抗egfr单克隆抗体生物学活性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方 法。
【背景技术】
[0002] EGFR(表皮生长因子受体）是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通， 分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TGFa。激活后， EGFR由单体转化为二聚体，EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括Y992、 Y1045、Y1068、Y1148和Y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括 MPAK，Akt和JNK通路，诱导细胞增殖。抗EGFR单克隆抗体能竞争性与EGF结合EGFR，抑制 EGF的信号转导。
[0003] 基因工程药物的生物学活性与药效学基本一致，对其进行生物学活性检测，定量 其效价单位，是基因工程药物产品质量控制的重要组成部分，是保证产品药效的重要手段。 对生物学活性的定量越准确，对产品药效的控制就越有保障。生产出来的单抗产品的生物 学活性是蛋白质药物的重要质控指标，直接反映药品生物学效能的大小。根据产品的性质、 药效学特点，活性测定可分为生化酶促及免疫学方法、体内测定法、体外细胞培养测定法。
[0004] 生化酶促及免疫学方法（如ELISA)是一种不依赖活体系统的检测方法，被广泛采 用。ELISA实验中，抗原结合到固相载体表面，待检测抗体与抗原结合。二抗与某种酶连接 成酶标抗体，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，二抗加入到检 测体系中，与待测目标抗体结合，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中受检抗体 的量直接相关，根据颜色反应的深浅定性或定量分析。
[0005] 体内测定法就是利用动物体内某些指标的变化，定出产品的单位。体内测定法能 为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但检测过程通常相对不精确，并且费时、昂 贵、难操作。为获得可信的效价值，通常需要使用相当数量的动物。
[0006] 体外细胞培养测定法，就是利用产品对受试细胞的促进（或抑制）作用，通过检测 最终活细胞数量来定量产品的活性单位。
[0007] 抗EGFR单克隆抗体的生物学效能是通过与EGFR结合，将信号转导到受体的激酶， 其抗原决定簇与生物学活性部位不一致，不能通过其抗原决定簇与受体的结合直接反应生 物学活性的大小。而体外细胞培养法，误差置信范围大，精确度不高。在体外细胞抑制过程 中，会出现细胞被待检抗体抑制而未凋亡，检测结果使活性检测准确度欠佳。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种精确、有效的抗EGFR单克 隆抗体生物学活性检测方法。
[0009] 本发明提供了一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法，其步骤如下：
[0010] 1)A431细胞复苏、传代；
[0011] 2)准备96孔板单层A431细胞；
[0012] 3)样品和rhEGF的稀释：样品先稀释到0.12mg/ml，再以2倍梯度稀释7个浓度梯 度，稀释rhEGF到 100ng/ml;
[0013] 4)将样品的7个稀释梯度加入到铺有A431细胞的96孔板，每孔50y1;按每孔 50y1体积加入浓度为100ng/ml的rhEGF;细胞经以上处理后，放入37°C、5%C02培养60 分钟；
[0014] 5)弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入lOOyl4%甲醛固定15min;每孔 100y1TBS洗板 2 次；每孔加入 100y1 0? 1 %TritonX-100,孵育 15min;每孔 100y1TBS 洗板1次；每孔加入100u1 1 %H202，孵育15min;每孔100y1TBS洗板1次；每孔加入 100y1 2XBlockingbuffer，孵育 60min;
[0015] 6)弃去2XBlockingbuffer，每孔加入100y1 -抗稀释液；96孔板放入2-8°C孵 育过夜；弃去一抗稀释液，每孔100y1TBST洗板4次；每孔加入100y1二抗稀释液，避光 孵育60min;弃去二抗稀释液，每孔200y1TBST洗板3次；
[0016] 7)每孔加入100y1TMB(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺）显色底物，避光孵育 10-25min，或孵育至显蓝色到预期深浅；每孔加入100y1 2mol/LH2S04，终止显色；
[0017] 8) 96孔板放入读板机，检测A450nm和A650nm下读数。
[0018] 根据本发明的方法，优选地，步骤1)中，复苏一管A431细胞，900rpm离心5分钟， 移除上清，加l〇ml生长培养基重悬移至T175培养瓶，补加20ml生长培养基，放入37°C、5% C02培养。
[0019] 根据本发明的方法，优选地，步骤1)中，A431细胞的传代操作为：培养3天后，移 除培养瓶中的细胞，加5ml0. 25%胰酶-EDTA，轻轻晃动使液体浸没细胞，倒掉胰酶，将细 胞放入37°C培养箱消化5分钟，加入20ml生长培养基终止消化，重悬后取细胞计数，按1:3 比例对细胞进行传代。
[0020] 根据本发明的方法，优选地，步骤2)中，用维持培养基稀释细胞密度到 2X105cells/ml，将A431细胞铺板在96孔板，每孔150y1，37°C、5%C02培养24小时。
[0021] 优选地，所述的生长培养基为RPMI1640添加10%FBS。
[0022] 优选地，所述的维持培养基为RPMI1640添加0. 5%FBS。
[0023] 优选地，所述的一抗稀释液为abeam32430,稀释1000倍。
[0024] 优选地，所述的二抗稀释液为abeam6721，稀释20000倍。
[0025] 本发明的方法为基于细胞学的ELISA方法，能够有效、精确地检测抗EGFR单克隆 抗体生物学活性。
【附图说明】
[0026] 图1为使用本发明方法进行的三次实验的四参数曲线拟合图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的应用范围。除非特别指出，本发明所使用的各种试剂、原料、仪器均 可通过商业渠道购得。
[0028] 1、A431细胞的复苏
[0029]A431细胞购于ATCC，复苏一管A431细胞，900rpm离心5分钟，移除上清，加 10ml生长培养基（RPMI1640+10 %FBS)重悬移至T175培养瓶，补加20ml生长培养基 (RPMI1640+10%FBS)，放入 37°C、5% (体积浓度）C02培养。
[0030] 2、A431细胞的传代
[0031] 培养3天后，移除培养瓶中的细胞，加5ml0.25 %胰酶-EDTA，轻轻晃动使 液体浸没细胞，倒掉胰酶，将细胞放入37 °C培养箱消化5分钟，加入20ml生长培养基 (RPMI1640+10%FBS)终止消化，重悬后取细胞计数。按1:3比例对细胞进行传代。
[0032] 3、96孔板单层A431细胞的准备
[0033] 培养3天后，移除培养瓶中的细胞，加5ml0.25 %胰酶-EDTA，轻轻晃动使 液体浸没细胞，倒掉胰酶，将细胞放入37 °C培养箱消化5分钟，加入20ml维持培养基 (RPMI1640+0. 5%FBS)终止消化，重悬后取细胞计数。用维持培养基（RPMI1640+0