
各梯度浓度的氟硅唑标准水溶液表面增强拉曼光谱图如图3所示，氟硅唑的主要特征峰分别位于632cm-1、807cm-1、829cm-1、1103cm-1、1168cm-1、1358cm-1、1588cm-1。由图3分析可知，氟硅唑标准品的最低检出浓度为0.1mg/l，说明以金核银壳纳米颗粒作为增强基底的氟硅唑表面增强拉曼光谱检测，具有高灵敏度。
图1所示的氟硅唑在628cm-1、804cm-1、827cm-1、1167cm-1、1355cm-1、1586cm-1处的特征峰，分别对应位移图3所示的632cm-1、807cm-1、829cm-1、1168cm-1、1358cm-1、1588cm-1，原因可能为：氟硅唑的性状由固体粉末状变成水溶液状，氟硅唑与增强基底混合后进行表面增强拉曼光谱检测，平行试验重复性等。
因氟硅唑表面增强拉曼光谱的各主要特征峰的位置受诸多试验因素影响，如氟硅唑用量和/或性状、增强基底的用量和/或形状、承载氟硅唑和/或增强基底的载玻片的性状、显微拉曼光谱仪稳定性、试验环境、平行试验重复性等，氟硅唑各主要特征峰的位置或提前或延后，波动幅度为±5cm-1。
氟硅唑标准水溶液浓度与其主要特征峰的拉曼光谱强度之间的线性关系如表1。由表1可知，氟硅唑标准水溶液浓度与其主要特征峰的拉曼光谱强度之间呈良好的线性关系，尤其是1103±5cm-1处特征峰的拉曼光谱强度与氟硅唑标准水溶液浓度之间的线性关系较好，且1103±5cm-1处特征峰强度高，又无干扰。
表1氟硅唑标准溶液与其主要特征峰拉曼强度之间的线性关系
实施例6梨肉中氟硅唑表面增强拉曼光谱检测
分别制备6份不含氟硅唑的梨肉匀浆，每份梨肉匀浆的质量为10.00g，6份梨肉匀浆中分别加入0μg(空白对照)、1μg、2μg、5μg、20μg、50μg氟硅唑，对应制备成氟硅唑含量为0μg/g(空白对照)、0.1μg/g、0.2μg/g、0.5μg/g、2μg/g、5μg/g的梨肉匀浆。
上述加入氟硅唑的6份梨肉匀浆各称取5.00g，分别进行如下操作：加入10ml乙腈，混匀后；加入1.00g氯化钠，摇匀；再加入3.00g无水硫酸镁，剧烈搅拌，4000r/min离心5min；取上清液2ml加入0.45g无水硫酸镁、0.20gpsa(乙二胺-n-丙基硅烷)、0.20gc18，混匀，4000r/min离心5min，所得上清液即为梨肉提取液。上述加入氟硅唑的6份梨肉匀浆分别对应制备6份梨肉提取液。
上述6份梨肉提取液各取50μl，分别与实施例2(0.5ml金种液)制备的金核银壳纳米颗粒溶胶按1:2体积比混合，制得混合液。取5μl混合液滴加至干净的载玻片上，烘干后采用显微拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱测定。显微拉曼光谱仪功率为6mw，激光波长633nm，采集的波谱范围400～2000cm-1。检测结果如图4所示。
由图4可知，梨肉中氟硅唑的最低检出限为0.1μg/g(指每克梨肉中含有0.1μg氟硅唑)，优于国标(gb2763，2016)最低检出标准0.2μg/g。
本实施例梨肉提取液的前处理方法为：采用乙腈与梨肉匀浆混合提取后，加入无水硫酸镁等吸水盐除去梨肉中的水份，加入psa、c18等吸附剂除去梨肉中的糖类、色素、单宁等杂质。前处理过程中氟硅唑损失小，回收率好，精确度和准确度高；制备的梨肉提取液无需膜过滤或者色谱柱分离等后续纯化处理，即可进行表面增强拉曼光谱检测。
本实施例前处理方法简便易操作，前处理材料廉价易得，适用于其它果蔬产品的氟硅唑检测。且经试验证实，乙腈对氟硅唑表面增强拉曼光谱的特征峰无干扰。
需要指出的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项目技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。