可大幅提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法与流程

本发明涉及农业科学
技术领域：
，具体涉及可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法。
背景技术：
：稻飞虱是一类重要的农业害虫属于同翅目，飞虱科，包括褐飞虱nilaparvatalugens白背飞虱sogatellafurcifera(horváth)和灰飞虱laodelphaxstriatellus(fallén)。三种稻飞虱都通过直接刺吸水稻危害，或者传播和诱发水稻病害，每年给我国的水稻产量造成极大地损失。正是由于稻飞虱巨大的危害性，国家多年来一直大量拨款用于防治三种稻飞虱，食性是研究稻飞虱危害水稻的非常重要的环节。稻飞虱主要通过刺吸式口器刺吸水稻茎叶组织液，口针穿刺进入水稻组织中，分泌唾液蛋白，进而形成一个类似管状结果的蛋白鞘，故名唾液鞘。稻飞虱通过唾液鞘不断的将水稻茎叶深处的营养物质吸收进体内；因此唾液鞘的长短乃至整个外部形态，都是我们科研人员研究稻飞虱食性的关键指标。然而由于稻飞虱本身体积比大米粒还小，唾液鞘则更小，非常难于观察，我们借助于扫描电子显微镜才可以观察到。但是扫面电子显微镜对唾液鞘样品的处理有很高的要求，科研人员经过前期的研究，提出了制备稻飞虱唾液鞘电镜样品的方法，但是，在科研人员的实际操作中，还有许多不完善的地方，导致观察到的稻飞虱唾液鞘扫描样品图片出现看不到样品、干裂、缺损、断裂、细节不清晰等问题，严重影响了我们防治稻飞虱科学研究的进展。我们根据自己实验中的经验，经过不懈的探索，形成了一整套稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品的制备方法，这非常有助于我们科研工作人员加快实验进度，借助于对稻飞虱食性的研究，更快的开发出防治三种稻飞虱的方法。技术实现要素：发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：本发明提供了可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法，包括以下步骤：1)样品的取材；取4-5龄稻飞虱若虫，并进行饲喂，并获得带有唾液鞘的parafilm膜；2)清洗：将带有唾液鞘的parafilm膜采用pbs缓冲液配制的乙醇溶液进行清洗；3)固定：将清洗完成的带有唾液鞘的parafilm膜用固定液进行固定，固定后，吸出固定液，加入pbs漂洗获得固定后的样品；4)脱水：将固定后的样品通过加入不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，样品在每个梯度的乙醇溶液停留5～10分钟获得脱水后的样品；5)乙醇置换：将脱水后的样品加入乙醇：醋酸异戊酯＝2～3:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯＝1:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动从样品中置换乙醇；6)干燥：用滤纸轻轻吸去残留在步骤5)得到的样品表面的醋酸异戊酯，将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为40～60℃，干燥时间为2h，需严格控制时间；7)粘样并镀膜：导电双面胶粘到样品台上，然后将干燥后的样品粘到样品台上的导电双面胶上，然后利用离子溅射镀膜法给样品镀金膜；8)样品的观察：将步骤7)得到的含有镀膜的样品的样品台，放入扫描电镜观察室进行观察，并对稻飞虱唾液鞘图片进行拍摄获得稻飞虱唾液鞘的扫描电镜图片。其中，所述步骤2)的pbs缓冲液配制的乙醇溶液的体积百分比浓度为75％。其中，所述步骤2)固定液为4％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合液或；所述步骤2)固定液为4％多聚甲醛和曲拉通x-100的混合液。其中，所述4％多聚甲醛和2.5％戊二醛体积比为1～3:1，所述4％多聚甲醛和曲拉通x-100的质量比为9～15:1。其中，所述步骤3)中的乙醇溶液浓度为30％～100％。有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：根据改进后的方法，可以解决稻飞虱唾液鞘扫描电镜照片中出现的看不到样品、干裂、缺损、断裂、细节不清晰等问题，形成完整的具有较高分辨率的表面光滑的稻飞虱唾液鞘图像，有助于稻飞虱取食和防治等相关研究的开展。附图说明图1稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是断裂的部分；图2稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示是干瘪倒伏的唾液鞘；图3稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是顶部干裂的部分；图4稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是顶部缺损塌陷的部分；图5稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是烘干不当干裂的部分；图6稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的单支的稻飞虱唾液鞘(实施例1改进后)；图7稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的双支的稻飞虱唾液鞘(实施例1改进后)；图8稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的双支的稻飞虱唾液鞘(实施例2改进后)；图9稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的双支的稻飞虱唾液鞘(实施例3改进后)；图10稻飞虱唾液鞘电镜图，其他人拍摄的稻飞虱唾液鞘电镜图，图片来源于著名sci杂志plantphysiology：xinxinshangguan,jingzhang,bingfangliu，yanzhao,huiyingwang,zhizhengwang,jianpingguo,weiweirao,shenglijing,weiguan,yinhuama,yanwu,lianghu,rongzhichen,bodu,lilizhu,dazhaoyu,andguangcunhe(2018)amucin-likeproteinofplanthopperisrequiredforfeedingandinducesimmunityresponseinplants.plantphysiology.vol.176,pp.552–565。具体实施方式以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。实施例11、取样：取20头左右4-5龄稻飞虱若虫，在25℃，相对湿度为60％，光周期为16:8(d：l)条件下，饲喂24h。以灰飞虱为例，在上述温湿条件下：取一个两端都开口直径2.5cm的玻璃管，一端封纱布，另一端封双层parafilm膜(两层膜内包含稻飞虱人工饲料)，玻璃管内放入稻飞虱。饲喂24h，揭开双层parafilm膜，即获得带有唾液鞘的parafilm膜；表1人工饲料中稻飞虱若虫数目、饲喂时间与能否观察到唾液鞘之间的关系：2、样品的清洁：将带有唾液鞘的parafilm膜，用pbs缓冲液(nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l，ph7.2～7.4)稀释的75％的乙醇溶液中，清洗1h，每15min更换一次清洗液。后置于pbs缓冲液中，再清洗2次，每次5min。3、样品的固定：将清洗后的带有唾液鞘的parafilm膜，用以下2种方式均可，需严格控制固定液比例和固定时间。表2稻飞虱唾液鞘固定液的配置比例固定液比例第一种：4％多聚甲醛：2.5％戊二醛1:1第二种：4％多聚甲醛：曲拉通x-1009:1当选择第一种固定液时4℃固定1h，当选择第二种固定液时4℃固定过夜。固定后，吸出固定液，加入磷酸缓冲液(pbs)漂洗1h，每20min换液一次。4、样品的脱水：吸出磷酸缓冲液(pbs)，加入15％的乙醇溶液平衡1h，后依次加入体积百分比为30％-40％-50％-60％-70％-80％-90％-100％的乙醇溶液进行梯度脱水，重复两次，样品在每个梯度的乙醇溶液停留时间为5-10min，需严格控制时间。5、从样品中置换乙醇：吸出乙醇溶液，加入体积比为乙醇：醋酸异戊酯＝2:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯＝1:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动。6、样品的干燥：用滤纸轻轻吸去残留在样品表面的醋酸异戊酯，先将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为40℃，干燥时间为2h，需严格控制时间。7、粘贴样品：将导电双面胶粘到样品台上(唾液鞘只存在于parafilm膜一侧，注意不要贴反：不含唾液鞘的一侧贴到双面导电胶的一侧，含唾液鞘的在外侧，用于后续喷金导电处理观察)；粘贴时用两个镊子分别夹住parafilm膜两边，轻轻用力拉扯，将parafilm膜平整粘到样品台得到导电双面胶上(不能有气泡)。注：不能用手触碰parafilm膜，否则导致如图2所示，唾液鞘发生干瘪倒伏的现象。8、样品的导电处理：利用离子溅射镀膜法为样品镀金膜。9、样品的观察：含有镀膜的样品的样品台，放入扫描电镜观察室进行观察，并对稻飞虱唾液鞘图片进行拍摄。经过上述步骤，完成稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图6，图7所示。我们拍摄的唾液鞘照片比之前文献中(高水平sci论文)出现的如图10所示的唾液鞘照片，细节更加清晰且立体感更强。实施例21、取样：取30头左右4-5龄稻飞虱若虫，在25℃，相对湿度为60％，光周期为16:8(d：l)条件下，饲喂24h。取一个两端都开口直径2.5cm的玻璃管，一端封纱布，另一端封双层parafilm膜(两层膜内包含稻飞虱人工饲料)，玻璃管内放入稻飞虱。饲喂24h，揭开双层parafilm膜，即获得带有唾液鞘的parafilm膜。2、样品的清洁：将带有唾液鞘的parafilm膜，用磷酸缓冲液(pbs)稀释的75％的乙醇溶液中，清洗1h，每15min更换一次清洗液。后置于pbs中，在清洗2次，每次5min。3、样品的固定：稻飞虱唾液鞘固定液的配置比例为4％多聚甲醛：2.5％戊二醛＝3:1，4℃固定1h；或者选取固定液4％多聚甲醛：曲拉通x-100＝15:1，4℃固定过夜。固定后，吸出固定液，加入磷酸缓冲液(pbs)漂洗1h，每20min换液一次。4、样品的脱水：吸出磷酸缓冲液(pbs)，加入15％的乙醇溶液平衡1h，后依次加入30％-40％-50％-60％-70％-80％-90％-100％的乙醇溶液进行梯度脱水，重复两次，样品在每个梯度的乙醇溶液停留时间为5-10min，需严格控制时间。5、从样品中置换乙醇：吸出乙醇溶液，加入乙醇：醋酸异戊酯＝3:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯＝1:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动。6、样品的干燥：用滤纸轻轻吸去残留在样品表面的醋酸异戊酯，先将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为50℃，干燥时间为1.5h，需严格控制时间。7、粘贴样品：将导电双面胶粘到样品台上；粘贴时用两个镊子分别夹住parafilm膜两边，轻轻用力拉扯，将parafilm膜平整粘到样品台得到导电双面胶上。8、样品的导电处理：利用离子溅射镀膜法为样品镀金膜。9、样品的观察：含有镀膜的样品的样品台，放入扫描电镜观察室进行观察，并对稻飞虱唾液鞘图片进行拍摄。经过上述步骤，完成稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图8所示。实施例31、取样：取25头左右4-5龄稻飞虱若虫，在25℃，相对湿度为60％，光周期为16:8(d：l)条件下，饲喂24h。2、样品的清洁：将带有唾液鞘的parafilm膜，用磷酸缓冲液(pbs)稀释的75％的乙醇溶液中，清洗1h,每15min更换一次清洗液。后置于pbs中，在清洗2次，每次5min。3、样品的固定：稻飞虱唾液鞘固定液的配置比例为4％多聚甲醛：2.5％戊二醛＝2.5:1，4℃固定1h；或者选取固定液4％多聚甲醛：曲拉通x-100＝12:1，4℃固定过夜。选取固定后，吸出固定液，加入磷酸缓冲液(pbs)漂洗1h，每20min换液一次。4、样品的脱水：吸出磷酸缓冲液(pbs)，加入15％的乙醇溶液平衡1h，后依次加入30％-40％-50％-60％-70％-80％-90％-100％的乙醇溶液进行梯度脱水，重复两次，样品在每个梯度的乙醇溶液停留时间为5-10min，需严格控制时间。5、从样品中置换乙醇：吸出乙醇溶液，加入乙醇：醋酸异戊酯＝2.5:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯＝1:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动。6、样品的干燥：用滤纸轻轻吸去残留在样品表面的醋酸异戊酯，先将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为45℃，干燥时间为2h。7、粘贴样品：将导电双面胶粘到样品台上；粘贴时用两个镊子分别夹住parafilm膜两边，轻轻用力拉扯，将parafilm膜平整粘到样品台得到导电双面胶上。8、样品的导电处理：利用离子溅射镀膜法为样品镀金膜。9、样品的观察：含有镀膜的样品的样品台，放入扫描电镜观察室进行观察，并对稻飞虱唾液鞘图片进行拍摄。经过上述步骤，完成稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图9所示。对比例1本对比例实验步骤与实施例1基本一样，所不同的在于，本对比例中样品的清洁步骤中采用的是纯水稀释的体积百分比为75％的乙醇溶液清洗样品，完成的稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图1所示，从图中可以看出唾液鞘出现断裂的情况。对比例2本对比例实验步骤与实施例1基本一样，所不同的在于，本对比例中样品的固定步骤中的固定液仅使用4％多聚甲醛固定，且固定是在室温下完成；完成的稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图2所示，从图2中所示，唾液鞘发生干瘪倒伏的现象。对比例3本对比例实验步骤与实施例1基本一样，所不同的在于，本对比例中样品的脱水步骤中采用体积百分比浓度为30％-50％-70％-90％-100％这样的乙醇溶液进行梯度脱水，完成的稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图3所示，唾液鞘端部容易发生干裂。对比例4本对比例实验步骤与实施例1基本一样，所不同的在于，本对比例中从样品中置换乙醇步骤中乙醇：醋酸异戊酯＝1:2(醋酸异戊酯体积比例超过乙醇的体积比例)或者当乙醇：醋酸异戊酯不等于1:1，完成的稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图4所示，图4中出现顶部缺损塌陷的情况。对比例5本对比例实验步骤与实施例1基本一样，所不同的在于，本对比例中样品的干燥时间超过两个小时，比如3小时，完成的稻飞虱唾液鞘的扫描电镜照片拍摄如图5所示，出现了干燥过度干裂的情况。对比例6本对比例是在之前文献中出现的唾液鞘图片如图10(来源于著名sci杂志,plantphysiology)。本发明的实施例1～3获得的图片图6～9具有显著优势：表面细节清晰(能看到明显的孔洞)，背景反差正常，能更好的反应稻飞虱唾液鞘的情况。另外一方面，我们也可以通过比较能观察到的唾液鞘的数目，来展示我们的改进成果。表3可观察到的唾液鞘数目注：稻飞虱唾液鞘一般分为3支，2支，1支。从数据上看，我们可观察到合格的唾液鞘数目显著多于文献中所报道的唾液鞘数目；说明按照我们的方法可观察到更多正常形态的唾液鞘，说明我们改进后的方法明显更好。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，这些引伸出的变化或变动也处于本发明的保护范围之中。当前第1页12