r>[0012] (3)用步骤（2)测得的腐胺与酰化腐胺浓度的比值进行聚类分析。
[0013] 如果最终能够聚为一类，则可评估待测人患肝癌风险大。聚类分析方法优选SPSS 软件(版本19. 0)中的系统聚类分析方法。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例3中去除异常值数据后，以肝癌患者于健康人尿液中腐胺与酰化腐 胺
[0015] 浓度比值为指标的聚类谱系图。结果表明以腐胺与酰化腐胺浓度的比值为
[0016] 指标可以将肝癌患者与健康人区分开来。（图中HU01-HU50为健康人数据，
[0017] 其中异常值去除了 HU14, HU35, HU43, HU44 与 HU45 ;⑶01-GU50 为肝
[0018] 癌患者数据，其中异常值去除了⑶05,⑶30,⑶39,⑶40,⑶45与⑶50)。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1肝癌与健康人尿液样品收集方法
[0020] 收集经病理细胞学证实为肝癌患者50例，其中男性30例，女性20例，年龄45-77 岁，平均57岁。对照组50例，均为健康成年人，采用血常规，尿常规等常规检验证实，其 中男性30例，女性20例，年龄27-65岁，平均52岁。采集肝癌患者及正常人晨尿。尿样 收集后于超低温冰箱中低于-80°C冷冻保存。
[0021] 取尿液样品 250μL于EP管中，加入50μL加入血的甲醇：水（20:80，v:v)混合溶 液和50 μ L溶液内标溶液（1，6-己二胺，100ng/mL)，涡旋30s。加入含0. 1%乙酸的甲醇溶液 后涡旋5min，15000r/min离心3min，取上清液于空气流下吹干，以50 μ L含0. 05%七氟丁酸 甲醇溶液-含0.05%七氟丁酸水溶液（20:80, v/v)复溶。取5μ L上清液用于UHPLC-MS/ MS分析。
[0022] 实施例2肝癌与健康人尿液中多胺类物质检测方法
[0023] 对实施例1制得的5 μ L上清液进行UHPLC-MS/MS分析，检测条件如下：
[0024] (1)试剂
[0025] 标准物质1，3-丙二胺，腐胺，尸胺盐酸盐，精脒盐酸盐，精胺盐酸盐，胍丁胺硫酸 盐，酰化腐胺盐酸盐，酰化精脒盐酸盐，酰化精胺盐酸盐，鸟氨酸盐酸盐，赖氨酸，精氨酸， S-腺苷蛋氨酸，七氟丁酸均为Sigma公司产品。HPLC级甲醇为Fisher公司产品，其它化学 试剂仅为分析纯，水为去离子重蒸水。
[0026] (2)仪器
[0027] Prominence UFLC XR型超快速高分离液相色谱仪配有LC-20AD输液泵、SIL-20AC 自动进样器、CT0-20AC柱温箱和D⑶-20A3脱气机（日本岛津株式会社）；API4000型三重四 极杆串联质谱仪(美国ABSCIEX公司）和AnalystL 5. 1数据处理系统；AB135-S电子天平 (瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；超声波发生器(浙江象山石浦海天电子仪器厂）；液 体快速混合器(上海医科大学仪器厂）；HC-2516高速离心机(科大创新股份有限公司）。
[0028] (3)色谱条件
[0029] 米用岛津公司 XRLC-20AD Prominence? UFLC 系列仪器，色谱柱：Shim-pack XR-ODS 色谱柱（75mm X 3. 0mm，2. 2 μ m)，流动相：以 0. 05% 七氟丁酸水溶液（A) -0. 05% 七氟丁酸甲醇⑶梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0.01-2. 00min，20%B ;2. 01-4. OOmin， 20%B - 50%Β ;4· 01 - 6. OOmin，50%Β ;6· 01 - 9. OOmin，20%B。流速：0· 4mL/min;柱温：40°C ; 进样量：5 μ L。
[0030] (4)质谱条件
[0031] 采用AB公司QTRAPTM4000MS/MS系列质谱仪。离子源：ESI;检测模式：正离子模 式；扫描模式：多反应离子监测（MRM。源温度500°C ;气帘气(氮气)压力138kPa(20psi); 雾化气压力276kPa (40psi);涡轮气压力276kPa (40psi);离子喷雾电压5500V;各待测 物离子源参数与定量分析方法如表一所示，扫描时间为200ms。以所建立的方法测定50例 肝癌患者中多胺代谢轮廓中各待测物的含量，每一样品测试一次。根据标准曲线，计算尿液 样品中各待测物浓度(详见表二)。
[0032] 表一多胺代谢物离子源参数与定量分析方法
【主权项】
1. 人尿液中腐胺和酰化腐胺作为肝癌诊断标记物的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于腐胺和酰化腐胺浓度的比值作为肝癌诊断标 记物的应用。
3. -种应用腐胺和酰化腐胺浓度的比值进行肝癌评估的方法，其步骤包括： (1) 分别收集已知肝癌患者和待评估人的尿液样本； (2) 分别检测肝癌患者和待评估人尿液样本中腐胺和酰化腐胺的浓度； (3) 用步骤（2)测得的腐胺和酰化腐胺浓度的比值进行聚类分析。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于聚类分析为SPSS软件(版本号19. 0)中的系 统聚类分析方法。
【专利摘要】本发明涉及用于评估肝癌症疾病的新生物标记物，提供了人尿液中腐胺和酰化腐胺作为肝癌诊断标记物的应用。腐胺和酰化腐胺浓度的比值作为肝癌诊断标记物的应用。一种应用腐胺和酰化腐胺浓度的比值进行肝癌评估的方法，其步骤包括：（1）分别收集已知肝癌患者和待评估人的尿液样本；（2）分别检测肝癌患者和待评估人尿液样本中腐胺和酰化腐胺的浓度；（3）用步骤（2）测得的腐胺和酰化腐胺浓度的比值进行聚类分析。聚类分析为SPSS软件（版本号19.0）中的系统聚类分析方法。可用于癌症的诊断、预后和疗效评价。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104678003
【申请号】CN201410090856
【发明人】李清, 毕开顺, 刘然, 毕文川, 何博赛, 贾英, 崔艳
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年3月12日