分析标记的制作方法
【专利说明】分析标记
[0001] 本发明涉及分析标记，具体地讲，涉及基于免疫分析法中所用的碳粒子的分析标 记。
[0002] 多个分析系统使用碳粒子作为检测缀合物（或标记）。一个这样的例子是使用眼 睛可见的碳粒子的侧向流动条。另一个例子是在WO 2004/090512中所述的分析系统，该系 统使用具有热电/压电换能器的装置以用于检测在分析过程中通过照明标记所产生的热。 碳粒子非常适合该系统，因为在一定的波长范围内，包括光谱的紫外、可见和红外部分，碳 粒子是电磁辐射的强吸收剂。另外，碳粒子不是特别质量致密的，所以它们能够很好地悬浮 在样品中并且不会过度沉淀，过度沉淀会在使用热电/压电换能器的分析系统中引起干涉 作用。
[0003] 通常认为粒子碳具有可吸收疏水性材料的"活性"表面。例如，活性炭用于抽油烟 机中的过滤器中，并且碳粒子用于纯化化学反应混合物。在后一种情况中，通常通过添加 吸收杂质的活性炭来从反应容器中移除聚合物杂质和/或疏水性杂质。然后通过过滤移除 炭。
[0004] 因此，碳粒子已在分析中使用了一段时间，不是作为标记，而是作为移除过量的不 需要的试剂的方法。具体地讲，碳粒子已用于从竞争免疫分析中移除过量的放射性标记的 试剂（例如，胰岛素、叶酸、游离的T3、游离的T4)。碳粒子的这种用途在US 3,442,819、US 4, 028, 465 以及 N. Poznanski 和 W. J. Poznanski，Clin. Chem.(《临床化学》），1969 年，第 15卷，第908-918页中有所描述。在该技术应用中，竞争反应在溶液中在放射性标记的小 分子和内源性小分子之间进行，在该反应中这些分子竞争结合到固定数量的抗体。然后通 过添加已预先用葡聚糖（或其他高分子）处理过的碳粒子来移除未接合到抗体的小分子部 分。葡聚糖允许小分子而不是大分子穿过并结合到碳，所以碳-葡聚糖移除未结合的小分 子，而不是结合到抗体的小分子部分。然后过滤碳-葡聚糖，并且通过测量剩余溶液的放射 性来对结合试剂进行定量。
[0005] 这些文献向读者提出了碳粒子对疏水性小分子具有比其对葡聚糖更大的亲和力。 用于将小分子附接到胶态标记的常用方法是，首先将小分子共价附接到较大的载体（诸如 大分子），然后将缀合物附接到标记，即通过被动吸附。然而，如果制备了具有疏水性小分子 的葡聚糖的共价缀合物，则可期待通过将小分子附接到碳而将缀合物结合到碳。因此，这似 乎不是制备小分子的碳缀合物的好方法，因为小分子可能是不可获得的。
[0006] 在文献中存在描述使用抗体涂覆的碳粒子作为分析标记的例子。例如，US 4, 760, 030描述了将抗体被动吸附到碳粒子上。然而，在US 4, 760, 030中粒子需要用氨基 酸稳定，以将抗体涂覆到粒子上。还有一些参考了印度墨汁（India-ink)分析（也称为Geek 分析），其为碳粒子和抗体同时混合的凝集分析，并且在存在分析物的情况下发生凝集。另 夕卜，需要稳定剂以形成碳胶体。
[0007] US 5, 252, 496、US 5, 559, 041和US 6, 506, 612也描述了结合到碳粒子的抗体。这 些专利使用Vulcan XC72碳粒子，其必须是稳定的以在水中形成胶体。这些专利描述了使 用2%葡聚糖9, 400作为稳定剂。US 5, 252, 496的栏13中的实例7描述了将单克隆抗体 固定至碳。概括地说，碳粒子在具有2%葡聚糖的缓冲液中均匀分布，葡聚糖被描述为"悬 浮助剂"。2小时后加入荧光素异硫氰酸酯（FITC)并且将该悬浮液温育12小时，然后在加 入抗体之前洗涤若干次，然后进一步洗涤，并且将胶体储存在适当的储存缓冲液中。
[0008] 抗体附接至粒子的机理尚不完全清楚。首先，FITC仅具有一个化学反应官能团， 并因此不是交联剂，所以不存在FITC可将抗体共价连接到葡聚糖的预期机理。其次，异硫 氰酸酯通常用于与胺类反应（以产生硫脲），但也可与醇类反应（以产生硫代氨基甲酸酯） 或被水解为胺。给定12小时的温育时间，FITC将与葡聚糖上的羟基反应或被水解。看起 来所提出的结合机理是FITC以某种方式结合到葡聚糖碳的表面。不期望荧光素结合到葡 聚糖，所以这意味着FITC结合（被动吸附）至碳自身的表面上。然后异硫氰酸酯基团不可 用于结合至抗体上的赖氨酸基团（胺）。
[0009] US 6, 506, 612还描述了粘合剂通过交联剂共价结合至碳粒子表面上的初级被动 吸附层的方法。第8栏第35-60行描述了此类共价连接，其中被动吸附层总是蛋白质。因 此，US6, 506, 612提出，葡聚糖可首先用于稳定碳胶体，但其最终将会被小分子（诸如FITC) 或蛋白质分子（诸如BSA、抗生物素蛋白或抗体）替代，小分子或蛋白质分子将比葡聚糖更 强力地结合到碳。US 6, 506, 612还描述了在将抗体涂覆到碳上之前用FITC预处理抗体的 方法，其作用可能是添加FITC基团到抗体使得抗体更疏水，并因此更强力地结合到碳。
[0010] US 5,529,901和US 5,641，689描述了选择碳粒子的类型（得自德固赛公司 (Degussa)的SB4)的方法，所述碳粒子将在不添加稳定剂（诸如葡聚糖、PEG、甘氨酸等）的 情况下在水中形成胶体。它们还描述了选择SB4(和类似粒子）以用于结合至分析物的结 合组分（例如抗体）的直接共轭结合。因此这些专利提出了不使用葡聚糖作为稳定剂。事 实上，它们将使用葡聚糖以稳定粒子描述为不必要的步骤，其可通过具体使用这些粒子而 移除。
[0011] 使用被动吸附方法来共轭结合通常用于分析中的碳粒子，参见US 5, 529, 901 和US 5,641，689。该方法对于某些类型的碳具有特异性，特别是来自德固赛赢创公司 (Degussa/Evo nik)的 Spezial Schwartz 4(SB4)(平均尺寸为 100-200nm 的无定形碳粒 子），其在不存在任何稳定剂的情况下在水中形成稳定的胶体。作为另外一种选择，大多数 其他碳粒子需要稳定剂，诸如洗涤剂或大分子（例如葡聚糖、PEG、甘氨酸等）。被动吸附方 法适用于大多数基于抗体的分析，但应当指出的是，大部分抗体在被动吸附期间失去活性， 因为抗体在结合到表面时会变性（这与抗体被动吸附至微量滴定板的表面时发生的情况 类似）。可用的经验方法是大约10%的被动吸附抗体将是活性的，剩余的90%为非活性的， 这主要是因为抗体的变性。
[0012] 对于需要非常高的灵敏度的分析而言，在碳粒子上具有较高的抗体负载是有益 的，其可能需要另选的途径来被动吸附。较高的抗体负载驱动抗体-抗原交互作用的热力 学平衡。每个粒子较高的抗体负载是优选的，而不是简单地添加更多的粒子，使得系统不会 负载过多的粒子（从而导致非特异性结合）。另外，被动吸附抗体靠近碳的表面，这可使抗 体完全空间受阻。就减少空间位阻而言，使抗体远离碳的表面可能是有益的。最后，使抗体 被动吸附到碳上导致抗体的变性，这可潜在地促进非特异性结合。
[0013] 在免疫性（也称为夹心或试剂-过量）免疫分析中，如在W0 2004/090512中所述， 抗体（或类似试剂）位于传感器上，而另一种抗体在碳粒子上。然后，在存在待测分析物的 情况下，碳粒子结合到传感器。两种抗体均以大量过量的方式存在。
[0014] 在竞争分析中，存在（a)抗体在碳粒子上而分析物的类似物（即小分子）在传感 器上，或（b)类似物（即小分子）在碳粒子上而抗体在传感器上。结合在不存在分析物的 情况下发生，并且在存在分析物的情况下受到干扰（减少）。
[0015] 术语"小分子"为免疫分析领域中的技术术语，它用于区分可在夹心分析中被测量 的分子和那些不能被测量的分子。为了在夹心分析中进行测量，分子必须足够大以具有两 个或更多个可分辨的表位（抗体结合位点），使得两个抗体可同时结合至分子，使得分子可 夹在捕获抗体和报告（或标记）抗体之间。如果分子不能形成夹心，则其就落入"小"分子 的类别。分子量截留值为约2, 000-5, 000。
[0016] 在实施竞争分析时，另外的要求是对系统中各种组分的水平具有更大的控制。对 结合至碳的抗体，当使用被动吸附时更难以控制活性抗体的量。在竞争分析的替代形式中， 其是必须结合到碳粒子的表面的小分子类似物。对于小分子来说这通常是不可能的；因为 小分子太小，它们将不能吸附到表面，或者如果小分子吸附到表面，它们不能被抗体识别。 因此，小分子通常共轭结合至较大的载体（诸如蛋白质），然后载体结合到所关注的例如碳 粒子的表面。
[0017] 然而，现已发现，难以通过传统途径制备小分子-碳缀合物，传统途径将其共价附 接至蛋白质分子（例如2-巨球蛋白、脱铁铁蛋白、0 -半乳糖苷酶、0 -淀粉酶、胶原（绵羊 的）、伴刀豆球蛋白A、钥孔虫戚血兰素、肌球蛋白、脲酶、人甲状腺球蛋白、猪甲状腺球蛋白 和牛甲状腺球蛋白）并随后将这些蛋白质结合至碳粒子的表面。这可能是因为小分子是特 别疏水的（例如，类固醇、荧