Fmoc-Arg(Pbf)-OH的纯度及杂质定位检测方法与流程

本发明涉及分析化学领域，尤其是一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法。

背景技术：

保护氨基酸是指氨基酸的功能团与其它基团反应而封闭了氨基酸功能基团活性的氨基酸衍生物，其是多肽及多肽药物的核心合成原料，大量应用于医药化工行业。

n-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-l-精氨酸，简称fmoc-arg(pbf)-oh，是保护氨基酸中一个重要的产品，市场需求量很大。目前对于fmoc-arg(pbf)-oh的质量检测标准及检测方法没有相应的国家标准及行业标准，行业中对fmoc-arg(pbf)-oh检测方法大同小异，但在fmoc-arg(pbf)-oh纯度的检测中，行业中普遍存在的问题是对杂质的不完全分离，导致其纯度难以提高，阻碍其应用。对此，需要一种能完全分离杂质的纯度检测方法来解决此问题。

技术实现要素：

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，该方法能使样品在高效液相分析中更有效的实现杂质分离，对其测定的纯度更接近真实值，同时，还能对fmoc-arg(pbf)-oh中的常见杂质进行定位，对产品质量控制及产品生产研发都具有重要的指导意义。

本发明采用的技术方案如下：

fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，其包括如下步骤：

（1）将fmoc-arg(pbf)-oh的样品和对照品分别溶于溶剂中，得到样品溶液和对照溶液，以溶剂为空白溶液，用高效液相色谱对样品溶液进行浓度检测；

（2）将多种杂质的对照品分别溶于溶剂中，得到多种杂质溶液；将多种杂质溶液分别与样品溶液混合，得到多种混合溶液；分别取多种混合溶液进行混合，并加入样品溶液得到总混合液；

（3）以溶剂为空白溶液，按照进样顺序为：空白溶液、样品溶液、各种混合溶液、总混合液依次进样，进行高效液相色谱检测。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，步骤（1）中，所述色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，流动相流速为0.5-1.2ml/min，进样量为10-30μl，柱温为20-30℃，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，采用紫外检测器进行检测，检测波长为210-260nm。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，流动相a为体积比为0.2-1:1000的三氟乙酸和水，流动相b为体积比为0-1:1000的三氟乙酸和乙腈。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，梯度洗脱过程如下：

时间（min）流动相a（%）流动相b(%)

20-4060→040→100

0-100100

0.08-0.20→60100→40

后运行5-406040。

以上过程的具体解释为：在前30-40分钟内，流动相a从占流动相的体积分数的60%到逐渐减少0，流动相b占流动相的体积分数的40%逐渐增加到100%；接下来的0-10min内，维持用流动相b进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相a至其占流动相的体积分数的60%，同时减少流动相b至其占流动相的体积分数的40%，最后，在含60%（v/v）流动相a和40%（v/v）流动相b的条件下继续运行5-40min。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，所述溶剂为乙腈。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，样品溶液浓度为0.1-1mg/ml，对照品溶液度为0.1-1mg/ml。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，步骤（2）中，多种杂质包括但不限于arg(pbf)-oh、fmoc-arg-oh、fmoc-β-ala-oh、z-arg(pbf)-oh•cha、fmoc-β-ala-arg(pbf)-oh、fmoc-osu、fmoc-orn(fmoc)-oh、fmoc-orn(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-ome、fmoc-arg(pbf)-arg(pbf)-oh。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，杂质溶液浓度与样品溶液浓度之比为0.5-2:1，杂质溶液与样品溶液的体积比为1-10:1000组成混合溶液。

本发明的一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，组成总混合液的各成分中，各杂质溶液体积相等，样品溶液与每种杂质溶液的体积之比为1-10:1000。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明提供了fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，该方法利用高效液相的分析、分离功能，在合适的色谱条件下对fmoc-arg(pbf)-oh进行浓度分析和杂质定检测。由于该方法能使样品在高效液相分析中更有效的实现杂质分离，对其测定的纯度更接近真实值，同时，还能对fmoc-arg(pbf)-oh中的常见杂质进行定位，对产品质量控制及产品生产研发都具有重要的指导意义。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1是实施例4中高效液相色谱分析的峰图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1

本实施例提供一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，该方法对fmoc-arg(pbf)-oh中的杂质进行定位、分离，实现更精确的浓度分析，促进产品的质量控制及生产研发。其包括如下步骤：

步骤一：将fmoc-arg(pbf)-oh的样品和对照品分别溶于溶剂中，得到样品溶液和对照溶液，以溶剂为空白溶液，用高效液相色谱对样品溶液进行浓度检测。

步骤二：将多种杂质的对照品分别溶于溶剂中，得到多种杂质溶液；将多种杂质溶液分别与样品溶液混合，得到多种混合溶液；分别取多种混合溶液进行混合，并加入样品溶液得到总混合液。

步骤三：以溶剂为空白溶液，按照进样顺序为：空白溶液、样品溶液、各种混合溶液、总混合液依次进样，进行高效液相色谱检测。

实施例2

本实施例提供一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，该方法对fmoc-arg(pbf)-oh中的杂质进行定位、分离，实现更精确的浓度分析，促进产品的质量控制及生产研发。其包括如下步骤：

步骤一：将fmoc-arg(pbf)-oh的样品和对照品分别溶于乙腈中，得到浓度分别为0.1mg/ml的样品溶液和对照溶液，以乙腈为空白溶液，用高效液相色谱对样品溶液进行浓度检测。其中，进样顺序及进样量分别为：空白溶液进一针、对照品溶液进一针、样品溶液进二针，其中每针20μl；采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（5μm，4.6×250mm），柱温为20℃，流动相a为为体积比为0.2:1000的三氟乙酸和水，流动相b为体积比为0.2:1000的三氟乙酸和乙腈，流速为0.5ml/min，并按照表1所示的条件进行梯度洗脱，紫外检测波长为210nm，色谱分析完成后，按面积归一化法计算其纯度。

表1梯度洗脱过程及条件

注：表1所表示的过程解释为：在第20分钟内，流动相a从占流动相的体积分数的60%到逐渐减少0，流动相b占流动相的体积分数的40%逐渐增加到100%；接下来的10min内，维持用流动相b进行洗脱；随后的0.08min内，逐渐增加流动相a至其占流动相的体积分数的60%，同时减少流动相b至其占流动相的体积分数的40%，最后，在含60%（v/v）流动相a和40%（v/v）流动相b的条件下继续运行5min。

步骤二：将多种杂质的对照品分别溶于溶剂中，得到多种浓度为2mg/ml的杂质溶液；将多种杂质溶液分别按照体积比为1：1000与样品溶液混合，得到多种混合溶液；分别取多种混合溶液进行等体积混合，并加入样品溶液得到总混合液；其中，样品溶液与每种杂质溶液的体积之比为1:1000。

步骤三：以溶剂为空白溶液，按照进样顺序为：空白溶液、样品溶液、各种混合溶液、总混合液依次进样，进行高效液相色谱检测。色谱条件同步骤一。

实施例3

本实施例提供一种fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法，该方法对fmoc-arg(pbf)-oh中的杂质进行定位、分离，实现更精确的浓度分析，促进产品的质量控制及生产研发。其包括如下步骤：

步骤一：将fmoc-arg(pbf)-oh的样品和对照品分别溶于乙腈中，得到浓度分别为0.5mg/ml的样品溶液和对照溶液，以乙腈为空白溶液，用高效液相色谱对样品溶液进行浓度检测。其中，进样顺序及进样量分别为：空白溶液进一针、对照品溶液进二针、样品溶液进二针，其中每针20μl；采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（ec4.6×250mmnucleosil100-5c18），柱温为25℃，流动相a为体积比为0.5:1000的三氟乙酸和水，流动相b为体积比为0.5:1000的三氟乙酸和乙腈，流速为0.8ml/min，并按照表2所示的条件进行梯度洗脱，紫外检测波长为220nm，色谱分析完成后，按面积归一化法计算其纯度。

表2梯度洗脱过程及条件

注：具体解释参照表1的注解。

步骤二：将多种杂质的对照品分别溶于乙腈中，得到多种浓度为0.2mg/ml的杂质溶液；将多种杂质溶液分别按照体积比为1：100与样品溶液混合，得到多种混合溶液；分别取多种混合溶液进行等体积混合，并加入样品溶液得到总混合液；其中，样品溶液与每种杂质溶液的体积之比为1:100。

步骤三：以乙腈为空白溶液，按照进样顺序为：空白溶液、样品溶液、各种混合溶液、总混合液依次进样，进行高效液相色谱检测。色谱条件同步骤一。

实施例4

本实施例对本发明提供的fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法进行验证，为其实际应用提供依据。实验方法如下：

步骤一：将fmoc-arg(pbf)-oh的样品和对照品分别溶于乙腈中，得到浓度分别为1mg/ml的样品溶液和对照溶液，以乙腈为空白溶液，用高效液相色谱对样品溶液进行浓度检测；

其中，进样顺序及进样量分别为：空白溶液进一针、对照品溶液进二针、样品溶液进二针，其中每针20μl；采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（5μm，4.6×250mm），柱温为30℃，流动相a为体积比为1:1000的三氟乙酸和水，流动相b为体积比为1:1000的三氟乙酸和乙腈，流速为1.0ml/min，并按照表3所示的条件进行梯度洗脱，紫外检测波长为260nm，色谱分析完成后，按面积归一化法计算其纯度。

表3梯度洗脱过程及条件

注：具体解释参照表1的注解。

步骤二：将arg(pbf)-oh、fmoc-arg-oh、fmoc-β-ala-oh、z-arg(pbf)-oh·cha、fmoc-β-ala-arg(pbf)-oh、fmoc-osu、fmoc-orn(fmoc)-oh、fmoc-orn(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-ome、fmoc-arg(pbf)-arg(pbf)-oh的对照品分别溶于乙腈中，得到浓度为1mg/ml的杂质溶液；

分别取各种杂质溶液2μl，各加入1ml样品溶液进行混合，得到多种混合溶液；分别取各种混合溶液2μl，并加入样品溶液1ml进行混合，得到总混合液。

步骤三：以乙腈为空白溶液，按照进样顺序为：空白溶液、样品溶液、各种混合溶液、总混合液依次进样，进行高效液相色谱检测。色谱条件同步骤一。

经上述方法，计算出各杂质的相对保留时间如表4所示，各物质的位置如图1所示。

表4各杂质的相对保留时间（rrt）

由表4和图1可知，本发明提供的fmoc-arg(pbf)-oh的纯度及杂质定位检测方法能够有效地对fmoc-arg(pbf)-oh中的杂质进行定位、分离，实现更精确的浓度分析，促进产品的质量控制及生产研发。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。