葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂的检测方法与流程

本发明属于食品检验检疫
技术领域：
，涉及固相萃取-气相色谱-负化学源-串联质谱法(GC-NCI-MS/MS)，具体是指一种葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂的检测方法。
背景技术：
：随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，葡萄酒这一集营养性、功能性以及文化品位于一体的特殊饮品越来越受到人们的喜爱。浙江作为我国东南沿海经济较发达的省份，近年来葡萄酒消费量增长迅速，特别是进口葡萄酒。浙江口岸进口葡萄酒贸易额一直居全国同行业领先地位。葡萄酒消费市场的火爆程度可见一斑。然而，不论是进口还是国产葡萄酒，葡萄作为其最主要的生产原料在田间管理过程中，为防止病害发生，通常会喷施一定量的农药，有些农药在葡萄酒生产发酵过程中不易去除分解，会不同程度地残留在葡萄酒中，给饮用者健康带来潜在的威胁。2013年，美国环境工作组(EWG)发布的“最肮脏果蔬”黑名单中，葡萄位列第三，共检出15种农药残余成分，而在含有的农药种类方面，葡萄则位居榜首，总共含有64种不同的化学物质。因此，葡萄酒中的农药残留问题不容小觑。目前，有些国家已经对氟吡菌胺在食品中的最大残留量做了严格规定，如欧盟法规规定：在葡萄中最大残留量低至2.0mg/kg。这些法规在保护消费者健康利益的同时，也是重要的技术性贸易壁垒措施。因此，建立准确、可靠地测定葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂的含量非常重要。目前，常规的分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定量分析一般采用色谱技术和色谱质谱联用技术，色谱技术有气相色谱和液相色谱等方法，色谱质谱联用技术有液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定，对禁用药物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且要达到该法案规定的4个确证点。目前，由于国内外无相关标准或文献可循，因此，有必要对葡萄酒中的氟吡菌胺杀菌剂的检测方法进行研究，从而对葡萄酒中酰胺类杀菌剂进行监测，同时为国内葡萄酒企业出口到欧盟等地区时，能出具符合欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定的检测数据。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂的检测方法。由于负化学源（NCI）的选择性强，检测灵敏度随待测分子电负性的增强而显著提高，氟吡菌胺含有氯苯结构，电负性较强，因此选择NCI作为离子源既有较好的选择性，又有很高的灵敏度。串联质谱因采用多反应监测（MRM）模式可以很好的去除复杂基质的背景干扰，实现对目标物的定量分析。与目前普遍适用的单极质谱相比，具有更强的抗基质干扰能力和定性定量准确性。该方法结合固相萃取-气相色谱-负化学源-串联质谱法，能够对葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂同时进行测定，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为葡萄酒的快速检测提供了可靠的检测方法支持。为了实现上述目的，本发明提供一种葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂的检测方法，包括以下步骤：步骤一：待测样品的制备：称取0.7-1.3g葡萄酒样本，葡萄酒样本中加入超纯水，混匀后得到待检液；步骤二：待检液的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤一种制备的待检液上固定相萃取柱，经水淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的氟吡菌胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；步骤三：标准溶液的配置：配制浓度梯度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL和50.0ng/mL的氟吡菌胺溶液形成基质匹配标准工作溶液；步骤四：待测样品溶液的检测：将步骤二中的待测样品溶液和基质匹配标准工作溶液在气相色谱-负化学源-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中氟吡菌胺的浓度为横坐标，再以混合标准工作溶液中氟吡菌胺的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的氟吡菌胺的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算，以外标法定量，获得待测样品溶液中氟吡菌胺的浓度。本发明进一步设置为所述步骤二中的固定相萃取柱为德国BESTOWNHR-XSPE柱，并通过甲醇、水对SPE柱进行活化处理。本发明进一步设置为所述步骤二中的淋洗剂为水，洗脱溶剂为乙酸乙酯。本发明进一步设置为所述的步骤四中气相色谱-串联质谱仪的检测参数为：色谱柱：HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：在60℃保持1min，再以每分钟升高30℃的速度升温至200℃，最后以每分钟升高15℃的速度升高至300℃并保持5min；进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流量1.0mL/min；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999%；进样量口温度：240℃；离子源：化学源负离子模式（NCI）；甲烷作反应气，纯度≥99.999%，流量1.0mL/min；源温度：200℃。接口温度：250℃；采用上述方案，本发明通过加入超纯水对葡萄酒样品进行稀释，并对由超纯水稀释得到的待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和富集的过程。第一步纯化：先将待检液通过固相萃取小柱，经过水淋洗和乙酸乙酯洗脱；第二步富集：将第一步中纯化的待检液氮气浓缩近干，然后加入乙酸乙酯溶液溶解、经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为德国BESTOWNHR-XSPE柱，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的淋洗条件和洗脱条件，达到净化富集杀菌剂的目的。其次，本发明对于葡萄酒中的氟吡菌胺杀菌剂成分的定性定量检测分析是通过气相色谱-负化学源-串联质谱检测仪(GC-NCI-MS/MS)分析。先配置一组阶梯形的标准工作溶液，然后将标准工作液和待检液在气相色谱-负化学源-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5%，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有酰胺类杀菌剂。下面结合附图对本发明作进一步说明。附图说明附图1为本发明具体实施例中的氟吡菌胺化学结构式；附图2为本发明具体实施例中氟吡菌胺杀菌剂标准溶液(1.0ng/mL)MRM色谱图；附图3为本发明具体实施例中氟吡菌胺杀菌剂扫描二级质谱图；附图4为本发明具体实施例中氟吡菌胺标准工作曲线。具体实施方式本发明的具体实施例如图1-4所示是葡萄酒中氟吡菌胺杀菌剂的检测方法，其包括以下步骤：步骤一：待测样品的制备：称取0.7-1.3g葡萄酒样本，葡萄酒样本中加入超纯水，混匀后得到待检液；步骤二：待检液的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤一种制备的待检液上固定相萃取柱，固定相萃取柱为德国BESTOWNHR-XSPE柱，经水淋洗除去杂质，再用乙酸乙酯作为洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的氟吡菌胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；步骤三：标准溶液的配置：配制浓度梯度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL和50.0ng/mL的氟吡菌胺溶液形成基质匹配标准工作溶液；步骤四：待测样品溶液的检测：将步骤二中的待测样品溶液和基质匹配标准工作溶液在气相色谱-负化学源-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中氟吡菌胺的浓度为横坐标，再以混合标准工作溶液中氟吡菌胺的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的氟吡菌胺的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算，以外标法定量，获得待测样品溶液中氟吡菌胺的浓度。所述气相色谱-串联质谱仪的检测参数为：色谱柱：HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm，程序升温：在60℃保持1min，再以每分钟升高30℃的速度升温至200℃，最后以每分钟升高15℃的速度升高至300℃并保持5min；进样量：1μL；载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流量1.0mL/min；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999%；进样量口温度：240℃；离子源：化学源负离子模式（NCI）；甲烷作反应气，纯度≥99.999%，流量1.0mL/min；源温度：200℃。接口温度：250℃。*MS/MS定量离子对表1-氟吡菌胺杀菌剂GC-NCI-MS/MS检测条件化合物线性方程相关系数定量限ng/g氟吡菌胺Y=65.9967X+196.1420.99751.0表2-氟吡菌胺杀菌剂的线性方程、相关系数、定量限表3-4种酰胺类杀菌剂添加回收率、精密度(n=6)本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。当前第1页1 2 3