一种紫苏子标准汤剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱与流程

本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种紫苏子标准汤剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱。

背景技术：

紫苏子为唇形科植物紫苏perillafrutescens(l.)britt.的干燥成熟果实，收载于《中华人民共和国药典》2015版一部，具有降气化痰、止咳平喘、润肠通便的功效。现代药理学研究表明，紫苏子主要含有脂肪油、生物碱类、糖类、黄酮类等成分，具有降血脂、止咳平喘、抗过敏、抗衰老、抗氧化等作用。紫苏子中黄酮类、酚酸类在抗菌方面发挥着重要作用，为其药物体系基本组成成分。在质量控制方面，谷丽华等在定性定量研究紫苏子中迷迭香酸基础上，对其黄酮类成分木犀草素、芹菜素进行了薄层定性分析；此外，有文献报道对紫苏子中脂肪酸类成分如α-亚麻酸、亚油酸或三萜类成分如熊果酸、齐墩果酸的含量进行测定；《中华人民共和国药典》2015版一部仅收载了紫苏子对照药材的鉴别和迷迭香酸的含量测定。由于中药的成分复杂,有效成分又多随产地、来源、采收季节等情况变化而变化,因此,采用指纹图谱技术全面反映药材的整体特征,并进一步与其活性相关联,对于完善目前的质量控制方法,保证临床用药的安全有效是十分必要的。唐雪阳等运用所建立的hplc-pda法表征紫苏子药物体系特征图谱质量，基于特征图谱中特征峰的数量及所属化学类型对15批紫苏子饮片进行质的表征，基于特征图谱中特征指标性成分木犀草素、芹菜素和迷迭香酸的含量及黄酮类(以木犀草素表征)、酚酸类(以迷迭香酸表征)的含量对15批紫苏子饮片进行量的表征，并基于基准饮片将15批紫苏子饮片质与量的表征结果分别进行关联性分析，有效精准地评价紫苏子饮片质量。

根据2016年国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，中药标准汤剂系遵循中医药理论，采用合格饮片按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。因此本发明在前人研究基础上，建立了紫苏子标准汤剂特征图谱及其含量测定方法。采用紫苏子特征图谱确定了迷迭香酸、芹菜素、木犀草素、木犀草苷、咖啡酸等11个特征峰，其中指认出5个峰。

技术实现要素：

本发明提供了一种紫苏子标准汤剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱。

本发明提供了一种紫苏子标准汤剂的检测方法，它是采用高效液相色谱法进建立的，其操作步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取待检样品，加甲醇溶液超声提取，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：参照物溶液的制备：取迷迭香酸、芹菜素、木犀草素、咖啡酸、木犀草苷对照品，加甲醇溶解；对照药材溶液的制备：取紫苏子对照药材，加甲醇溶液超声提取，滤过，取续滤液，即得。

(3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.1％甲酸为流动相a，以乙腈为流动相b梯度洗脱；流速为0.8-1.2ml/min；柱温：20℃～40℃；检测波长：284nm；梯度洗脱程序如下：

进一步的，步骤(1)所述的甲醇溶液浓度为80％；所述的超声提取功率为600w，提取频率为40khz，提取时间为20min。

进一步的，步骤(2)所述的迷迭香酸、芹菜素、木犀草素、咖啡酸、木犀草苷的浓度为每1ml分别含80μg、100μg、100μg、60μg、60μg的溶液。

进一步的，步骤(2)所述的对照药材溶液制备方法中甲醇溶液浓度为80％；药材与提取溶剂比例为1:25；所述的超声提取功率为600w，提取频率为40khz，提取时间为30min。

进一步的，步骤(3)所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。

本发明还提供了一种紫苏子标准汤剂的鉴别方法，它包括如下步骤：

(1)取紫苏子标准汤剂提取物制备供试品溶液；

(2)按前述紫苏子标准汤剂的指纹图谱建立方法进行高效液相色谱法检测；

(3)分析检测结果。

本发明的一种紫苏子标准汤剂的标准指纹图谱中，紫苏子标准汤剂特征图谱中共有11个特征峰，各特征峰与s峰的相对保留时间规定值为：0.340(峰1)、0.381(峰2)、0.457(峰3)、0.543(峰4)、0.684(峰5)、0.715(峰6)、0.936(峰7)、1.000(峰8，s)、1.381(峰9)、1.520(峰10)、1.829(峰11)。

本发明建立了紫苏子标准汤剂特征图谱及其含量测定方法。采用紫苏子特征图谱确定了迷迭香酸、芹菜素、木犀草素、木犀草苷、咖啡酸等11个特征峰，并指认出了其中的5个特征峰。可用于衡量紫苏子配方颗粒是否与临床汤剂基本一致。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为咖啡酸紫外吸收光谱图

图2为木犀草苷紫外吸收光谱图

图3为迷迭香酸紫外吸收光谱图

图4为木犀草素紫外吸收光谱图

图5为芹菜素紫外吸收光谱图

图6为紫苏子标准汤剂全波段扫描3d图谱

图7为紫苏子标准汤剂各波长比较图

图8为不同柱温考察下的紫苏子汤剂色谱图

图9为不同流速考察下的紫苏子汤剂色谱图

图10为延迟性实验考察下的紫苏子汤剂色谱图

图11为不同提取溶剂考察下的紫苏子汤剂冻干粉色谱图

图12为不同提取方法考察下的紫苏子汤剂冻干粉色谱图

图13为不同提取时间考察下的紫苏子汤剂冻干粉色谱图

图14为不同溶媒用量考察下的紫苏子汤剂冻干粉色谱图

图15为紫苏子标准汤剂色谱峰指认的特征图谱

图16为不同仪器考察下的紫苏子汤剂冻干粉色谱图

图17为紫苏子标准汤剂色谱柱耐用性考察色谱图

图18为紫苏子标准汤剂特征图谱(各图谱代表批次为s1：zszbt180701；s2：zszbt180702；s3：zszbt180703；s4：zszbt180704；s5：zszbt180705；s6：zszbt180706；s7：zszbt180707；s8：zszbt180708；s9：zszbt180709；s10：zszbt180710；s11：zszbt180711；s12：zszbt180712；s13：zszbt180713；s14：zszbt180714；s15：zszbt180715；s16：zszbt180716；s17：zszbt180717)

图19为紫苏子标准汤剂对照图谱峰(峰3：咖啡酸；峰5：木犀草苷；峰8(s)：迷迭香酸；峰9：木犀草素；峰10：芹菜素)

具体实施方式

实施例1紫苏子标准汤剂色谱条件的考察

1、色谱条件与系统适用性试验

(1)拟定的色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以0.1％甲酸为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为284nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000。

(2)参照物溶液的制备：取迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成1ml含80μg的溶液。取芹菜素、木犀草素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含100μg的溶液。取咖啡酸、木犀草苷对照品适量，加甲醇制成1ml各含60μg的溶液。

(3)对照药材溶液的制备：取紫苏子对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)20min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(5)测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2、色谱条件考察

(1)检测波长的选择：在拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对咖啡酸、木犀草苷、迷迭香酸、木犀草素、芹菜素进行分析，对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在284nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm波长下的色谱图。各对照品的紫外吸收光谱图见附图1-5，紫苏子标准汤剂全波长3d扫描图建附图6，紫苏子标准汤剂各波长比较图见附图7。

结果表明，在检测波长为284nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，各峰峰面积适中，故检测波长确定为284nm。

(2)柱温的考察：分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。色谱图见附图8，结果见表1。

表1柱温考察—特征峰相对保留时间比值

结果表明，柱温分别为25℃、30℃、35℃时，各特征峰的相对保留时间rsd为0.00％-5.20％，在柱温为30℃时，色谱图峰形较好，分离度适中，故柱温确定为30℃。

(3)流速考察:在拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。结果见附图9，表2。

表2流速考察—特征峰相对保留时间比值

结果表明，流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时，各特征峰的相对保留时间rsd为0.00％～7.25％，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。

(4)延迟性实验：在拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至120min。结果见附图10。结果表明，在色谱图采集到60min后，已将色谱峰采集完全，故将色谱图采集时间确定为60min。

综上所述，紫苏子标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以0.1％甲酸为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为284nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000。流动相的色谱条件见表3。

表3紫苏子标准汤剂特征图谱最终流动相梯度

实施例2紫苏子标准汤剂的供试品溶液制备方法考察

1、提取溶剂的考察：取紫苏子标准汤剂的冻干粉(批号：zszbt180701)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、80％甲醇、水、乙醇时进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见附图11。

结果表明，在流动相为甲醇和80％甲醇时，所得的色谱图接近，色谱峰信息量大，分离度好。考虑迷迭香酸含量测定，故选择80％甲醇作为提取溶剂。

2、提取方法考察：取紫苏子标准汤剂的冻干粉(批号：zszbt180701)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见附图12。

结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

3、提取时间考察：取紫苏子标准汤剂的冻干粉(批号：zszbt180701)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)，分别对供试品提取时间为20min、30min、40min时进行考察，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见附图13。

结果表明，在提取时间为20min时，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20min。

4、溶媒用量考察：取紫苏子标准汤剂的冻干粉(批号：zszbt180701)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)20min，分别对供试品溶媒用量为25ml、50ml、75ml进行考察，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见附图14。

结果表明，在溶媒用量为50ml时，色谱图峰面积大小适中。故供试品溶媒用量确定为50ml。

实施例3紫苏子标准汤剂的指纹图谱建立方法学考察

1、色谱峰指认

溶液的制备：按拟定的实验条件，制备紫苏子标准汤剂供试品溶液。

参照物溶液的制备：取芹菜素、木犀草素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含100μg的溶液。取迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成1ml含80μg的溶液。取咖啡酸、木犀草苷对照品适量，加甲醇制成1ml各含60μg的溶液。

对照药材溶液的制备：取紫苏子对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺紫苏子标准汤剂阴性对照溶液。对紫苏子标准汤剂特征图谱峰进行定位。结果见附图15。

结果表明，峰3为咖啡酸、峰5为木犀草苷、峰8为迷迭香酸、峰9为木犀草素、峰10为芹菜素。在以下方法学考察中，对样品中的11个峰进行考察。

2、精密度试验：精密称取紫苏子标准汤剂冻干粉(批号：zszbt180701)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次。结果见表4、表5。

表4精密度保留时间考察结果

表5精密度峰面积考察结果

结果表明，各峰保留时间的rsd值为0.02％-0.16％，峰面积的rsd值为0.09％-4.05％。该仪器精密度良好。

3、重复性考察：精密称取紫苏子标准汤剂冻干粉(批号：zszbt180701)6份，按拟定的实验方法进行制备及测定。结果见表6、表7。

表6重复性考察—特征峰相对保留时间比值

表7重复性考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，各特征峰相对保留时间的rsd在0.00％～0.36％，各特征峰相对峰面积的rsd在0.00％～4.45％，该方法重复性好。

4、中间精密度考察

(1)不同仪器考察：在拟定的实验条件基础上，分别精密称取紫苏子标准汤剂冻干粉(批号：zszbt180701)两份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、waterse2695-2998、岛津lc-20at高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为kromasil5hc-c18250×4.6mm)。见附图16，表8、表9。

表8不同仪器考察—特征峰相对保留时间比值

表9不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的rsd在0.00％～7.75％；各特征峰相对峰面积的rsd在0.00％～73.60％。

(3)不同人员和时间考察：在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(a、b)在不同时间(t1、t2)分别精密称取紫苏子标准汤剂冻干粉(批号：zszbt180701)各两份，制备供试品，进行测定。见表10、表11。

表10不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值

表11不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的rsd在0.00％～0.18％；各特征峰相对峰面积的rsd在0.00％～8.65％。

5、耐用性考察：在拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为agilentzorbaxeclipsexdb-c18(250×4.6mm，5μm)、watersc18(250×4.6mm5μm、kromasilc185μm4.6×250mm进行考察)。结果见附图17，表12、表13。

表12色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间

表13色谱柱耐用性考察—特征峰相对峰面积比值

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的rsd在0.00～4.76％峰相对峰面积的rsd在0.00％～12.41％。

6、稳定性考察：在拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h时测定。结果见表14、表15。

表14稳定性考察—特征峰相对保留时间

表15稳定性考察—特征峰相对峰面积

结果表明，其相对应的特征峰相对保留时间的rsd在0.00％～1.41％，特征峰相对峰面积的rsd在0.00％～7.98％。

综上所述，各特征峰相对保留时间的rsd在以上各项考察中均符合要求，该方法良好，可用于紫苏子标准汤剂指纹图谱的研究。

实施例4紫苏子标准汤剂标准指纹图谱

1、参照物溶液的制备：取迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成1ml含80μg的溶液。取芹菜素、木犀草素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含100μg的溶液。取咖啡酸、木犀草苷对照品适量，加甲醇制成1ml各含60μg的溶液。

2、对照药材溶液的制备：取紫苏子对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3、供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)20分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以0.1％甲酸为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为284nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000。

5、测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

6、标准指纹图谱建立：取17批紫苏子标准汤剂，制备供试品溶液，再按色谱条件进行测定，记录hplc图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对17批紫苏子标准汤剂进行合成，建立紫苏子标准汤剂特征图谱的指纹图谱及对照图谱。结果见附图18-19，表16-17。

表1617批紫苏子标准汤剂相对保留时间

表1717批紫苏子标准汤剂相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出的原则，共选择11个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰8作为s峰时，17批次紫苏子标准汤剂特征峰相对峰面积rsd在0.00％～59.92％，17批次紫苏子标准汤剂11个特征峰相对保留时间rsd均小于2.0％。但在不同仪器和不同色谱柱考察中，相对保留时间的rsd在0.00％～7.75％，因此，暂定供试品的相对保留时间应在规定值的±10％之内。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，其中1个峰应与参照物峰保留时间相同，与迷迭香酸参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.340(峰1)、0.381(峰2)、0.457(峰3)、0.543(峰4)、0.684(峰5)、0.715(峰6)、0.936(峰7)、1.000(峰8，s)、1.381(峰9)、1.520(峰10)、1.829(峰11)。