一种测定肽分子量的二维液相色谱及其用途的制作方法

本发明属于仪器分析领域，具体涉及一种测定肽分子量的二维液相色谱及其用途。

背景技术：

凝胶液相色谱被广泛应用于蛋白、肽分子量的测定或酶解产物中分子量分布的测定。然而随着样品复杂性的逐渐升高，传统一维凝胶液相色谱的单柱分析因其分辨率较低，色谱峰常呈现共洗脱的现象，与其他物质的色谱峰存在不同程度地重叠，无法满足样品的分析需求。

为改善色谱分离效果，科研工作者报道了一种同系列不同规格凝胶液相色谱柱多柱串联同时进行色谱分离的方法，由于该方法采用直接串联的方法连接凝胶色谱柱，很大程度上仍受限于凝胶色谱柱本身，因此只能在一定程度上提高其色谱分辨率，此外，采用不同规格的多柱串联，存在不同溶质在不同柱内的串峰现象，即原本在第一根色谱柱中先出峰的溶质可能由于非筛分效应在第二根柱内后出峰，此外，多柱串联时由于不同色谱柱的分子量有效分离区间不一致，可能造成未知的溶质分子截留，即大分子物质可能在后续的小分子色谱柱中被截留，为此发展一种新型的肽分子量测定方法是当下亟需解决的问题。

二维液相色谱作为一种新兴的色谱分离技术，其分离效率远高于传统一维液相色谱。但由于凝胶色谱的分析速度受到色谱柱材料最大压降限制，无法对其进行快速分析，且其分辨率极低，因此其常作为第一维液相色谱使用，而极少将其作为第二维液相色谱，此外，凝胶色谱进行肽分子量测定时，若无激光散射仪辅助进行粒径和分子量测定，则需要创建分子量测定的标准曲线，而当前现有二维液相色谱方案均缺少对第二维液相色谱进样的支持，因此凝胶色谱在第二维液相色谱的应用和发展严重受阻。

技术实现要素：

为了克服现有凝胶色谱测定肽分子量时存在的分辨率低、第二维凝胶色谱无法直接进样创建标准曲线的问题，本发明的首要目的在于提供一种以凝胶色谱为第二维液相色谱的二维液相色谱。将凝胶色谱柱作为第二维液相色谱，可以借助于第一维液相色谱的高效分离，对目标组分或全组分进行一次预分离，再经第二维凝胶色谱分析测定其肽分子量情况，可大大降低被分析组分在凝胶柱中的复杂性，从而提高其分离效率和分析准确性。

本发明的另一目的在于提供上述二维液相色谱在测定肽分子量中的用途，其分析方法以反相液相色谱、离子色谱或亲水作用色谱为第一维液相色谱，以凝胶色谱为第二维液相色谱分析方法，再辅以第二维液相色谱的进样支持用于创建凝胶色谱分子量校正曲线。在进行样品分析时，该方法利用第一维液相色谱对样品进行预先分离以降低流入凝胶色谱分析的样品复杂性和分析难度，从而提高了目标组分或全组分的分子量测定准确性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种二维液相色谱，包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、二维切换装置、第二维进样装置和两个样品环；

所述的第一维液相色谱柱和第二维液相色谱柱与二维切换装置连接；

所述的第二维液相色谱柱为凝胶色谱柱；

所述的二维切换装置和第二维进样装置都是多通阀，样品环一连接在二维切换装置的两个阀口之间，样品环二连接在第二维进样装置的两个阀口之间；

所述的样品环一用于储存来自第一维液相色谱的组分，而样品环二用于第二维液相色谱的样品进样，两个样品环的独立使用可减少第一维流出组分与第二维液相色谱进样组分之间的交叉污染；

所述的二维切换装置优选十通阀，所述的第二维进样装置至少为六通阀；

所述的二维液相色谱还包括色谱泵、进样装置和检测器；

第二维液相色谱需要装载标准品时，将标准品通过第二维进样装置与样品环二连接的阀口注入样品环二中；然后转动第二维进样装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经第二维进样装置、样品环二和二维切换装置，最终将样品环二中的标准品送入第二维液相色谱柱中进行分析，经检测后建立标准曲线；该环节与第一维液相色谱柱无关；

进行未知样品的肽分子量检测时，先将未知样品经第一维液相色谱柱分析，经检测后，细分的目标组分经二维切换装置流向样品环一中，该环节也称二维采样；然后转动二维切换装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经第二维进样装置、二维切换装置和样品环一，最终将样品环一中的目标组分送入第二维液相色谱柱中进行分析，经检测和计算测得肽分子量；

所述的第一维液相色谱柱为可在高水相条件下进行样品分析的反相液相色谱柱、离子液相色谱柱或亲水作用色谱柱；

所述的色谱泵是多泵或单泵，可以是高压、中压或低压液相泵；

所述的检测器为紫外检测器、示差检测器或激光散射仪。

上述的二维液相色谱可用于肽分子量的测定，测定方法包括以下步骤：

(1)肽分子量标准品通过第二维液相色谱柱的单维分析得到其相应的保留时间，并以此作分子量对数-保留时间之间的关系曲线图，通过线性拟合得出二者之间的量化关系(即为分子量标准品校正曲线)；

(2)样品首先经过第一维液相色谱柱的预分离得到不同的流出组分；

(3)流出组分(流出峰)在二维切换装置被切割并逐个转移至第二维液相色谱柱；

(4)第二维液相色谱柱对转移进来的组分进行色谱分离，检测样品流出组分(流出峰)的保留时间，结合步骤(1)中的分子量标准品校正曲线即可得出其对应分子量大小。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的肽分子量二维液相色谱通过第一维液相色谱柱在高水相下对样品进行高效分离，大大降低了目标分析组分在凝胶色谱中的样品复杂性，改善了其分离效果，进而提高了分子量分析的准确性。

2、本发明的肽分子量二维液相色谱实现了第二维液相色谱的直接进样，在建立分子量标准品校正曲线时可直接对第二维液相色谱进行单独进样分析，此时标准品的分析不需要经过第一维液相色谱，解决了第二维液相色谱的进样缺陷问题。此外，两个维度的液相色谱均含有进样器，可通过二维切换部分的切换轻松实现两个维度液相色谱的独立运行，实现一机两用，大大提高了仪器的利用率。

3、本发明的肽分子量二维液相色谱既可通过中心切割分析对一维液相色谱目标流出组分的分子量、分子量分布、接枝情况等进行分析，亦可通过全二维分析对一维液相色谱的全部流出组分进行分子量、分子量分布、支链分布、组成分布情况等分析，此外，全二维分析图谱还可进一步提供肽混合样品在两个维度上的分布情况，可作为其分离和分析方案的参考。

4、本发明的肽分子量二维液相色谱使用凝胶色谱作为第二维液相色谱，可以很好的兼容高水相流动相，有利于二维液相色谱与柱后生物酶催化反应的在线连接，有利于促进在线生物活性物质分离与检测的发展。

5、本发明中，二维切换阀所用样品环(样品环一)与第二维液相色谱进样阀所用样品环(样品环二)独立使用，可减少来自第一维样品组分与第二维液相色谱进样组分之间的交叉污染。

附图说明

图1是实施例的二维液相色谱处于标准品装载和分析状态时的连接示意图；

图2是实施例的二维液相色谱处于二维采样和分析状态时的连接示意图；

其中，a-色谱泵；b-进样装置；c-第一维液相色谱柱；d-二维切换装置；e-色谱泵；f-进样装置；g-样品环二；h-第二维液相色谱柱；i-检测器，j-样品环一。

图3是实施例的标准品校正曲线。

图4是实施例的样品C18单维洗脱曲线。

图5是实施例样品的全二维色谱图。

图6是对比例的样品色谱分离图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

一种二维液相色谱，如图1和图2所示，包括第一维液相色谱柱c(4.6×250mm C18分析色谱柱(大连依利特SinoChrom ODS-AP))、第二维液相色谱柱h(7.8×300mm凝胶色谱分析柱(Tosoh G2000SWXL))、二维切换装置d(电动十通阀(DIONEX PD105-702))、第二维进样装置f(六通阀)和两个样品环g和j；

所述的第一维液相色谱柱c和第二维液相色谱柱h与二维切换装置d连接；样品环一j连接在二维切换装置d的阀口4和7之间，样品环二g连接在第二维进样装置f的阀口1和4之间；

所述的二维液相色谱还包括色谱泵a和e(高压液相色谱泵(DIONEX ultimate DGP 3000SD))、进样装置b(DIONEX ultimate WPS 3000)和检测器i(紫外检测器(DIONEX ultimate DAD 3000))；

第二维液相色谱需要装载标准品时如图1所示，将标准品通过第二维进样装置f与样品环二g连接的阀口4注入样品环二g中；然后转动第二维进样装置f切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经第二维进样装置f的阀口3,4,1,2、二维切换装置d的阀口5和6，最终将样品环二g中的标准品送入第二维液相色谱柱h中进行分析，经检测后建立标准曲线；

进行未知样品的肽分子量检测时如图2所示，先将未知样品经第一维液相色谱柱c分析，经检测后，细分的目标组分经二维切换装置d的阀口3和4流入样品环一j中，该环节也称二维采样；然后转动二维切换装置d切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经第二维进样装置f的阀口3和2、二维切换装置d的阀口5,4,7,6，最终将样品环一j中的目标组分送入第二维液相色谱柱h中进行分析，经检测和计算测得肽分子量。

所述多通阀的号位仅为表明系统连接关系而使用，其具体使用号位可与厂商供货原号位不同，其号位命名和排序可从多通阀的任意接口开始按照逆时针或顺时针从1开始排序命名。

上述的二维液相色谱可用于肽分子量的测定，测定方法包括以下步骤：

(1)分别使用进样装置分别进样牛血清蛋白(BSA)、细胞色素C(CTC)、抑肽酶(APR)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln-Glu-Arg-Glu-Glu(WSREEQEREE)、Gly-Gly-Tyr-Arg(GGYR)以及Gly-Gly-Gly(GGG)并在第二维液相色谱柱中进行分析(进样体积分别为5μL)，获取其保留时间，以此作分子量对数及保留时间关系曲线并作线性拟合获得标准品校正曲线如图3；

(2)弹性蛋白肽(进样体积30μL)使用第一维的分析条件，首先在第一维C18色谱柱中进行分离得到其第一维洗脱曲线如图4所示；

(3)二维切换装置选取其一维流出组分(27.15-28.20min)转移至第二维进行凝胶色谱分析，转移间隔0.35min，分析结果如图5所示。

第一维分析部分流动相由各含0.1％三氟乙酸的乙腈(A)和水(B)组成，梯度洗脱条件：0-8.00min(88％A),8.00-20.00min(88-65％A),20.00-24.00min(65-88％A)and 24.00-45.00min(88％A)，流速为0.3mL/min。

第二维分析部分流动相由乙腈(40％)，水(60％)，三氟乙酸(0.1％)组成，采用等度洗脱，流速为1mL/min，检测波长214nm，采集频率10HZ。

对比例

采用现有技术的一维液相色谱方法对上述弹性蛋白肽样品进行凝胶色谱分析。分析仪器：DIONEX ultimate 3000高效液相色谱(配备四元梯度色谱泵，自动进样器，DAD检测器)；色谱柱为7.8×300mm凝胶色谱分析柱(TosohG2000SWXL)；流动相组成为：乙腈(40％)，水(60％)和三氟乙酸(0.1％)；洗脱条件为等度洗脱，洗脱曲线如图6所示。

由图3可知，使用第二维进样装置在第二维凝胶色谱创建分子量标准品校正曲线在该条件下获得了良好的相关性，相关系数R²＝0.959。

图4为弹性蛋白肽在反相液相色谱的单维分析结果，由图可知，弹性蛋白肽样品可在反相液相色谱上获得较好的分离效果，可分成较多的色谱峰，在此基础上使用全二维分析方法将各峰逐个转入第二维凝胶色谱分析，得到全二维RPLC-SEC分离图(图5)，结合图3的标准曲线，由图中可直观地看出第一维色谱流出全组分的分子量分布情况。

与对比例1中传统一维凝胶液相色谱存在诸多未知共洗脱峰的分析结果相比(图6)，本发明二维液相色谱可明显改善溶质在第二维凝胶色谱的分离效果和分析准确性，这充分说明了本发明二维液相色谱的先进性和创新性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。